人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3、zeste基因增強子同源物2蛋白表達與局部進展期直腸癌新輔助化療敏感性的關(guān)系

袁澤龍，武雪亮，屈 明，薛 軍，韓 磊，孫光源

河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1介入科 2普通外科，河北張家口 075000

Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(runt-related transcription factor 3，RUNX3)是一種抑癌基因，屬于轉(zhuǎn)錄因子runt域家族，在主要發(fā)育通路中作為基因表達的主調(diào)控因子，定位在人染色體lp36.1上，由6個外顯子、2個啟動子以及1個開放閱讀框構(gòu)成，在細胞的生長、發(fā)育、生物學(xué)效應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及凋亡等方面發(fā)揮著重要作用，由Bangsow等[1]首先發(fā)現(xiàn)。近年研究顯示，RUNX3基因直腸癌中存在異常表達，且其低表達常與腫瘤的惡行生物學(xué)行為及不良預(yù)后有關(guān)[2]。果蠅zeste基因增強子人類同源物2基因(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)是多梳基因家族中的核心成員。EZH2基因定位于人染色體7q35上，覆蓋近40 kb，包含20個外顯子、19個內(nèi)含子，外顯子長度為41～323 bp，內(nèi)含子長度為0.15～17.7 kb，在細胞增殖、分化及腫瘤形成方面均有重要作用[3]。有研究表明直腸癌中RUNX3的沉默與EZH2有關(guān)[4]，接受新輔助化療后患者癌組織中的RUNX3表達下降[5]。因此，本研究旨在探討RUNX3和EZH2在直腸癌中表達的相關(guān)性及其與新輔助化療敏感性的關(guān)系，為局部進展期直腸癌患者治療方案的決策提供參考。

資料和方法

病例資料1收集2019年1月至2020年1月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療的直腸癌手術(shù)患者共31例，取患者手術(shù)切除標(biāo)本腫瘤中心組織和腫瘤遠端距腫瘤大于5 cm的正常腸組織，分別定義為癌組和癌旁組。

入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)本院活檢病理或病理會診診斷為直腸癌，病理類型為腺癌；(2)術(shù)前經(jīng)電子腸鏡確認腫瘤為單發(fā)，經(jīng)盆腔核磁共振成像及胸+腹部+盆腔增強CT等輔助檢查明確無遠處轉(zhuǎn)移；(3)術(shù)前未經(jīng)抗腫瘤治療；(4)行開腹或腹腔鏡直腸癌全系膜切除術(shù)(total mesorectal excision，TME)，術(shù)程順利。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在遠處轉(zhuǎn)移；(2)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤史；(3)既往接受過腫瘤相關(guān)治療；(4)患者拒絕手術(shù)或因各種原因更改手術(shù)方案；(5)拒絕參與研究者。

病例資料2選取2018年9月至2020年6月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的術(shù)前經(jīng)新輔助化療的中低位進展期直腸癌患者29例，取患者新輔助治療前活檢蠟塊和手術(shù)后病理蠟塊，分別定義為治療前組和治療后組。

入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受新輔助治療前1個月內(nèi)經(jīng)本院病理活檢確診為直腸腺癌；(2)術(shù)前經(jīng)電子腸鏡確認腫瘤為單發(fā)，經(jīng)盆腔核磁共振成像及胸+腹部+盆腔增強CT檢查明確無遠處轉(zhuǎn)移；(3)新輔助治療前活檢病理切片及蠟塊等病理資料完整；(4)根據(jù)2016年美國癌癥聯(lián)合委員會腫瘤分期第八版標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)術(shù)前影像學(xué)評價腫瘤臨床分期為T3～T4和/或N陽性[6]；(5)完成3周期新輔助化療：XELOX方案(奧沙利鉑130 mg/m2，1 d；卡培他濱2000 mg/m2，1～14 d，3周為1周期)；(6)新輔助化療結(jié)束3～4周后行TME手術(shù)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在遠處轉(zhuǎn)移；(2)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤史；(3)既往接受過抗腫瘤治療；(4)因各種原因未完成新輔助化療、化療后更改治療方案或至其他醫(yī)院接受手術(shù)；(5)拒絕參與研究者。

