某雞場死亡雞胚中細菌的分離鑒定和藥敏試驗

王秋生

（江蘇省海安市畜牧獸醫(yī)站 226600）

在導(dǎo)致雞胚死亡的眾多原因中，細菌是常見原因之一，國內(nèi)外有不少因細菌感染而造成雞胚大量死亡的實例。研究表明，部分禽病如傳染性支氣管炎、雞傷寒、葡萄球菌病，這類禽病的病原菌或病毒傳遞給后代的主要途徑是侵害種禽卵巢，造成嚴重的危害。部分禽病如大腸桿菌病傳遞給后代的途徑有兩種，一是通過蛋殼，二是通過蛋內(nèi)。通過攜帶病原菌的糞便污染蛋殼，從而在孵化過程中造成不同程度的影響，另外可以引發(fā)一系列的禽類生殖器官方面的疾病，繼而可通過蛋傳遞，造成大批禽胚的死亡[1]。

為了搞清在孵化過程中導(dǎo)致雞胚死亡的細菌種類及其檢出率，需要對死亡雞胚進行細菌的分離與鑒定。2021 年3 月海安市某養(yǎng)雞場送檢的80 份死亡雞胚，經(jīng)實驗室診斷為細菌感染。本文對該病原菌進行了分離與鑒定，以及藥敏試驗等，從細菌方面去分析雞胚死亡的原因，為提高種蛋孵化率提供理論依據(jù)，以此提高經(jīng)濟效益[2]。

1 材料

1.1 病料

2021 年3 月海安市某養(yǎng)雞場送檢的80 份死亡雞胚。

1.2 藥品試劑和器材

1.2.1 藥品試劑

藥品試劑：乙醇、碘酊、福爾馬林溶液、生理鹽水、乙醚、6%α 萘酚乙醇溶液、40%氫氧化鉀溶液、革蘭氏染色試劑、甲基紅試劑、吲哚試劑、藥敏紙片。

培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)瓊脂平板、血液瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、EMB 平板、糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基。

1.2.2 器材

鑷子、剪刀、接種環(huán)、移液槍、托盤、廣口試劑瓶、眼科剪子、載玻片、蓋玻片、抗凝離心管，光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、PCR 儀、凝膠電泳儀、生物安全柜等。

1.3 引物

細菌的PCR 擴增中通用引物為27F 和1492R，如下。

引物27F：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。

引物1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。

擴增長度約為1400bp。

2 方法

2.1 病理剖檢

在送來的80 份死亡雞胚中隨機取樣，抽取20 只死亡雞胚進行剖檢，觀察尿囊液的變化和內(nèi)臟的病理變化，記錄結(jié)果。

2.2 細菌的分離培養(yǎng)

在超凈工作臺上，先用75%酒精對死亡雞胚進行消毒，然后用鑷子敲碎蛋殼一側(cè)，再用滅菌的眼科鑷子把殼膜撕開，扒出氣室。用鑷子將雞頭壓住，再操作移液槍吸取尿囊液，存放至抗凝離心管中。對從死亡雞胚中分離出的尿囊液材料采用平板劃線法進行分離培養(yǎng)，使用無菌接種環(huán)沾取少許液體在平板上連續(xù)劃線，經(jīng)過37℃下培養(yǎng)約24h 可得到單菌落，然后再分辨不同形態(tài)特征的單菌落，挑取后進行純培養(yǎng)。

從純培養(yǎng)的單菌落中挑取培養(yǎng)物進行革蘭氏染色試驗，觀察其形態(tài)及在培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性。

2.3 生化試驗

穿刺接種糖發(fā)酵試驗管、三糖鐵培養(yǎng)基。進行甲基紅試驗、吲哚試驗、VP 試驗。進行培養(yǎng)并記錄結(jié)果，判定標準可參照該公司操作方法與標準[3]。

