不育系培矮64S衍生的近等基因系的育性感溫性及基因初定位研究

王思瑤,潘曉玲,劉 敏,李佳馨,陳慧玲,毛丹丹,戴小軍,梁滿中,陳良碧

(湖南師范大學 生命科學學院 作物不育資源創(chuàng)新與應用湖南省重點實驗室,中國湖南 長沙 410081)

農(nóng)墾58S是最早被發(fā)現(xiàn)并鑒定的光敏核不育水稻[1]。研究證明,光敏核不育系育性轉(zhuǎn)換的光周期敏感時期是第二次枝梗原基分化期至花粉母細胞形成期,對光周期敏感的部位是葉片,光受體是光敏色素[2～3]。陳良碧等[4～5]研究發(fā)現(xiàn),溫敏核不育系和光敏不育系育性轉(zhuǎn)換的溫度敏感期都是雌雄蕊形成期到花粉母細胞減數(shù)分裂期,對溫度敏感的部位是敏感期的幼穗。

安農(nóng)S-1在日均溫度26℃以上時表現(xiàn)為雄性不育,低于24℃時則可育并結(jié)實[6]。培矮64S是農(nóng)墾58S衍生的不育系中應用面積最大、不育臨界溫度最低的不育系,該不育系在23.5℃條件下花粉低度可育,但自交結(jié)實率低;兩系不育系中,不育臨界溫度最低、雜交制種最安全的不育系是株1S[6]。育種工作者在應用研究中發(fā)現(xiàn),培矮64S等農(nóng)墾58S衍生的秈型不育系的花粉育性主要受溫度調(diào)控,誘導花粉不育的臨界溫度的高低成為了不育系能否安全制種的關鍵因素,而有關農(nóng)墾58S衍生不育系中育性感溫性的遺傳基礎尚不清楚,其臨界溫度及其變化規(guī)律也未見報道。本研究以農(nóng)墾58S衍生的不育系培矮64S及其與豐源B制備的近等基因系為材料,對其育性的感溫特性和感溫基因定位進行研究,旨在促進對不育系培矮64S及衍生不育系的育性感溫特性的認識,提高兩用核不育系雜交制種的安全性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

培矮64S及其與豐源B制備的40個近等基因系不育材料和對照材料株1S均由本實驗室提供。材料的每個處理群體為3個盆栽,30個單株。

實驗所使用引物的合成和克隆序列的測定均由上海生工生物工程股份有限公司完成。RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司,DNA提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司,PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase購自寶生物工程(大連)有限公司,cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 育性鑒定

將育性敏感期(花粉母細胞至減數(shù)分裂期)在2018年7月15日至8月5日自然高溫(日均溫≥28℃)條件下生長的不育系平均分成兩組,一組采用自然高溫條件,一組在自然光照條件下的23.5℃冷水池處理6 d。處理結(jié)束后在自然高溫條件下恢復生長。開花期連續(xù)檢測花粉育性1個星期。

取每株不育系3朵穎花中的花藥置于載玻片上的碘液中,夾散花粉,在10×20倍顯微鏡下觀察不同的3個視野。大小正常并被染成黑褐色的花粉為具有生活力的可染花粉;染色不均勻或形狀不規(guī)則的花粉為不育花粉[7]?？扇净ǚ勐?%)=可染花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)×100%,取3個視野的平均值。

1.3 感溫不育基因定位分析

將培矮64S以及近等基因系各單株送于華大基因公司進行全基因組測序,獲得感溫不育基因的初步定位,再利用SSR標記和QTL基因定位技術對感溫不育基因進行精細定位。

1.4 DNA的提取

取一段水稻新鮮葉片,將裝有材料的EP管放入球磨儀內(nèi)研磨,后按說明書操作。加入700 μL 65℃預熱的buffer GP1,置于65℃恒溫水浴20 min,加入700 μL氯仿,充分混勻后12 000 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上層水相,加入700 μL buffer GP2,過吸附柱。向吸附柱中加入500 μL試劑buffer GW1,12 000 r/min離心1 min,隨后加入500 μL試劑buffer GW2,12 000 r/min離心1 min。12 000 r/min離心2 min后晾干。向吸附柱的中間部位加入50 μL 65℃預熱的buffer GE或滅菌ddH2O,12 000 r/min離心1 min,收集DNA溶液并于-20℃保存。

