未成熟卵母細(xì)胞體外成熟影響因素及在助孕中的應(yīng)用進(jìn)展

徐雅蘭，郝永秀，喬杰

(北京大學(xué)第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，北京 100191)

1991年，Cha等[1]首次將體外成熟技術(shù)(in vitro maturation，IVM)應(yīng)用于人未成熟卵母細(xì)胞，且成功妊娠。目前IVM已成為繼體外受精胚胎移植術(shù)(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)后輔助生殖的新型手段，也是現(xiàn)代生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。IVM是指不經(jīng)藥物超促排卵或應(yīng)用少量促性腺激素從卵巢中獲取未成熟卵子，并在適當(dāng)條件下或體外成熟培養(yǎng)，使成熟后的卵子具備受精能力，然后再將胚胎移植至母親子宮腔內(nèi)生長(zhǎng)[2-3]。卵子正常生理成熟包括細(xì)胞質(zhì)成熟和細(xì)胞核成熟兩個(gè)同步過(guò)程，即卵母細(xì)胞核破裂完成第一次減數(shù)分裂后，進(jìn)入并停滯于第二次減數(shù)分裂中期[4-5]。受卵母細(xì)胞自身及各方面培養(yǎng)條件的影響，IVM實(shí)施過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)成熟與細(xì)胞核成熟存在差異，導(dǎo)致IVF率及妊娠率較低[6-7]。隨著輔助生殖技術(shù)的不斷發(fā)展，IVM越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床，以幫助卵母細(xì)胞成熟障礙患者成功妊娠?，F(xiàn)就未成熟卵母細(xì)胞體外成熟影響因素及在助孕中的應(yīng)用進(jìn)展予以綜述。

1 影響未成熟卵母細(xì)胞體外成熟的因素

在現(xiàn)代輔助生殖領(lǐng)域中，IVM為卵巢早衰或切除、遺傳病等患者提供了生育機(jī)會(huì)，同時(shí)還有助于了解卵母細(xì)胞不同發(fā)育階段的機(jī)制及特點(diǎn)，但由于IVM治療周期多于體外操作，且細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)成熟時(shí)間不同，IVM存在卵母細(xì)胞培養(yǎng)成熟率低以及IVF率、流產(chǎn)率高等問(wèn)題。

1.1培養(yǎng)環(huán)境 人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h，卵子第一成熟期發(fā)生于體外培養(yǎng)26 h內(nèi)，第二成熟期發(fā)生于體外培養(yǎng)28 h后，體外培養(yǎng)過(guò)程中可能存在成熟度不同的卵母細(xì)胞，因此需要不同的培養(yǎng)環(huán)境[8]。研究顯示，卵子核成熟期間，短暫的高溫對(duì) Ⅱ 期卵子紡錘體的形成影響較小，但會(huì)對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響，且隨著高溫持續(xù)時(shí)間的延長(zhǎng)，破壞力逐漸增強(qiáng)，而紡錘體微管、微絲數(shù)量及結(jié)構(gòu)變異易導(dǎo)致細(xì)胞核骨架、細(xì)胞骨架發(fā)生不規(guī)則改變，降低卵子受精能力以及胚胎的發(fā)育能力[9-10]。Cohen等[11]給予卵子成熟期不同氧氣濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5%氧氣濃度更利于未成熟的卵母細(xì)胞向囊胚轉(zhuǎn)化，而高濃度氧氣會(huì)延遲卵子的成熟。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，行IVM過(guò)程中，與20%氧氣環(huán)境相比，5%氧氣環(huán)境下對(duì)卵母細(xì)胞已形成的囊胚凍融，其孵出率顯著升高，表明低氧環(huán)境下行IVM效果較好[12]。另有報(bào)道顯示，當(dāng)硝普鈉濃度為1 mmol/L時(shí)，其產(chǎn)生的一氧化氮可延遲未成熟卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)過(guò)程中前5 h內(nèi)的生發(fā)泡破裂，使卵母細(xì)胞排出第一極體時(shí)間延長(zhǎng)至24 h；而當(dāng)硝普鈉濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)，其產(chǎn)生的一氧化氮可抑制次黃嘌呤分裂，刺激卵母細(xì)胞裂解成熟，但一氧化氮對(duì)卵母細(xì)胞的雙重作用機(jī)制目前尚未明確[13-14]。以上研究表明，溫度、氧氣等培養(yǎng)環(huán)境可能是影響人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟的因素之一。