所有入組患者均知情同意，本課題經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會審核通過。

主要試劑微量總RNA提取試劑盒(TR150- 50)購于北京天漠科技開發(fā)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RX20402)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；qPCR試劑盒(RX21203)購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；兔抗人RUNX3單克隆抗體(EPR20687)購于英國Abcam公司；兔抗人EZH2單克隆抗體(EPR9307- 2)購于英國Abcam公司；二步法SP通用試劑盒(SP- 9001)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒(ZLI- 9018)購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蘇木素染液(BA- 4025- 1)購于珠海貝素生物技術(shù)有限公司。

新輔助化療治療前組和治療后組患者接受術(shù)前全身化療共3個周期，采用XELOX方案，具體為：奧沙利鉑130 mg/m2，首日靜脈輸注；卡培他濱2000 mg/m2，1～14 日口服，14～21日間歇，每3周為1周期，3周期化療完成后間隔3～4周行手術(shù)治療[7]。

手術(shù)方式及標(biāo)本采集各組患者均由同一手術(shù)團隊行TME手術(shù)，具體術(shù)式根據(jù)患者腫瘤距肛緣位置選擇Dixon手術(shù)或Miles手術(shù)；癌組及癌旁組在手術(shù)標(biāo)本離體30 min內(nèi)，取癌灶中心非壞死區(qū)域及距離腫瘤5 cm以上正常腸組織各200 mg于液氮中保存，用于實時熒光定量PCR，取材后手術(shù)標(biāo)本由組織固定液浸泡并送至病理科由同一病理醫(yī)師進行標(biāo)準(zhǔn)病理取材和蠟塊制備；治療前組及治療后組手術(shù)方式及手術(shù)團隊與上述相同，手術(shù)標(biāo)本離體后立即由組織固定液浸泡并送至病理科進行蠟塊制備。

實時熒光定量PCR法檢測癌組、癌旁組RUNX3和EZH2 mRNA的表達取直腸癌及癌旁組織各5 mg，徹底勻漿，提取總RNA，測定RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成模板DNA；引物設(shè)計RUNX3上游引物：5’-TCAACG- ACCTTCGCTTCGTG- 3’，下游引物5’-CACGGTCACCT-TGATGGCTC- 3’；EZH2上游引物：5’-AGCGGATAAA-GACCCCACCAAAAC- 3’，下游引物：5’-TCCCTGCTTCC-CTACCACTGTCTG- 3’；GAPDH上游引物：5’-CGGAT-TTGGTCGTATTGGG- 3’，下游引物：5’-CTGGAAGATG-GTGATGGGATT- 3’；20 μl反應(yīng)體系：實時熒光定量PCR預(yù)混液10 μl、模板DNA 2 μl、上、下游引物各0.4 μl及無RNA酶水7.2 μl；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃ 5 s并60 ℃ 30 s預(yù)循環(huán)5次，95 ℃ 5 s并60 ℃ 30 s末讀熒光循環(huán)40次；每組織取3個樣本，每樣本設(shè)置3個復(fù)孔重復(fù)實驗，溶解曲線為單峰，存在典型S型擴增曲線為循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)有意義；采用ΔΔCt相對定量法分析結(jié)果，mRNA相對表達量用2-ΔΔCt表示。

免疫組織化學(xué)檢測癌組、癌旁組、治療前組和治療后組RUNX3和EZH2蛋白的表達各組石蠟標(biāo)本依次進行4 μm切片、脫蠟及水化，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3 min×3次，細胞通透后PBS沖洗3 min×3次，內(nèi)源性過氧化物酶封閉，PBS沖洗3 min×3次，抗原修復(fù)冷卻至室溫，血清封閉37 ℃孵育10 min，滴加一抗4 ℃孵育12 h，PBS沖洗3 min×3次，滴加二抗37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，滴加辣根過氧化物酶室溫孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次，DAB顯色室溫孵育(RUNX3 3.5 min，EZH2 5 min)，蘇木素復(fù)染，鹽酸-乙醇分化，脫水，透明，封片，觀察。