2.4 溶血性試驗

從培養(yǎng)基中挑取不同分離菌的單個菌落接種至血平板上，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時間為24h，再觀察培養(yǎng)基中是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.5 16S rDNA 擴增和測序

將試驗中分離到的細菌依照細菌基因組DNA 提取試劑盒的說明書制備DNA 模板，采用通用引物擴增出細菌16S rRNA序列，再將目的片段進行切膠純化后送生物公司進行測序，測序后將其結(jié)果與BLAST 和GenBank 公布的序列進行比對分析，鑒定細菌種屬。

若測得的序列與基因庫中細菌的比對同源性達到97%以上則可認為是同一種細菌。

2.6 藥敏試驗

采用紙片擴散法。

3 結(jié)果

3.1 剖檢變化

部分死亡雞胚剖檢結(jié)果為卵黃囊發(fā)炎，卵黃有吸收不良現(xiàn)象，大部分有黃綠色干酪樣物質(zhì)。部分死亡雞胚剖檢可觀察到機體消瘦和關(guān)節(jié)局部化膿的現(xiàn)象[4]。

3.2 細菌的分離培養(yǎng)

從送檢雞胚尿囊液中分離細菌，于血平板上培養(yǎng)24h 后，結(jié)果共分離到7 種細菌，本試驗中分別命名為B1～B9，將分離到的細菌進行純培養(yǎng)。

3.3 細菌形態(tài)學(xué)觀察

37℃培養(yǎng)24h 后顯示，B1在平板上形成比較大的白色或略帶一些灰色的表面光滑、濕潤的大菌落，大部分呈不透明狀，少部分邊緣少許透明，B2、B4在平板上形成圓形凸起狀、表面光滑濕潤的菌落，邊緣整齊，不透明，B3、B9在平板上形成圓形凸起狀、露珠狀的菌落，B5、B6在平板上形成圓形、表面光滑的黃色菌落，不透明，B7在平板上形成圓形凸起狀、表面光滑濕潤的白色露滴狀菌落，呈半透明狀態(tài)，B8在平板上形成圓形、表面光滑的灰色菌落，直徑約為1mm 左右。

挑取B1～B9單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果顯示：B1、B3和B9為革蘭氏染色陰性桿菌，B1菌體呈兩端鈍圓狀，多數(shù)為單個散在或者成對存在，偶爾有2～3 個菌體相連，菌體直徑約為0.4～2.0μm。B3、B9為革蘭氏陰性小桿菌，菌體呈單個散在、成對存在或絲狀存在，菌體直徑約為0.2～0.4μm×1～5μm，無芽孢，不運動；B2、B4、B5、B6、B7和B8為革蘭氏染色陽性菌，B2、B4、B5和B6菌體呈球形或橢圓形，排列成葡萄狀，菌體直徑約1.0μm，無芽孢，無鞭毛，B7為革蘭陽性短桿狀或球桿狀，排列不規(guī)則，B8 為革蘭氏陽性球菌，呈四聯(lián)、成團塊狀排列，也有單個成雙排列。

3.4 溶血試驗結(jié)果

B1出現(xiàn)明顯溶血現(xiàn)象，B2、B4出現(xiàn)明顯的β 溶血現(xiàn)象，B3、B9無溶血現(xiàn)象，B5、B6在血培養(yǎng)基上出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，B7不溶血，B8 出現(xiàn)α 溶血現(xiàn)象。

3.5 生化鑒定結(jié)果

結(jié)果見表1。

表1 生化試驗結(jié)果

3.6 16S rDNA 的序列分析

對16S rDNA 引物進行PCR 反應(yīng)，電泳結(jié)果顯示擴增出與預(yù)期大小相符合的條帶。目的片段送至公司測序，結(jié)果鑒定出B1為大腸埃希菌，B2為腐生葡萄球菌，B3為鴨疫里默氏桿菌，B4為葡萄球菌，B5為松鼠葡萄球菌，B6為松鼠葡萄球菌，B7為棒狀桿菌，B8為氣球菌，B9為鴨疫里默氏桿菌。