1.5 RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

1.5.1 RNA的提取

取水稻材料裝入研缽中,加入液氮研磨成粉末狀,轉(zhuǎn)入EP管中,向EP管中加入1 mL TRI-zoL試劑充分混勻。離心10 min,取上清加入0.2 mL已預冷的氯仿,4℃12 000 r/min離心15 min,取上層水相于1.5 mL EP管中,加入等體積已預冷的異丙醇,顛倒混勻15 s,離心10 min。用75%乙醇1 mL洗滌沉淀,4℃12 000 r/min離心5 min,棄上清。將EP管置于超凈工作臺上吹至管中的白色沉淀變透明;向EP管中加入20 μL滅菌ddH2O(60℃預熱),放入60℃恒溫水浴鍋中水浴10 min,檢測RNA濃度。

1.5.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄

利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,按說明書完成反轉(zhuǎn)錄。計算所加mRNA的量(2 000/RNA濃度)和水的量(7～2 000/RNA濃度);加入對應的mRNA和RNase-free water,再加入1 μL Anchored oligo(dT)18 primer,總體積為8 μL;混勻,放入65℃水浴5 min,取出后冰浴2 min;繼續(xù)加入10 μL 2× TS Reaction Mix,1 μL TransScript RT/RI Enzyme Mix,1 μL gDNA Remover,總體積為 20 μL;輕輕混勻,放入42℃水浴30 min后85℃加熱5 s。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物放-80℃保存。

1.6 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳

1.6.1 PCR擴增

PCR 反應體系(總體積 10 μL):3 μL ddH2O,5 μL 2× Taq PCR Master Mix,0.5 μL forward primer(10 μmol/L),0.5 μL reverse primer(10 μmol/L),1 μL DNA模板。PCR擴增程序設置:①95℃預變性5 min;② 95℃變性30 s;③ 55～60℃退火30 s;④72℃延伸1 min;⑤將②～④設置35個循環(huán);⑥72℃終延伸10 min。將PCR反應產(chǎn)物存于4℃冰箱備用。

1.6.2 瓊脂糖凝膠電泳

配制1.5%瓊脂糖凝膠(加入Gel Red核酸染料),取3 μL PCR產(chǎn)物注入樣品槽進行電泳。電泳緩沖液為 1×TAE,120 V恒壓,10～15 min。電泳結(jié)束后,用凝膠分析系統(tǒng)紫外燈觀察膠圖,檢測DNA是否成功提取,引物是否能夠擴增片段。

1.7 SSR引物合成及聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.7.1 SSR引物的選擇與合成

初定位結(jié)果顯示7號和9號染色體上均有基因型頻率的差異,在網(wǎng)頁http://archive.gramene.org/cmap/上尋找7號染色體19 830.36～20 025 kb區(qū)間的SSR標記和9號染色體2 453.62～22 902.05 kb區(qū)間的SSR標記,然后在http://archive.gramene.org/markers/上查找引物并進行化學合成。

1.7.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)表1配制20 mL 8%的 PAGE凝膠,將凝膠溶液灌入兩塊玻璃板之間,在電泳槽中加入1× TBE(10× TBE 稀釋10倍)緩沖溶液;注入1 μL的PCR反應產(chǎn)物,160 V電壓、200 mA電流電泳數(shù)小時后取下膠塊置于自來水中漂洗1 min;加入染色液(0.2 g AgNO3溶液于125 mL水中)置于搖床輕搖染色5 min;加入顯色液(6.25 mL的10%NaOH溶液、0.5 mL甲醛溶液加水定容至125 mL)至看到清晰的條帶;棄顯色液,觀察并拍照記錄,用于PCR產(chǎn)物的質(zhì)量分析。

表1 8%聚丙烯酰胺配方Table 1 Preparation of 8% polyacrylamide gel

1.8 候選基因的克隆和測序

在目標區(qū)間內(nèi)對候選基因進行精細定位。對7號染色體上篩選到的感溫不育基因的候選基因LOC_Os07g33380和LOC_Os07g33390進行擴增和序列測定。根據(jù)NCBI上獲取的CDS序列,用Primer 5.0軟件設計上述兩個候選基因的擴增引物(表2),擴增野生型材料和培矮64S近等基因不育株系中候選基因的序列,由武漢生工測序,然后比對核苷酸序列和氨基酸差異。