RUNX3和EZH2均定位于細胞核中，二者陽性表達為棕黃色或棕褐色，所有切片均由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科相同兩名副高級職稱以上醫(yī)師閱片：兩位觀察者在高倍鏡下共同隨機選取5個視野同時觀察，分別評估染色程度與染色細胞比例，具體標(biāo)準(zhǔn)如下：染色程度：不染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分；染色細胞比例：≤5%為0分，>5%且≤25%為1分，>25%且≤50%為2分，>50%為3分。上述二項得分相乘，≤3分為陰性，>3分為陽性。

腫瘤縮退學(xué)評估由兩位具有副高級以上職稱的病理科醫(yī)師進行病理評估，兩位醫(yī)師事先對患者一般資料一無所知。腫瘤消退反應(yīng)根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會腫瘤退化分級(tumor regression grade，TRG)系統(tǒng)[6]評估，具體如下：TRG0級：完全反應(yīng)，腫瘤完全消退，無癌細胞殘留；TRG1級：腫瘤中度消退，僅剩少量鏡下癌灶；TRG2級：腫瘤輕度消退，可見殘留癌細胞，但仍以纖維化為主要改變；TRG3級：腫瘤消退不良，殘留大量腫瘤細胞伴極少或無纖維化，以TRG0～TRG2為新輔助化療療效好。

統(tǒng)計學(xué)處理所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 25.0軟件進行。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)性檢驗采用夏皮洛-威爾克檢驗(Shapiro-Wilk test)，對不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用非參數(shù)檢驗(Wilcoxon符號秩檢驗)分析；計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較n>40采用卡方檢驗，n≤40采用Fisher確切概率法；多因素Logistic回歸分析影響新輔助化療療效的因素，相關(guān)性采用斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)系數(shù)法分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

RUNX3和EZH2 mRNA在癌組和癌旁組中的表達癌組RUNX3 mRNA的平均相對表達量為3.04±1.12，癌旁組中為7.78±2.11；癌組中EZH2 mRNA的平均相對表達量為1.70±0.56，癌旁組中為1.27±0.52，各組數(shù)據(jù)均不符合正態(tài)分布(W=0.928，P=0.039)，癌組和癌旁組相比，RUNX3和EZH2 的mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。將癌組RUNX3和EZH2 mRNA相對表達量繪制散點圖，可見二者呈負相關(guān)(r=-0.599，P=0.000)(圖1)。

RUNX3和EZH2蛋白在癌組和癌旁組中的表達免疫組織化學(xué)染色法檢測RUNX3和EZH2的表達，癌旁組腸腺細胞結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻，排列規(guī)則，癌組腺癌細胞大小不一，排列混亂，失去了正常的結(jié)構(gòu)，RUNX3和EZH2蛋白染色均定位于細胞核上(圖2)。RUNX3 蛋白在癌組陽性表達率為35.48%(11/31)，低于癌旁組77.42%(24/31)(χ2=11.088，P=0.001)；EZH2蛋白在癌組陽性表達率為67.74%(21/31)，高于癌旁組38.71%(12/31)(χ2=5.284，P=0.022)。

RUNX3：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3；EZH2：zeste基因增強子同源物2

圖2 癌組和癌旁組中RUNX3和EZH2蛋白的表達(×400)

XELOX方案新輔助化療療效29例入組患者中，1例患者未完成3周期新輔助化療，1例患者新輔助化療完成后放棄進一步治療，另有1例患者3周期新輔助化療完成后轉(zhuǎn)至其他醫(yī)院繼續(xù)治療，故上述3例患者排除出組，最終共26例患者完成新輔助化療并接受TME手術(shù)。26例患者中，46.15%(12/26)的患者療效良好，其中TRG0級1例、TRG1級1例、TRG2級10例，其余患者TRG分級均≥3(圖3)。