1.2生物化學(xué)因素

1.2.1表皮生長(zhǎng)因子 有學(xué)者認(rèn)為，表皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)環(huán)腺苷酸介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，而酪氨酸激酶磷酸化及鈣離子依賴性激酶活化均可加速細(xì)胞質(zhì)成熟，進(jìn)而誘導(dǎo)未成熟卵母細(xì)胞裂解，從而促進(jìn)第一極體排出[15-16]。也有學(xué)者認(rèn)為，表皮生長(zhǎng)因子可通過(guò)上調(diào)縫隙連接蛋白43的表達(dá)而影響IVM結(jié)果，由于縫隙連接蛋白43具有重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，因此其高表達(dá)可加速卵泡破裂及第一極體形成，從而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的成熟[17]。此外，表皮生長(zhǎng)因子還具有擬黃體生成素的作用，可提高未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)的卵子成熟率，增強(qiáng)卵子受精能力，從而增加囊胚形成率，同時(shí)對(duì)胚胎發(fā)育能力及胚胎凍融過(guò)程中的耐受力也有良好的促進(jìn)作用[18]。

1.2.2白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1和卵泡液減數(shù)分裂激活固醇(follicular fluid-meiosis activated sterol，F(xiàn)F-MAS) IL-1的發(fā)生地及靶器官均為卵巢，IL-1可阻止黃體生成素誘發(fā)的未成熟卵母細(xì)胞恢復(fù)正常減數(shù)分裂。Spanou等[19]研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β與黃體生成素在卵母細(xì)胞中共存可抑制黃體生成素誘導(dǎo)分裂，當(dāng)黃體生成素劑量約為50 ng時(shí)，卵子成熟率最低，而加入IL-1β受體拮抗劑可抑制IL-1β的作用，表明合理調(diào)控IL-1β受體表達(dá)可提升卵母細(xì)胞體外成熟率。Ortega-Hrepich等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)F-MAS可促進(jìn)卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂并進(jìn)入減數(shù)第二次分裂中期，加快IVF后胚胎從雙原核期至囊胚期的轉(zhuǎn)變。但FF-MAS僅可促進(jìn)細(xì)胞核成熟，細(xì)胞質(zhì)的成熟仍需通過(guò)豐富的培養(yǎng)基提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。

1.3營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 在IVM過(guò)程中，卵母細(xì)胞核的成熟受FF-MAS、激素等調(diào)節(jié)，而細(xì)胞質(zhì)的成熟主要由含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基完成。其中，葡萄糖是能量代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)之一，不僅參與乳酸鹽的生成，還參與細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)建。在卵母細(xì)胞成熟后期，部分葡萄糖與卵泡刺激素結(jié)合，從而增加卵冠丘復(fù)合物直徑，提高卵子成熟率[21-22]。有研究發(fā)現(xiàn)，半胱胺可通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的合成速度增加其細(xì)胞內(nèi)濃度，導(dǎo)致亮甲酚藍(lán)實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率顯著升高，從而改善正常卵母細(xì)胞受精率及胚胎發(fā)育能力，但目前尚無(wú)確切證據(jù)表明半胱胺對(duì)卵母細(xì)胞核的成熟有積極影響[23]。目前，研究者對(duì)于培養(yǎng)基中是否需要加入卵泡液尚存在爭(zhēng)議。通過(guò)研究駱駝全卵泡液培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中完全為卵泡液時(shí)，可將未成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)至囊胚期，其中含較大卵泡的卵泡液可擴(kuò)張卵丘顆粒細(xì)胞；與含20%卵泡液的培養(yǎng)基相比，全卵泡液培養(yǎng)基細(xì)胞核成熟率顯著升高，表明全卵泡液培養(yǎng)基在提高細(xì)胞核成熟率方面優(yōu)勢(shì)顯著[24]。但有學(xué)者通過(guò)觀察胚胎發(fā)育能力發(fā)現(xiàn)，全卵泡液培養(yǎng)基胚胎發(fā)育能力不如常規(guī)培養(yǎng)基，故如何通過(guò)調(diào)控卵泡液含量增加胚胎發(fā)育能力可作為臨床研究體外成熟的新方向[25]。