表2 候選基因測序所用引物Table 2 Primers used for sequencing of candidate genes

2 結(jié)果與分析

2.1 培矮64S及近等基因不育株系育性感溫性比較

在自然高溫條件下,各不育系材料的可染花粉率均為零(表3),說明這些材料都是高溫誘導不育類型。23.5℃條件下,對照不育系株1S的花粉可染率為零(圖1);培矮64S的花粉為低度可育(可染花粉率6.6%);培矮64S的40個近等基因系材料中p5-1S、p28-1S和p12S花粉的可染率為零,p3S、p5-2S的花粉可育性低于培矮64S(可染花粉率分別為1.4%和3.6%),其余材料的花粉可育性均高于培矮64S,其中p27S和p1S的可染花粉率高達80%以上。結(jié)果表明,利用培矮64S不育基因源可以選育出育性轉(zhuǎn)換的臨界溫度低于23.5℃的秈型不育系,從而提高制種安全性。

圖1 不同溫度條件下不育株系花粉可染率比較Fig.1 Comparison of pollen dyeability of sterile lines at different temperatures

表3 不同溫度條件下不育系花粉育性比較Table 3 Comparison of pollen fertility of male-sterile lines at different temperatures

2.2 近等基因不育系與培矮64S柱頭和花器性狀的比較

p5-1S、p28-1S和培矮64S的柱頭外露率沒有明顯的差異,但p5-1S的柱頭比培矮64S的大(圖2),表明p5-1S的柱頭更易接受異花授粉,有利于提高雜交制種產(chǎn)量[8～9]。

圖2 p5-1S、p28-1S和培矮64S柱頭和花器性狀的比較A、D和G:柱頭外露;B、E和H:花藥形態(tài);C、F和I:柱頭形態(tài)。Fig.2 Comparison of stigma and floral traits of p5-1S、p28-1S and Pei'ai 64SA,D and G:Stigma exsertion;B,E and H:Anther morphology;C,F and I:Stigma morphology.

2.3 培矮64S及近等基因不育系育性感溫基因的定位分析

培矮64S及近等基因系經(jīng)全基因組測序在7號染色體中部和9號染色體末端有基因型頻率差異,分別位于7號染色體上的19 830.36～20 025 kb(長 194.64 kb)和 9號染色體上的22 453.62～22 902.05 kb(長 448.43 kb)。

根據(jù)網(wǎng)頁上查找的7號染色體和9號染色體區(qū)間上的SSR引物,對培矮64S的育性感溫基因進行精細定位。7號染色體區(qū)間內(nèi)的8對SSR引物中RM21714沒有擴增帶。另外7對SSR引物擴增帶在培矮64S近等基因系中高溫不育單株和高溫可育單株的分布規(guī)律顯示:RGNM2661與基因不連鎖,RM21711、RM21712、RM21713、RM2-1715、RM21716和 RM21717分別檢測到了22、18、11、0、12 和 36個重組事件。其中,RM21715 被發(fā)現(xiàn)與育性感溫基因共分離(圖3和圖4)。因此,育性感溫基因被準確定位在第7號染色體上RM-21713和RM21715之間的8.9 kb區(qū)間內(nèi),該區(qū)間有兩個候選基因:LOC_Os07g33380和LOC_O-s07g33390。

圖3 7號染色體上育性感溫基因連鎖的分子標記以及重組事件的發(fā)生頻率R表示重組單株數(shù);×表示該SSR標記與基因不連鎖。Fig.3 The molecular markers of chromosome 7 and the frequency of recombinant events“R”indicates the number of recombinant plants,and“×”indicates that the SSR marker is not linked to the gene.

圖4 SSR標記RM21715對培矮64S近等基因系單株的標記基因型W1:野生型G283;W2:野生型G40;P:培矮64S近等基因系。Fig.4 Marker genotype of SSR marker RM21715 on a single plant of sterile line derived from Pei'ai 64SW1:Wild-type rice G283;W2:Wild-type rice G40;P:Pei'ai 64S near isogenic line.

