糖酵解抑制劑通過抑制糖酵解和促進(jìn)線粒體調(diào)節(jié)的途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

汪 虎，張晨嵩，潘成武，李 雷，李 靖，馬家馳

由于高復(fù)發(fā)率、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，胃癌總體5年生存率仍然很低[1]。線粒體作為氧氣傳感器以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的產(chǎn)生者的重要性已成為癌癥研究的重點(diǎn)[2-3]。有氧糖酵解涉及己糖激酶(hexokinase，HK)和磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，PFK)[4]，其在腫瘤中過表達(dá)，可被許多癌蛋白調(diào)節(jié)，從而促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和化學(xué)抗藥性[5-6]。癌細(xì)胞的代謝和有氧糖酵解被認(rèn)為是癌細(xì)胞的特異性靶標(biāo)，為癌癥治療提供了新的視角[7]。癌細(xì)胞具有較高的糖酵解速率，因此阻斷該能量產(chǎn)生途徑似乎是有選擇地殺死癌細(xì)胞的合理方法[8]。糖酵解產(chǎn)生的能量不如氧化磷酸化產(chǎn)生的能量有效，故癌細(xì)胞需要更多的葡萄糖來支持更高的糖酵解速率[9]。WZB117是一種合成的小分子葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白抑制劑，其下調(diào)葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白以及細(xì)胞內(nèi)ATP和糖酵解酶的水平，從而發(fā)揮抗癌活性[10-11]。本研究即探討糖酵解抑制劑WZB117誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞系MGC-803的凋亡的機(jī)制，以為臨床診治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng) PRMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco(Thermo Fisher科學(xué)公司，美國(guó))。處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌MGC-803用于本次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為2組：對(duì)照組(正常培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞，n=20)，WZB117組(用20 μg/mL的葡萄糖運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白抑制劑處理的胃癌細(xì)胞，n=20)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞增殖檢測(cè) 使用CellTiter 96 AQueous One Solution細(xì)胞增殖測(cè)定法[(比色MTS測(cè)定試劑盒(Promega公司)]確定細(xì)胞的增殖能力。將MGC-803接種到含有5%FBS的改良培養(yǎng)基中的96孔板中，密度為每孔10 000個(gè)細(xì)胞，并在12 h后進(jìn)行藥物處理。分別在24 h時(shí)和72 h后，吸出培養(yǎng)基，將100 μL MTS的1∶5溶液添加到細(xì)胞培養(yǎng)基中的每個(gè)孔中，孵育1～4 h，并使用BioTek Synergy HT讀板儀在490 nm下測(cè)量吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞凋亡和活力測(cè)定 為了進(jìn)行細(xì)胞凋亡和生存力分析，將4×103細(xì)胞/孔接種到96孔板中，并在37 ℃和5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。使用一步TUNEL細(xì)胞凋亡測(cè)定試劑盒(Beyotime公司)來檢測(cè)凋亡細(xì)胞。細(xì)胞核用DAPI(藍(lán)色)染色。通過熒光顯微鏡獲得熒光圖像。通過ImageJ軟件獲得TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的定量，并通過GraphPad Prism版本5.0計(jì)算。細(xì)胞活力通過CCK-8測(cè)定法確定。用不同條件處理后，將100 μL含10%CCK-8溶液的新鮮培養(yǎng)基添加到每個(gè)孔中，并在37 ℃下孵育1.5 h。用SynergyTMHTX多模式酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司，美國(guó))觀察450 nm處的吸光度。根據(jù)制造商的協(xié)議計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)生存力。