1.4生理因素 卵丘顆粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞間通過(guò)縫隙間接交換物質(zhì)供給卵母細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，而顆粒細(xì)胞的擴(kuò)張及卵母細(xì)胞外空間骨架的形成又與卵母細(xì)胞成熟密切相關(guān)，卵母細(xì)胞、放射冠以及周圍的卵丘顆粒細(xì)胞形成的卵冠丘復(fù)合物培養(yǎng)成熟率遠(yuǎn)高于裸卵，因此臨床可將卵丘顆粒細(xì)胞的凋亡作為篩選正常成熟卵母細(xì)胞的指標(biāo)[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，向含顆粒細(xì)胞的卵母細(xì)胞中加入生理濃度約為2 ng/mL的表皮生長(zhǎng)因子，卵母細(xì)胞成熟率顯著提高，表明含有顆粒細(xì)胞及表皮生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基有利于卵母細(xì)胞細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的成熟，對(duì)提高體外成熟妊娠率有積極意義[27]。此外，Ailia等[28]將大鼠成熟卵母細(xì)胞脫顆粒后行IVF并分別與輸卵管上皮細(xì)胞、顆粒細(xì)胞共同培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與輸卵管上皮細(xì)胞共存的培養(yǎng)基細(xì)胞可發(fā)育至囊胚期，且胚胎數(shù)量更多，由此可見(jiàn)，上調(diào)培養(yǎng)基中的輸卵管上皮細(xì)胞水平可促進(jìn)胞質(zhì)成熟，增加囊胚孵出率。

2 IVM臨床助孕的應(yīng)用范圍

2.1在多囊卵巢綜合征中的應(yīng)用 多囊卵巢綜合征是以生殖障礙、內(nèi)分泌異常、代謝紊亂為主要特征的臨床綜合征，不僅可影響患者的生育能力，還可對(duì)孕期、遠(yuǎn)期及子代的健康產(chǎn)生負(fù)性作用[29]。輔助生殖技術(shù)是治療多囊卵巢綜合征的主要手段，行IVF時(shí)獲卵數(shù)顯著增加，臨床妊娠率升高；傳統(tǒng)IVF-ET雖可治療多囊卵巢綜合征，但易發(fā)生卵巢過(guò)度刺激綜合征(ovarian hyper stimulation syndrome，OHSS)，而IVM取卵過(guò)程中不使用促性腺激素，可避免過(guò)度刺激卵巢，且妊娠過(guò)程中超聲檢測(cè)次數(shù)少，因此具有較高的臨床價(jià)值[30-31]。Virant-Klun等[32]研究顯示，IVM治療多囊卵巢綜合征，妊娠率、種植率及活產(chǎn)率均較高，且取卵前應(yīng)用卵泡刺激素可獲得更多的未成熟卵母細(xì)胞，有益于卵母細(xì)胞成熟以及胚胎發(fā)育能力的提升。Vuong等[33]體外成熟培養(yǎng)從無(wú)周期刺激的多囊卵巢綜合征患者卵巢中獲取的未成熟卵母細(xì)胞，并將獲得的胚胎移植回母體子宮腔，隨訪10個(gè)月發(fā)現(xiàn)，臨床妊娠率約為24%，療效較好。

2.2在IVF卵巢反應(yīng)不良及卵泡發(fā)育遲緩中的應(yīng)用 傳統(tǒng)IVF-ET治療中偶有卵子發(fā)育不良、卵泡發(fā)育遲緩等現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為卵巢對(duì)常規(guī)藥物促排卵方案反應(yīng)降低、雌激素水平異常、卵泡數(shù)量減少甚至發(fā)育停滯，無(wú)法獲得足夠的卵母細(xì)胞，進(jìn)而影響可供移植的胚胎，導(dǎo)致治療周期的取消率升高，妊娠率降低[34]。既往研究顯示，卵泡生長(zhǎng)發(fā)育具有“卵泡波”特征，若于卵母細(xì)胞進(jìn)入閉鎖性程序死亡前，在適宜的條件下進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，可獲得與正常生理過(guò)程相似的成熟率，可避免傳統(tǒng)促排卵方案刺激下產(chǎn)生的卵巢反應(yīng)不良及卵泡發(fā)育遲緩等問(wèn)題[35-36]。宋文妍等[37]比較不同方式對(duì)81例需助孕治療的卵巢低反應(yīng)高齡患者的影響發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用IVM的患者卵母細(xì)胞體外成熟率達(dá)69.8%，可利用胚胎率達(dá)70.8%，且未增加妊娠風(fēng)險(xiǎn)，提示IVM可避免常規(guī)IVF治療中出現(xiàn)的卵巢異?，F(xiàn)象，使臨床獲取的卵母細(xì)胞有重新利用的機(jī)會(huì)。