PCR擴增9號染色體區(qū)間內(nèi)的19對SSR引物,結(jié)果顯示 RM2482、RM2848、RM2255、RM10-26、RM24825、RM24827、RM6797 這 7 對引物不可用。在22.46 Mb和22.88 Mb(0.42 Mb)的物理距離之間采用間隔法,選取了RM24824、RM205、RM24840、RM7586這4對SSR引物來分析培矮64S近等基因系中高溫不育單株和高溫可育單株,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RM205和RM7586與基因不連鎖。對RM24840和RM7586之間的兩個SSR標記RM-24844和RM24846進行分析,將候選區(qū)間縮至22.61 Mb和22.84 Mb(0.23 Mb)之間。再將RM2-4824、RM205、RM24840標記間 6個 SSR 標記全部進行分析,結(jié)果表明RM24827與基因不連鎖,其余的 5個 SSR標記 RM24825、RM6797、RM2-4832、RM24833 和 RM1013,分別檢測到了 0、0、0、0和17個重組事件(圖5)。該區(qū)間并未發(fā)現(xiàn)最大可能的連鎖標記,無法縮小置信區(qū)間。在RM24824和RM24833的164.2 kb區(qū)間內(nèi)有28個ORF,無法確定候選基因。需要在此區(qū)間內(nèi)增加SSR標記和擴大分析群體來進一步縮小區(qū)間,以最終確定候選基因的精細定位。

圖5 9號染色體上育性感溫基因連鎖的分子標記以及重組事件的發(fā)生頻率R表示重組單株數(shù);×表示該SSR標記與基因不連鎖。Fig.5 The molecular markers of chromosome 9 and the frequency of recombinant events“R”indicates the number of recombinant plants,and“×”indicates that the SSR marker is not linked to the gene.

2.4 育性感溫候選基因分析

根據(jù)RM21713和RM21715在基因組的物理位置,在國家水稻基因數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/gene/)7號染色體上檢索此物理區(qū)間內(nèi)的基因,發(fā)現(xiàn)這兩個標記之間有兩個候選基因LOC_Os07g33380和LOC_Os07g33390,這兩個候選基因的功能注釋分別是表達蛋白和BCS1蛋白。

2.4.1 LOC_Os07g33380的序列和編碼蛋白分析

對7個野生型和7個培矮64S近等基因不育株系單株的候選基因LOC_Os07g33380進行克隆測序以及核苷酸序列比對分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在外顯子的第748 bp的核苷酸處存在1個胞嘧啶C到胸腺嘧啶T(C→T)的堿基替換,這個堿基的替換導致脯氨酸(非極性)突變成絲氨酸(極性)(圖6),這個位點的變化是否引起基因功能的改變需進一步確認。

圖6 培矮64S近等基因不育株系育性感溫候選基因LOC_Os07g33380的序列分析(A)野生型與培矮64S近等基因不育株系的CDS序列比對結(jié)果;(B)野生型與培矮64S近等基因不育株系的氨基酸序列比對結(jié)果。Fig.6 Analysis of candidate gene LOC_Os07g33380 from Pei'ai 64S near-isogenic lines(A)Comparison of CDS sequences between the wild-type and Pei'ai 64S near-isogenic lines;(B)Comparison of the amino acid sequence between the wild-type and Pei'ai 64S near isogenic lines.

利用TMpred(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi?jobid=5BE04E6600000E164CE1D13-2&wait=20)對LOC_Os07g33380編碼的蛋白質(zhì)進行跨膜預測,結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)不是跨膜蛋白。同時,利用PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測分析野生型和培矮64S近等基因不育株系中LOC_Os07g33380基因編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構,結(jié)果表明,相對于野生型,培矮64S近等基因不育株系中多了一個α-螺旋和一段β折疊的氨基酸片段,并在40～60個氨基酸區(qū)間的兩個α-螺旋也有所差異,這些變化引起蛋白質(zhì)總體構象的改變,導致蛋白質(zhì)功能的改變或喪失。

2.4.2 LOC_Os07g33390的序列和編碼蛋白分析

對8個野生型和8個培矮64S近等基因不育株系單株的候選基因LOC_Os07g33390進行克隆測序以及核苷酸序列比對分析,結(jié)果顯示,培矮64S近等基因不育株系在外顯子的第154～163 bp的核苷酸處缺失9個堿基(CGGCGGCGG),第817～820 bp的核苷酸處缺失3個堿基(GTG),第490 bp的核苷酸處存在兩個堿基替換(AA→GG),第794 bp的核苷酸處也存在兩個堿基替換(AA→CG),第290 bp、第354 bp、第591 bp等的核苷酸處發(fā)生了1個堿基替換(圖7)。該候選基因的編碼區(qū)序列出現(xiàn)了多處堿基替換和缺失,導致氨基酸序列也發(fā)生了很大的變化,這些位點的變化引起基因功能的改變。