1.2.3 ATP產(chǎn)量的測(cè)定 ATP分析按照制造商的說明進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，將收獲的培養(yǎng)細(xì)胞用裂解緩沖液裂解，在4 ℃以10 000 g離心2 min。最后，在6孔板中，通過將20 μL上清液與100 μL熒光素酶試劑混合來確定ATP的水平，該試劑可催化ATP和熒光素的發(fā)光。用單色儀微孔板讀數(shù)器測(cè)量亮度。并使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒確定每組的蛋白濃度。對(duì)于每個(gè)樣品，準(zhǔn)備一個(gè)包含上述成分以及10 μg/mL寡霉素的重復(fù)試管。用單色儀微孔板讀數(shù)器測(cè)量亮度。產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，并使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒確定每個(gè)處理組的蛋白質(zhì)濃度?？侫TP水平表示為nmol/mg蛋白。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡分析 用RIPA溶液(賽默飛世爾公司，美國(guó))提取蛋白質(zhì)，并通過BCA測(cè)定法(默克公司，德國(guó))測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將20 μg待測(cè)蛋白質(zhì)與加樣緩沖液混合，變性并添加到10%SDS-PAGE凝膠的每個(gè)泳道中。電泳后，將轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的蛋白質(zhì)在5%脫脂牛奶中于22 ℃封閉1 h，與抗人HK單克隆抗體和小鼠抗人PFK單克隆抗體、小鼠抗人Bcl-2單克隆抗體、小鼠抗人Bax單克隆抗體、小鼠抗人caspase-3單克隆抗體和小鼠抗人Cyt-c單克隆抗體，在4 ℃孵育過夜。第2天，將膜用TBST(0.3%Tween-20)洗滌，在室溫下與PFK(稀釋度為1∶1 000；目錄號(hào)MBS435036；MyBioSource，Inc.)一起孵育2 h。隨后將Immobilon?ECL Ultra Western HRP底物(Sigma公司，美國(guó))鋪展到膜進(jìn)行轉(zhuǎn)染和顯色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 24 h時(shí)和48 h時(shí)，WZB117組較對(duì)照組細(xì)胞增殖均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表1)。

表1 2組細(xì)胞增殖檢測(cè)比較

2.2 細(xì)胞凋亡率和活力檢測(cè) WZB117組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，WZB117組較對(duì)照組細(xì)胞活力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TUNEL分析顯示，WZB117誘導(dǎo)的細(xì)胞的凋亡增加(見圖1、表2)。

表2 細(xì)胞凋亡與活力測(cè)定

2.3 細(xì)胞糖酵解ATP水平檢測(cè) 評(píng)估糖酵解細(xì)胞中ATP產(chǎn)生，12 h和24 h時(shí)WZB117組較對(duì)照組ATP含量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見表3)。

表3 ATP含量檢測(cè)蛋白)

2.4 Bcl-2、Bax、caspase-3和Cyt-c蛋白的表達(dá) WZB117組較對(duì)照組Bcl-2表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，WZB117組較對(duì)照組Bax、caspase-3和Cyt-c表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖2、表4)。

表4 Bcl-2、Bax、caspase-3和Cyt-c蛋白的表達(dá)量積分光密度值)

2.5 糖酵解相關(guān)酶HK和PFK的表達(dá) WZB117組較對(duì)照組HK和PFK表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見圖3、表5)。

表5 糖酵解酶HK和PFK蛋白表達(dá)量積分光密度值)

3 討論

胃癌是最惡性的腫瘤之一，具有很高的死亡率和發(fā)病率，但其啟動(dòng)和發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚。此外，仍然缺乏用于胃癌的臨床治療的有效治療劑。因此，尋找具有更少不良反應(yīng)的更有效的抗胃癌藥物并探索其潛在機(jī)制是緊迫的目標(biāo)。最近的許多論文表明，腫瘤中的線粒體缺陷很少見，并且通過糖酵解產(chǎn)生ATP并不是在每種類型的腫瘤中都必需的[12]。線粒體代謝對(duì)于多種癌細(xì)胞的快速增殖很重要，而用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的ATP是否源自有氧糖酵解或線粒體生物能學(xué)可能主要取決于微環(huán)境[13]。因此，靶向線粒體生物能學(xué)和糖酵解途徑可能是抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一種新穎有效的方法。