RUNX3和EZH2蛋白在治療前組和治療后組中的表達免疫組織化學(xué)染色法檢測RUNX3和EZH2在治療前組和治療后組中的表達：新輔助治療前，1例入組患者的腫瘤活檢顯示RUNX3為陰性、EZH2為陽性，而新輔助治療后，腫瘤組織中RUNX3表達轉(zhuǎn)為陽性，同時EZH2轉(zhuǎn)為陰性(圖4)。RUNX3蛋白在治療前組中陽性表達率為46.15%(12/26)，在治療后組中陽性表達率為65.38%(17/26)(χ2=1.949，P=0.163)，兩組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；EZH2蛋白在治療前組中陽性表達率為65.38%(17/26)，在治療后組中陽性表達率為42.31%(11/26)(χ2=2.178，P=0.095)，兩組表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；治療前組RUNX3陽性表達的患者中，新輔助化療有效率為75.00%(9/12)，陰性表達的患者新輔助化療有效率為21.43%(3/14)(P=0.036)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；治療前組EZH2陽性表達的患者新輔助化療有效率為29.41%(5/17)，陰性表達的患者新輔助化療有效率為77.78%(7/9)(P=0.038)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；RUNX3+/EZH2-的患者新輔助化療有效率為100%(7/7)，高于RUNX3+/EZH2+、RUNX3-/EZH2-和RUNX3-/EZH2+患者的新輔助化療有效率(P=0.019)；以新輔助化療療效為因變量，RUNX3和EZH2蛋白的表達情況為自變量賦值帶入多因素Logistic回歸逐步回歸法分析，顯示RUNX3蛋白表達情況是影響患者新輔助化療療效的影響因素。

TRG：腫瘤縮退學(xué)分級；箭頭指向為新輔助治療后

圖4 治療前組和治療后組中RUNX3和EZH2蛋白的表達(×400)

討 論

研究表明在多種惡性腫瘤中RUNX3可以抑制腫瘤的細胞生長[8- 10]。這種作用主要通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和Wnt信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)。RUNX3是TGF-β信號傳導(dǎo)通路下游的一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，其所含的結(jié)構(gòu)域負責(zé)結(jié)合靶DNA。TGF-β激活后與TGF-β受體 Ⅰ 和 Ⅱ 相結(jié)合，產(chǎn)生異四聚體復(fù)合物，觸發(fā)細胞內(nèi)信號通路。TGF-β信號傳導(dǎo)主要通過激活Smad蛋白實現(xiàn)，TGF-β信號傳導(dǎo)通路的配體、受體和胞內(nèi)信號傳導(dǎo)分子Smad蛋白組成一個抑制腫瘤信號的通路。Smad蛋白需在RUNX蛋白(包括RUNX3蛋白)的指導(dǎo)下，才能從細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入特定的靶位點，與RUNX蛋白共同轉(zhuǎn)錄激活靶基因，從而對細胞分化、細胞周期調(diào)控、凋亡和惡性轉(zhuǎn)化起作用。RUNX3可以與Wnt信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)器T細胞因子4和β-連環(huán)蛋白形成復(fù)合物，抑制T細胞因子4/β-連環(huán)蛋白結(jié)合物與靶DNA的結(jié)合，從而減弱目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控Wnt信號通路，從而抑制腫瘤細胞的形成。本團隊前期研究證實，直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中，RUNX3基因的失活發(fā)揮重要作用，RUNX3在直腸癌組織中的表達低于癌旁組織[11- 14]。He等[15]亦報道了類似結(jié)果，本研究與之前研究結(jié)果一致。

EZH2基因主要參與轉(zhuǎn)錄抑制，導(dǎo)致包括抑癌基因在內(nèi)的一系列靶基因高度失活[16- 17]。EZH2有4個結(jié)構(gòu)域，即同源結(jié)構(gòu)域 Ⅰ(H1 區(qū))、同源結(jié)構(gòu)域 Ⅱ(H2區(qū))、半胱氨酸富含區(qū)和賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化基序，其賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶催化基序結(jié)構(gòu)域可以對H3組蛋白的第27位賴氨酸(H3K27)進行甲基化修飾發(fā)揮沉默靶基因的作用，這是EZH2基因調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化，促進腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的主要途徑。甲基化是導(dǎo)致RUNX3基因在多種惡性腫瘤中低表達的重要原因[18- 19]，研究顯示在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中，EZH2可通過誘導(dǎo)RUNX3的H3K27發(fā)生甲基化，使其發(fā)生表觀遺傳學(xué)沉默[20]。本研究顯示在直腸癌中，EZH2呈高表達狀態(tài)，這與于立剛等[21]和Tan等[22]的結(jié)果一致，同時，本研究顯示EZH2和RUNX3在直腸癌中的表達呈負相關(guān)，可能在直腸癌中EZH2同樣可通過誘導(dǎo)H3K27發(fā)生甲基化的方式沉默RUNX3基因，后續(xù)可進一步探究EZH2是否可在直腸癌中下調(diào)RUNX3的表達。