3.7 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果見表2 及表3。

表3 G+分離菌藥敏試驗結(jié)果

4 小結(jié)與討論

本試驗通過分離培養(yǎng)和染色鏡檢觀察細菌形態(tài)，并將分離到的細菌進行生化試驗。通過16srRNA 方法對分離所得的細菌進行鑒定，經(jīng)鑒定分別為大腸埃希菌、腐生葡萄球菌、鴨疫里默氏桿菌、葡萄球菌、松鼠葡萄球菌、棒狀桿菌、氣球菌。可以確定該批雞胚的死亡與感染細菌有很大關(guān)系。

4.1 對生化試驗和溶血試驗等結(jié)果的討論

此次分離得的7 種細菌生化試驗結(jié)果如上文結(jié)果所示，基本與各菌的生化特性相符合。另外，大部分分離菌在血平板上出現(xiàn)了明顯的溶血現(xiàn)象，這說明分離所得的大腸埃希菌、葡萄球菌、氣球菌具有一定的致病性。

4.2 對藥敏試驗結(jié)果的討論

由藥敏試驗結(jié)果表可知，從死亡雞胚中分離到的7 種細菌在不同抗生素藥物作用下的藥敏試驗數(shù)據(jù)能有效篩選出適合防治細菌感染病的藥物[5]。

4.3 對防治雞胚感染細菌的建議

在研究和生產(chǎn)實踐中表明，本試驗在死亡雞胚中分離所得的大腸桿菌、葡萄球菌、鴨疫里默氏菌等均是影響雞胚發(fā)育的常見病原菌，棒狀桿菌和氣球菌則比較少見，提醒人們在防治雞病過程中應(yīng)注意到可能會存在一些不常見細菌的混合感染。此次分離的不少菌株是條件性致病菌，與雞群的免疫力也有著密切的聯(lián)系。對細菌造成的雞胚疾病的防治重點在于，因為細菌感染雞胚從而影響雞胚發(fā)育生長的途徑主要有兩種，一是母體垂直傳播感染，二是受外界環(huán)境污染所致，所以要預(yù)防細菌感染雞胚也要從兩個方面采取措施，一是預(yù)防種雞感染細菌，二是減少雞胚受環(huán)境污染[6]。

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果可有效篩選適合用于防治這些細菌感染病的抗生素。不過在使用抗生素藥物時也要考慮細菌耐藥性，尤其是極易產(chǎn)生耐藥性的大腸桿菌，應(yīng)更加嚴謹合理地選擇用藥，避免濫用抗生素，減少細菌耐藥性的產(chǎn)生，同時還要注意按時按量用藥及交替用藥，最大程度的降低養(yǎng)殖戶的損失。在本次試驗中，重點觀察本次分離所得的松鼠葡萄球菌對本次藥敏試驗所用的藥物均不敏感，需進行更多的試驗尋找能對其產(chǎn)生抑制作用的藥物[7]。

除了采取藥物措施外，還應(yīng)加強飼養(yǎng)管理方面問題，提供良好的禽舍環(huán)境，避免不良應(yīng)激因素對雞群造成的影響，同時需經(jīng)常對環(huán)境進行消毒防疫，保證雞群生長環(huán)境的衛(wèi)生。這樣才能增強雞群自身的免疫力，減少條件性致病菌引發(fā)疾病的概率[8]。

總之，本試驗從80 份死亡雞胚中成功分離鑒定出7 種細菌，為查明該雞場雞胚死亡的主要因素是細菌性感染提供了試驗依據(jù)，藥敏試驗研究結(jié)果為該雞場對細菌性疾病的防治用藥提供了數(shù)據(jù)支持。此外，這7 種細菌中的一些分離菌對雞的致病能力還存在未知部分，需要通過更多的試驗去深入研究。