過江藤合成氧化銀在血液透析導(dǎo)管病菌培養(yǎng)中的抗菌活性

李汝芬 于風(fēng)葉 任 瑞 王 琳 宋向芹 鄧方方 紀(jì)象芹

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 濱州 256603

近年來，隨著各種原因引起腎功能衰竭患者的增加，血液透析已經(jīng)成為一種重要的治療手段。血管通路是血液透析病人必不可少的前提條件，雖然自體動靜脈內(nèi)瘺是其首選的血管通路，但由于血管條件差，無法建立內(nèi)瘺或等待內(nèi)瘺成熟期的病人，中心靜脈留置導(dǎo)管依然廣泛應(yīng)用于血液透析治療。感染是中心靜脈留置導(dǎo)管最常見的并發(fā)癥，可導(dǎo)致血液透析病人住院率增高和住院時(shí)間增加，影響病人的生活質(zhì)量和長期生存率；且導(dǎo)管相關(guān)血液源性感染是其較為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至可以導(dǎo)致患者死亡[1]。黃雨琴[2]指出：使用中心靜脈導(dǎo)管進(jìn)行血液透析的患者，導(dǎo)管相關(guān)感染的發(fā)生率超過15%，且隨著透析時(shí)間的延長，感染發(fā)生率越來越高。尿毒癥血液透析患者由于腎臟排泄功能的降低，藥物特別是抗生素的應(yīng)用更加控制嚴(yán)格，為防止中心靜脈導(dǎo)管感染，嚴(yán)格的無菌操作及導(dǎo)管護(hù)理用品的選擇尤為重要。楊勇勛等報(bào)道[3]植物藥過江藤具有較寬的抗炎、抗菌止痛等活性譜，可用于清熱解毒，散瘀消腫，跌打損傷；外用治癰疽疔毒，帶狀皰疹，慢性濕疹等病癥。銀化合物及其鹽類自20世紀(jì)60年代起就被用作燒傷及深度創(chuàng)面的治療用物及護(hù)理產(chǎn)品，且植物提取物合成Ag2O易獲得、安全無毒，具有植物成分化學(xué)性質(zhì)，輔助減少陰離子[4]，目前仍有銀化合物合成藥物用于臨床傷口的抗感染治療，Ag2O 納米粒子作為一種有效的抗菌藥物也已被廣泛研究和證實(shí)。研究證明：草藥抗菌素和金屬的開發(fā)有巨大潛能，能成功治療傳染性疾病，同時(shí)減少與抗生素使用相關(guān)的副作用[5]。本研究團(tuán)隊(duì)使用過江藤提取物綠色合成氧化銀粒子，在透析用中心靜脈置管病菌培養(yǎng)皿中測定其抗菌活性，旨在尋找一種天然有效，副作用小的透析用導(dǎo)管抗菌護(hù)理用品。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備 過江藤植物的干燥葉片,花期采摘，硝酸銀(分析級)溶液，高壓釜，F(xiàn)DV小型高速超細(xì)粉碎機(jī)，硅石坩堝，馬弗爐等。

1.2 過江藤植物粉末制作 選取過江藤植物的新鮮葉子，流動水清洗干凈，瀝干水分，放入高壓釜中對植物葉子進(jìn)行干燥。干燥后的葉片使用FDV小型高速超細(xì)粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，粉碎后粉末顆粒透射電鏡(TEM)分析直徑在5～10 μm之間，將粉碎粉末收集備用。

1.3 過江藤Ag2O粒子的合成 準(zhǔn)備好硝酸銀溶液(分析級)，將硝酸銀和過江藤葉子粉末按重量1∶1比例放入硅石坩堝，使用磁攪拌器充分?jǐn)嚢?～10 min，使其充分混勻。將混合物置于(600±10)℃預(yù)熱的馬弗爐中，中心部分最先出現(xiàn)反應(yīng)，火焰先出現(xiàn)在表面，然后快速充滿爐體，通過吸收劑結(jié)構(gòu)分離無色粉末，合成的Ag2O 通過X射線衍射和TEM分析顯示平均粒徑范圍為20 nm，符合氧化銀典型結(jié)構(gòu)。隨后將合成的Ag2O 用于透析用中心靜脈導(dǎo)管病菌培養(yǎng)的抗菌活性研究。

1.4 透析用中心靜脈導(dǎo)管病菌培養(yǎng) 選擇本醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用中心靜脈導(dǎo)管進(jìn)行血液透析患者30例，在導(dǎo)管護(hù)理前，用無菌棉簽蘸取0.9%無菌氯化鈉溶液擦拭導(dǎo)管植入口周圍皮膚，擦拭范圍直徑>15 cm，擦拭三次后待干。將浸有無菌生理鹽水采樣液的棉拭子一支在導(dǎo)管植入口周圍皮膚及導(dǎo)管距植入口1 cm處旋轉(zhuǎn)涂擦各兩次，并隨之轉(zhuǎn)動采樣棉拭子，無菌手術(shù)剪剪去手接觸部位；將棉拭子放入裝有10 mL采樣液的試管內(nèi)送微生物實(shí)驗(yàn)室行微生物培養(yǎng)[6]。30例患者中培養(yǎng)出6例患者3種菌，其中表皮葡萄球菌者2例，金黃色葡萄球菌者3例，黃曲霉菌者1例。

