蛇床子素可溶液劑高效液相色譜分析方法研究

黃 河 周 磊

(四川省危險(xiǎn)化學(xué)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，四川成都，611600)

1 前言

蛇床子素(Cnidiadin)，化學(xué)名稱為 7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，屬香豆素類化合物，由苯環(huán)與吡喃酮環(huán)構(gòu)成其核心結(jié)構(gòu)，同時(shí)還有異戊烯結(jié)構(gòu)[1]。蛇床子素表現(xiàn)出良好的殺菌、殺蟲活性，已作為植物源殺菌劑及殺蟲劑在豇豆白粉病、水稻稻曲病和十字花科蔬菜菜青蟲等防治對(duì)象上取得農(nóng)藥登記。常見劑型為水乳劑、水劑和可溶液劑。目前尚無(wú)蛇床子素可溶液劑的反相液相色譜分析方法，本方法使用C18反相柱和紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器對(duì)蛇床子素可溶液劑中蛇床子素進(jìn)行定量分析。具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和重復(fù)性好等特點(diǎn)。

2 試驗(yàn)部分

2.1 試劑和儀器

2.1.1 試劑

甲醇(色譜純，MREDA品牌)；乙腈(色譜純，MREDA品牌)；水(超純水,18.2MΩ)；蛇床子素標(biāo)樣(已知準(zhǔn)確質(zhì)量分?jǐn)?shù)，98.9%，ANPEL品牌)；蛇床子素可溶液劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，市場(chǎng)購(gòu)得)。

2.1.2 儀器

安捷倫1260型高效液相色譜儀(帶DAD檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫科技有限公司)；色譜柱(Agilent SB C18150mm×4.6mm不銹鋼柱，填料3.5μm，安捷倫科技有限公司)；Chemstation C.01.05版化學(xué)工作站(安捷倫科技有限公司)；KQ-500B超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；0.45 μm過(guò)濾頭(天津市津騰試驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2.2 方法

2.2.1 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈+水=65+35(V+V)，流量：1.0mL/min；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：322 nm[2]；進(jìn)樣量：10.0μL；保留時(shí)間：蛇床子素約5.1 min。典型的蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品，蛇床子素可溶液劑色譜圖如圖1和圖2。

圖1 蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 蛇床子素可溶液劑色譜圖

2.2.2 標(biāo)樣溶液的制備

稱取0.05g蛇床子素標(biāo)樣(精確至0.0001g)置于50mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解并冷至室溫后用甲醇定容，搖勻，用移液管準(zhǔn)確移取上述溶液5mL至另一50mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，備用。

2.2.3 試樣溶液的制備

稱取約含蛇床子素0.005g的試樣(精確至0.0001g)置于50mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解并冷至室溫后用甲醇定容，搖勻，用0.45μm過(guò)濾頭過(guò)濾，備用。

2.2.4 測(cè)定

上述操作條件下，至基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入多針標(biāo)樣溶液，待連續(xù)兩針蛇床子素峰面積相對(duì)變化<1.5%后，按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣的順序進(jìn)樣檢測(cè)。

2.2.5 計(jì)算

分別對(duì)兩針試樣及其前后兩針標(biāo)樣中蛇床子素峰面積取平均值。試樣中蛇床子素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X1(%)按式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式(1)中：A1——標(biāo)樣中，蛇床子素峰面積的平均值；A2——試樣中，蛇床子素峰面積的平均值；m1——標(biāo)樣的質(zhì)量，單位為克(g)；m2——試樣的質(zhì)量，單位為克(g)；P——蛇床子素標(biāo)樣的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；10——標(biāo)樣相對(duì)試樣的稀釋倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 流動(dòng)相的選擇

由于0.5%蛇床子素可溶液劑中有一定的雜質(zhì)干擾，為得到良好的分離效果，尖銳對(duì)稱的峰型和適中的保留時(shí)間，根據(jù)蛇床子素理化性質(zhì)和溶劑的紫外吸收波長(zhǎng)，選擇甲醇作為溶劑溶解樣品。分別使用甲醇+水，乙腈+水用作流動(dòng)相對(duì)蛇床子素進(jìn)行分離檢測(cè)，對(duì)比后發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙腈+水=65+35，流速為1.0mL/min時(shí)蛇床子素色譜峰峰型較好，色譜柱柱頭壓力低,與雜質(zhì)能完全分離。并且分析時(shí)間較短，提高了工作效率。

3.2 分析方法的特異性

本試驗(yàn)采用 HPLC+DAD 峰純度進(jìn)行蛇床子素高效液相色譜分析方法特異性鑒別。結(jié)果表明：蛇床子素標(biāo)樣與0.5%蛇床子素可溶液劑中的蛇床子素光譜峰純度均>990，有效成分處無(wú)其他物質(zhì)干擾，判定為純峰，符合定量分析要求。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

使用DAD檢測(cè)器對(duì)蛇床子素進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到紫外吸收光譜圖，如圖3。由圖 3 可知,蛇床子素在202nm和322 nm均有較大吸收。當(dāng)選用 322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)時(shí), 蛇床子素有較強(qiáng)的吸收峰,可避開流動(dòng)相乙腈的截止波長(zhǎng)，且雜質(zhì)響應(yīng)值小。因此,綜合考慮多種因素,最終選定322 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜圖

3.4 線性相關(guān)性測(cè)定

稱取蛇床子素標(biāo)準(zhǔn)品0.0448g于50mL容量瓶中，甲醇溶解定容后，再分別移取2.5、4.0、5.0、6.0、7.5mL于五個(gè)50mL容量瓶中，用甲醇定容搖勻。按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法進(jìn)樣，每個(gè)濃度分析兩次，取其峰面積平均值。以蛇床子素的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(ug/mL)為橫坐標(biāo)作圖，得到線性方程：y = 30x-17，線性相關(guān)系數(shù): R2= 0.9997。方法線性關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果見圖4?？梢姳痉椒ǖ木€性相關(guān)性較好，能準(zhǔn)確地對(duì)有效成分進(jìn)行定量分析。

圖4 蛇床子素的線性關(guān)系圖

3.5 精密度試驗(yàn)

按本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法對(duì)同一樣品中的蛇床子素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行五次平行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)，結(jié)果見表1。本方法對(duì)蛇床子素分析的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.0060，變異系數(shù)為1.19%。

表1 分析方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

為了驗(yàn)證此方法的準(zhǔn)確度,特進(jìn)行了蛇床子素回收率試驗(yàn)。在已知含量的蛇床子素可溶液劑中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品,按“2.2.1”色譜操作條件分析其質(zhì)量,計(jì)算回收率。結(jié)果如表2。由表2可知蛇床子素的平均回收率均為 98.5%。由此可見：該方法回收率較高 ,可準(zhǔn)確分析制劑中蛇床子素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表2 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

4 結(jié)論

由上可知，采用此方法分析蛇床子素可溶液劑中蛇床子素的質(zhì)量分?jǐn)?shù), 具有良好的準(zhǔn)確度及精密度 ,線性范圍良好，并且操作簡(jiǎn)便 、快速。因此，該方法是進(jìn)行蛇床子素可溶液液劑分析檢測(cè)的理想方法。