2.3在OHSS中的應(yīng)用 輔助生殖技術(shù)均應(yīng)用藥物促排卵，導(dǎo)致多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育生長(zhǎng)，從而使女性體內(nèi)雌激素水平顯著升高，出現(xiàn)惡心、腹脹、嘔吐等癥狀，即OHSS[38]。有研究納入51例OHSS患者，并隨機(jī)分為試驗(yàn)組(27例)和對(duì)照組(24例)，兩組均在優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≤12 mm時(shí)停用促性腺激素，8 h后注射人絨毛膜促性腺激素，其中試驗(yàn)組在36 h后取卵行IVM，對(duì)照組在36 h后行IVF，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組患者OHSS發(fā)生率較低，且妊娠率較高，表明IVM可有效預(yù)防OHSS的發(fā)生[39]。González-Ortega等[40]通過(guò)比較常規(guī)IVF治療與IVM在OHSS中的應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，IVM妊娠率較高，原因在于當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≤12 mm時(shí)，患者生殖激素水平接近正常生理水平，IVM可降低小卵泡發(fā)育異常的風(fēng)險(xiǎn)；此外，IVM可降低排卵周期中生殖激素超生理水平對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的影響，有利于胚胎種植及發(fā)育生長(zhǎng)。

2.4在贈(zèng)卵受孕中的應(yīng)用 近年來(lái)，生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，而保存尚未生育的年輕患者的生育力對(duì)社會(huì)發(fā)展意義重大。隨著醫(yī)療科技的不斷發(fā)展，IVM可在無(wú)刺激周期取出未成熟卵母細(xì)胞，并在合適條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)獲得成熟卵子，幫助需要卵子捐贈(zèng)的患者，且具有費(fèi)用低、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì)[41-42]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在人未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)期間，采用玻璃化冷凍法保存的減數(shù)第二次分裂中期卵母細(xì)胞發(fā)育潛能高于生發(fā)泡期未成熟卵發(fā)育潛能，提示卵巢組織經(jīng)體外培養(yǎng)后可長(zhǎng)期凍存，為卵子贈(zèng)送提供了生殖保險(xiǎn)[43]；且IVM實(shí)施過(guò)程中不需激素超促排卵，無(wú)OHSS風(fēng)險(xiǎn)，不僅可避免因胚胎冷凍引發(fā)的倫理及法律問(wèn)題，還為患者提供了多種選擇。

3 IVM存在的問(wèn)題

臨床應(yīng)用IVM助孕時(shí)，需模擬正常機(jī)體內(nèi)卵母細(xì)胞生存及成熟所需的環(huán)境，體外培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，不能完全保證成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量，加之目前對(duì)IVM助孕后產(chǎn)生的子代缺乏大樣本研究，因此IVM助孕的子代與正常出生的嬰幼兒在成長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中是否存在差異目前尚不明確[44-45]。有學(xué)者比較普通嬰幼兒與輔助生殖技術(shù)出生嬰幼兒的發(fā)育量表，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與普通嬰幼兒相比，經(jīng)IVM輔助出生的嬰幼兒智力發(fā)育指數(shù)和神經(jīng)運(yùn)動(dòng)發(fā)育指數(shù)均無(wú)異常[46]。但由于IVM臨床應(yīng)用時(shí)間較短，因此對(duì)于治療周期中成熟卵母細(xì)胞的遺傳學(xué)及胚胎發(fā)育的分子生物學(xué)還應(yīng)進(jìn)一步深入研究。此外，目前輔助生殖領(lǐng)域尚無(wú)商業(yè)化的培養(yǎng)液，需自行配置體外成熟培養(yǎng)基，因此即使采取嚴(yán)格的病原學(xué)檢查，仍不能避免培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)病原學(xué)交叉感染等問(wèn)題，從而導(dǎo)致IVM治療周期中卵母細(xì)胞透明帶發(fā)生硬化，影響卵母細(xì)胞的IVF及胚胎孵化過(guò)程，不利于妊娠結(jié)局，故優(yōu)化體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)也是亟待解決的問(wèn)題之一[47]。

4 小 結(jié)

IVM具有操作簡(jiǎn)便、治療周期短、費(fèi)用少等優(yōu)勢(shì)，但治療過(guò)程中易受培養(yǎng)環(huán)境、生物化學(xué)、生理等因素影響，因此如何在卵母細(xì)胞核成熟的同時(shí)提高細(xì)胞質(zhì)的成熟度，從而提高胚胎發(fā)育潛能、增加妊娠率，進(jìn)而擴(kuò)大其在臨床工作中的應(yīng)用范圍是目前亟待解決的問(wèn)題。IVM雖不能完全替代IVF，但其可應(yīng)用于多囊卵巢綜合征患者，且在避免卵巢反應(yīng)不良及卵泡發(fā)育遲緩、降低OHSS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等方面優(yōu)越顯著。因此，未來(lái)可在進(jìn)一步探索中建立更科學(xué)、有效的未成熟卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)系統(tǒng)，增加助孕途徑。