新輔助治療是在術(shù)前對患者進行單一放療、化療或同步放化療的方法，期望腫瘤回縮、降期，進而提高手術(shù)治療的成功率[23]。對于距肛門<12 cm的直腸癌，我國指南推薦T3+期和/或N+的可切除直腸癌患者，可行以氟尿嘧啶類藥物為基礎(chǔ)的新輔助放化療或單純新輔助化療[7]。XELOX方案已被證實是一種安全可行的新輔助化療方案[24]，能夠提高腫瘤完全性切除率、改善患者的生存率。高樹全等[25]研究報道，術(shù)前兩療程FOLFOX4方案化療聯(lián)合36～40 Gy術(shù)前短程放療可以提高腫瘤組織中RUNX3的陽性表達率，本研究結(jié)果顯示在新輔助化療前后，腫瘤組織中RUNX3的陽性表達率上升與上述研究結(jié)果趨勢相同，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，同時本研究顯示，新輔助治療后EZH2在腫瘤組織中的陽性表達率有上升的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，目前關(guān)于EZH2在直腸癌新輔助治療前后表達變化的研究報道較少。筆者分析出現(xiàn)基因表達趨勢較明顯但差異無統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果可能有以下幾個原因：第一，本研究與前述研究的新輔助治療方案不同，本研究采用單純XELOX方案化療，可能是導(dǎo)致目標(biāo)基因在新輔助治療前后表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義的原因；第二，高樹全等[25]的研究病例數(shù)為50，本研究入組患者僅26例，樣本量小可能也是導(dǎo)致該結(jié)果的原因，后續(xù)可繼續(xù)擴大樣本量深入研究。

本研究結(jié)果與其他實體瘤的研究成果基本一致，食管鱗癌中，EZH2高表達的腫瘤侵襲性更強，對放化療敏感性更差[26]。化療的敏感性是非常復(fù)雜的問題，由一系列內(nèi)在的和外部因素調(diào)控，包括細胞周期阻滯、細胞凋亡和DNA損傷修復(fù)[27]。pRb/E2F/EZH2途徑可能是影響腫瘤對化療敏感性的重要機制，EZH2是pRb/E2F通路重要的下游靶目標(biāo)，能夠調(diào)節(jié)E2F的功能進而實現(xiàn)對細胞周期的調(diào)控[28]。凋亡是多種抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的一個共同途徑，腫瘤細胞能耐受抗癌藥物誘導(dǎo)凋亡是腫瘤對化療藥物耐藥的重要原因[29]。RUNX3的沉默可導(dǎo)致TGF-β信號通路的阻斷，提高細胞的抗凋亡能力[8]，本研究顯示低表達RUNX3的患者新輔助化療的有效率明顯低于RUNX3高表達的患者。本研究入組患者中，新輔助治療前陽性表達RUNX3蛋白同時陰性表達EZH2蛋白的患者共7例，新輔助化療療效好的概率為100%，高于其他蛋白表達類型的患者，但Logistic回歸僅發(fā)現(xiàn)RUNX3蛋白的表達情況是新輔助化療療效的影響因素，筆者分析可能由于樣本量較小導(dǎo)致EZH2蛋白的表達情況在Logistic回歸分析中無統(tǒng)計學(xué)意義，而在本研究樣本中，聯(lián)合檢測RUNX3和EZH2蛋白的表達對患者新輔助化療療效的預(yù)測作用優(yōu)于單純檢測RUNX3蛋白或EZH2蛋白，后續(xù)應(yīng)繼續(xù)擴大樣本研究進一步證實該結(jié)論。

綜上，本研究顯示，對于局部進展期直腸癌的患者，術(shù)前聯(lián)合檢測RUNX3和EZH2蛋白在腫瘤組織中的表達情況，可篩選出對XELOX方案新輔助化療獲益概率較大的人群，進而幫助臨床醫(yī)師對相應(yīng)患者治療方案的決策，使患者受益。