1.5 抗菌活性篩選方法 采用擴(kuò)散法測定抗菌活性[7]。將培養(yǎng)出的菌株分別接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其中表皮球菌和金黃色葡萄球菌菌株接種于血瓊脂平板培養(yǎng)基，黃曲霉菌菌株接種于沙保羅培養(yǎng)基。接種方法：用無菌棉拭蘸取菌液，在管內(nèi)壁液面上方旋轉(zhuǎn)緊壓，將多余菌液擠去，然后在培養(yǎng)基表面均勻涂布接種3次，每次旋轉(zhuǎn)平板60度以確保接種菌的均勻分布，最后沿平板內(nèi)緣涂抹一周，接種好的平板可敞開蓋子在室溫下干燥5 min。 采用二甲基亞砜(DMSO)溶解法分別制備過江藤粉末(0.1 mg/mL)和過江藤氧化銀(0.1 mg/mL)萃取物，然后將過江藤粉末、過江藤氧化銀、四環(huán)素、氟康唑及DMSO制備成直徑為0.5 cm的抗菌紙片，然后用浸滿藥液的紙片分別明確標(biāo)識后放入菌株培養(yǎng)基表面并輕壓，使紙片與培養(yǎng)基表面完全接觸。其中四環(huán)素(0.1 mg/mL)作為抗表皮球菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)對照，氟康唑(0.1 mg/mL)作為抗黃曲霉菌抗菌的標(biāo)準(zhǔn)對照，DMSO溶劑為空白對照。表皮球菌、金黃色葡萄球菌在35 ℃下培養(yǎng)24 h，黃曲霉菌培養(yǎng)皿在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h。每種菌株培養(yǎng)皿針對同種藥劑做30個(gè)培養(yǎng)皿，每皿測量抑菌區(qū)域直徑，以毫米計(jì)。培養(yǎng)結(jié)果聘請微生物實(shí)驗(yàn)室專業(yè)檢驗(yàn)師判定，抑菌圈直徑15 mm以上為高度敏感，10～14 mm為中度敏感，10 mm以下為低度敏感，0為不敏感[8]。

2 結(jié)果

通過分析培養(yǎng)皿抑菌圈表明：表皮球菌對四環(huán)素、過江藤、過江藤Ag2O均敏感，但對四環(huán)素敏感性更高；金黃色葡萄球菌對過江藤、過江藤合成Ag2O粒子敏感，對四環(huán)素不敏感；黃曲霉菌對氟康唑、過江藤合成Ag2O粒子、過江藤均敏感，前兩者抑菌結(jié)果無顯著差異，過江藤粉效果較前兩種藥劑效果略差。本實(shí)驗(yàn)將病菌對藥物敏感性作為藥物抗菌活性的判斷指標(biāo)。病菌對藥劑的敏感性結(jié)果見表1、表2。

表1 不同病菌對不同藥劑的敏感性對照表

表2 不同抗菌藥物的抗菌活性(抑菌區(qū)域直徑)/mm

3 討論

中藥過江藤有較好的抗菌活性，合成Ag2O抗菌活性明顯提高。通過抗菌活性實(shí)驗(yàn)得出，過江藤粉末對表皮球菌、金黃色葡萄球菌及黃曲霉菌均有抗菌活性。在合成Ag2O后，抗金黃色葡萄球菌和黃曲霉菌活性明顯提高，可能與銀離子協(xié)同作用有關(guān)。表皮球菌在無禁忌的情況下，首選四環(huán)素，過江藤和過江藤Ag2O顆粒可作為次選。在抗黃曲霉菌作用方面，氟康唑與過江藤Ag2O顆粒均可作為首選，過江藤粉末次選。

尿毒癥患者由于貧血、營養(yǎng)不良、機(jī)體免疫力低下等原因，極易發(fā)生各種感染。而腎小球?yàn)V過率的下降，影響了抗生素的代謝和清除。如果抗生素使用時(shí)間或用量不當(dāng)，極易出現(xiàn)抗生素腦病[9]。深靜脈置管作為急癥透析和動靜脈內(nèi)瘺準(zhǔn)備期間必不可少的血管通路，同時(shí)也是最易發(fā)生感染的血管通路。導(dǎo)管相關(guān)血液源性感染是其較為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，甚至導(dǎo)致患者死亡[1]。國外學(xué)者研究報(bào)道：金黃色葡萄球菌主要通過皮膚表面?zhèn)鞑?，由于靜脈留置導(dǎo)管破壞正常皮膚保護(hù)屏障，同時(shí)處于患者普遍處在較為危重的疾病進(jìn)程中，免疫功能相對低下，所以極易導(dǎo)致金黃色葡萄球侵入繁殖引發(fā)感染[10]。

在預(yù)防透析用中心靜脈置管感染的措施中，導(dǎo)管護(hù)理起到十分重要的作用。除嚴(yán)格執(zhí)行手衛(wèi)生和無菌操作之外，導(dǎo)管護(hù)理敷料選擇和抗生素軟膏的使用[11]也十分重要。由于抗生素使用的局限性，選擇安全、實(shí)用、副作用小、抗菌效果好的導(dǎo)管護(hù)理用材料成為本團(tuán)隊(duì)研究目標(biāo)。

草藥中含有的抗生素具有巨大的開發(fā)潛力，越來越多的中草藥抗生素成為醫(yī)藥人員的研究目標(biāo)。過江藤植物提取物合成的Ag2O 粒子能更有效地對抗對細(xì)菌性和真菌性病原體，且容易獲取、安全、副作用小。既可以有效防止細(xì)菌及真菌感染，又減少了抗生素使用相關(guān)副作用，適宜尿毒癥血液透析患者使用，因此在開發(fā)透析用中心靜脈置管護(hù)理用敷料方面具巨大的潛能。

本研究的不足之處是沒有將氧化銀單獨(dú)作為觀察藥劑進(jìn)行對比分析，此部分內(nèi)容將在下一步研究中進(jìn)行。