利用TMpred(http://www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi?jobid=5BE0516100000E16A1B7536-8&wait=20)對LOC_Os07g33390編碼的蛋白質(zhì)進行跨膜預測,結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)不是跨膜蛋白。利用 PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預測分析野生型和培矮64S近等基因不育株系中LOC_Os07g33390基因編碼的蛋白質(zhì)的二級結(jié)構,結(jié)果顯示培矮64S近等基因不育株系中該蛋白質(zhì)比野生型的少了多個α-螺旋和β折疊,導致蛋白質(zhì)功能改變或喪失,最終引起花粉不育。

3 討論

由于兩系雜交水稻具有配組自由、恢復源廣且有利于亞種間雜種優(yōu)勢的利用等優(yōu)點,從1990年開始兩系雜交水稻得到廣泛的應用[10]。其配組自由易于選配到強優(yōu)勢組合,育種程序簡化、育種周期縮短可以快速育成新的雜交水稻新品種,不育系類型豐富易于培育多樣化水稻品種,使其生產(chǎn)面積逐漸擴大,這是水稻雜種優(yōu)勢利用的主要途徑,對我國的糧食安全起到重要作用[11～12]。光溫敏核不育系是兩系雜交水稻應用的關鍵,盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了較多的光溫敏核不育材料,但比較重要的材料是光敏核不育材料農(nóng)墾58S和溫敏核不育材料安農(nóng)S-1[13]。對農(nóng)墾58S和安農(nóng)S-1等重要不育系進行轉(zhuǎn)育及相關處理,育成了多個光溫敏核不育系。如:用農(nóng)墾58S和培矮64作為親本,運用雜交和回交的方法選育出培矮64S[10];對安農(nóng)S-1/湘香B的后代進行多年選育,育成了低溫敏型兩用核不育系安湘S[13]等。

在制種過程中,外界氣溫波動會使這些不育系產(chǎn)生育性變化的風險[14],即低溫會使得部分不育系恢復育性,導致其無法應用于雜交制種,因此需要尋找育性轉(zhuǎn)換溫度低的不育系材料。但臨界溫度過低會導致不育系難以自交結(jié)實,因此需要選育“雙低”兩用不育系,即下限生理溫度和低臨界溫度的不育系,以保證不育系的制種安全[6,15]。阻礙雜交水稻制種產(chǎn)量增加的另一個因素是不育系異交結(jié)實率低[16]。不育系柱頭外露是限制雜交水稻制種異交結(jié)實率的關鍵[17]。楊保漢[18]發(fā)現(xiàn)自然條件下不育系柱頭外露率每提高1個百分點,其結(jié)實率可提高0.74～0.92個百分點,每公頃制種產(chǎn)量可增加47～68 kg。所以,本研究選育出的育性轉(zhuǎn)換溫度較低、柱頭大且外露率高的3個新型不育系水稻株系對于兩系法雜交水稻育種有著重要的意義。

目前,以溫敏核不育基因tms5在生產(chǎn)上應用較多,而以光敏核不育基因遺傳的農(nóng)墾58S應用較少,一是因為tms5基因遺傳模式簡單,易于選育新的不育系,而農(nóng)墾58S的不育系為多基因調(diào)控,選育新不育系難度大;二是tms5不育類型易于選育出不育臨界溫度低于23.5℃的不育系[19],而農(nóng)墾58S衍生的不育系育性最穩(wěn)定的是培矮64S,在23.5℃條件下仍有低度可育花粉。研究報道,溫度對光敏核不育系農(nóng)墾58S及衍生不育系的花粉育性都有一定影響[11],但其育性感溫性狀的遺傳規(guī)律和分子機制還未見報道。本研究對光敏核不育系農(nóng)墾58S及衍生不育系感溫性狀的分子機制進行了初步研究,定位了與育性感溫性關聯(lián)的兩個基因位點。序列比對分析表明,這兩個位點與Mei等[20]克隆的PMS3和Fan等[21]克隆的PMS1T位點均不重疊,提示新鑒定位點可能含有新的與水稻育性感溫性狀相關的基因。有關這兩個位點的基因及功能還需作進一步的深入研究。