與正常細(xì)胞相比，大多數(shù)癌細(xì)胞優(yōu)先依靠糖酵解產(chǎn)生ATP[14]。這種表型稱為有氧糖酵解。此外，之前的實(shí)驗(yàn)和其他研究已經(jīng)證實(shí)，胃癌利用糖酵解來滿足能量需求[15]。因此，糖酵解抑制可能是抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和/或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的合適靶標(biāo)。HK和PFK是調(diào)節(jié)糖酵解速率的關(guān)鍵酶。HK與線粒體膜結(jié)合以催化糖酵解的第一個(gè)速率調(diào)節(jié)步驟，并增強(qiáng)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡[16]。糖酵解和細(xì)胞凋亡均被視為對(duì)腫瘤細(xì)胞存活至關(guān)重要的獨(dú)立途徑。惡性細(xì)胞利用糖酵解作為主要的能量來源，與此同時(shí)，在此過程中產(chǎn)生了大量的乳酸和丙酮酸。然而，糖酵解的最終產(chǎn)物乳酸被輸出到細(xì)胞外培養(yǎng)基中，并有助于腫瘤微環(huán)境的酸化，這有利于腫瘤的發(fā)展、侵襲，并抑制了抗癌的免疫防御[17]。此外有證據(jù)表明，乳酸可能在氧化磷酸化后進(jìn)入間質(zhì)和癌細(xì)胞中，并可能反過來產(chǎn)生丙酮酸作為腫瘤細(xì)胞的高能底物[18]。這項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)表明，WZB117可以顯著抑制細(xì)胞間ATP的產(chǎn)生。12 h時(shí)和24 h時(shí)檢測(cè)WZB117組較對(duì)照組ATP含量降低，WZB117組較對(duì)照組HK和PFK表達(dá)降低，表明WZB117可通過抑制糖酵解關(guān)鍵酶的活性來抑制MGC-803細(xì)胞中的糖酵解通量，導(dǎo)致ATP消耗，從而導(dǎo)致能量補(bǔ)充不足以支持癌細(xì)胞有絲分裂，DNA修復(fù)，擴(kuò)散和入侵。

然而，凋亡是程序性細(xì)胞死亡的自發(fā)過程，其可以由多種物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)，并由生物體精確調(diào)控。盡管凋亡中存在三種主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(線粒體、死亡受體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))，但凋亡信號(hào)的整合和擴(kuò)增通常發(fā)生在線粒體水平，主要受Bcl-2家族基因調(diào)控。有證據(jù)[19]表明，Bcl-2可以防止導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的多種信號(hào)，并且與線粒體外膜有關(guān)，后者是保護(hù)線粒體完整性和功能的關(guān)鍵部分，而Bax通過拮抗Bcl-2的功能誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)變。Bcl-2刺激線粒體釋放凋亡相關(guān)的生物活性物質(zhì)，例如Cyt-c，后者激活caspase-3/caspase-9并啟動(dòng)caspase信號(hào)級(jí)聯(lián)并誘導(dǎo)凋亡。

caspase-3是caspase蛋白家族最重要的成員之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。當(dāng)被外部細(xì)胞凋亡信號(hào)激活時(shí)，caspase-3可以通過許多其他蛋白酶的相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[20]。我們從流式細(xì)胞儀觀察到的結(jié)果表明，WZB117可以明顯誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡。同時(shí)WZB117下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，而上調(diào)Bax 蛋白的表達(dá)，同時(shí)增加Cyt-c和caspase-3的表達(dá)。上面的結(jié)果表明，WZB117具有誘導(dǎo)Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)的能力，這破壞了線粒體的完整性并釋放了Cyt-c到細(xì)細(xì)胞質(zhì)中，激活了caspase-3，促進(jìn)MGC-803細(xì)胞最終凋亡。

綜上所述，WZB117可抑制MGC-803細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并阻斷糖酵解途徑，并調(diào)節(jié)Bcl-2家族基因誘導(dǎo)線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。