急性肺損傷的早期預(yù)警信號(hào)研究

王麗萍,唐旭清

(江南大學(xué) 理學(xué)院,中國(guó)江蘇 無(wú)錫 214122)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是臨床上常見(jiàn)的健康問(wèn)題,是各種直接和間接致傷因素引起的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,可造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫,導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全,發(fā)展至嚴(yán)重階段(氧合指數(shù)＜200)被稱為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。在過(guò)去的20年里,ARDS的死亡率一直保持在40%左右[1]。目前,臨床上可使用的ALI/ARDS的標(biāo)志物很少[1],因此,獲得肺損傷患者的臨床生物學(xué)信息,發(fā)現(xiàn)新的靶點(diǎn)生物標(biāo)志物,對(duì)于有效治療疾病至關(guān)重要。

疾病的進(jìn)展是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程,Lesterhuis等[2]通過(guò)對(duì)比復(fù)雜疾病的動(dòng)態(tài)生物標(biāo)志物和靜態(tài)生物標(biāo)志物,發(fā)現(xiàn)在系統(tǒng)狀態(tài)中存在“臨界點(diǎn)”。Dahlem等[3]研究表明:在某一觸發(fā)因素下,“臨界點(diǎn)”會(huì)迅速進(jìn)入到疾病狀態(tài),所以可將臨界點(diǎn)視為復(fù)雜疾病的早期預(yù)警信號(hào)。一般來(lái)說(shuō),復(fù)雜疾病的進(jìn)展過(guò)程可以分為3個(gè)階段:正常狀態(tài)、疾病前狀態(tài)(或臨界狀態(tài))和疾病狀態(tài)。疾病前狀態(tài)是從正常狀態(tài)到疾病狀態(tài)的臨界狀態(tài),在此階段,如果采用適當(dāng)?shù)闹委熑钥梢曰謴?fù)到正常狀態(tài),且可以收集相關(guān)信息以獲取疾病的早期預(yù)警信號(hào)[4]。Chen等[4]提出了動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)生物標(biāo)志物(dynamic network biomarkers,DNB)的概念,發(fā)現(xiàn)在疾病前狀態(tài)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的1個(gè)子模塊代表疾病的信息行為,并推導(dǎo)出了基于網(wǎng)絡(luò)的3個(gè)動(dòng)態(tài)標(biāo)準(zhǔn)。生物標(biāo)志物是生物生理狀態(tài)的指標(biāo),通常用于檢查生物學(xué)或醫(yī)學(xué)中的器官功能或疾病狀態(tài)。大多數(shù)傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物[5～6]是根據(jù)疾病狀態(tài)和正常狀態(tài)之間信息的差異表達(dá)來(lái)識(shí)別,其目的是將疾病狀態(tài)與正常狀態(tài)區(qū)分開(kāi),而不是預(yù)測(cè)疾病狀態(tài)。確定臨界點(diǎn)或疾病前狀態(tài)的生物標(biāo)志物是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的一個(gè)重要挑戰(zhàn),除了可在網(wǎng)絡(luò)層面了解復(fù)雜疾病的分子機(jī)制之外,還可以盡早預(yù)防和治療疾病[7]。

前述DNB方法已被多個(gè)研究小組應(yīng)用于復(fù)雜疾病和生理過(guò)程的分析[8～11]。盡管該方法可以檢測(cè)復(fù)雜疾病的臨界狀態(tài),但在同一疾病狀態(tài)下需要多個(gè)樣本數(shù)據(jù),這限制了其臨床應(yīng)用。Liu等[12]提出的單樣本動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)生物標(biāo)志理論只需要1個(gè)病例樣本,將其他正常樣本作為參考樣本,更適用于臨床應(yīng)用。此外,Liu等[13]建立了單樣本“l(fā)andscape”動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)生物標(biāo)志物,其將單個(gè)樣本的分子網(wǎng)絡(luò)圖轉(zhuǎn)化為拓?fù)鋱D構(gòu)建的模型可用于預(yù)測(cè)疾病的早期預(yù)警信號(hào)。趙宏倩等[14]對(duì)乳腺癌數(shù)據(jù)的所有基因計(jì)算局部得分,并通過(guò)得分排序選取關(guān)鍵基因,沒(méi)有使用聚類(lèi)或其他啟發(fā)式算法。本文基于小鼠急性肺損傷的高通量表達(dá)數(shù)據(jù),采用單樣本動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)生物標(biāo)志物的方法構(gòu)建復(fù)合指標(biāo),檢測(cè)疾病的早期預(yù)警信號(hào),模塊化樣本特異性網(wǎng)絡(luò),最大化DNB得分,找出了疾病的臨界狀態(tài)。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)集

本研究的數(shù)據(jù)來(lái)自GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。根據(jù)以下3個(gè)篩選條件得到數(shù)據(jù)集GSE2565:1)來(lái)源于人體組織或動(dòng)物;2)具有多個(gè)時(shí)間序列的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù);3)同一時(shí)間節(jié)點(diǎn)既有患病樣本的數(shù)據(jù),也有正常樣本的數(shù)據(jù)作為參考。數(shù)據(jù)來(lái)源實(shí)驗(yàn)是將雄性小鼠全身暴露于空氣中或32 mg/m3的光氣中20 min,肺組織在暴露后0.5 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h、72 h 收集,以確定光氣暴露后基因表達(dá)的變化。每個(gè)采樣點(diǎn)有6個(gè)病例樣本和6個(gè)對(duì)照樣本[15]。使用R3.2.5(http://www.R-project.org/)對(duì)下載的數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理(矯正、標(biāo)準(zhǔn)化及表達(dá)值計(jì)算),共得到13 662個(gè)基因的表達(dá)數(shù)據(jù),利用Limma程序包[16]篩選每個(gè)時(shí)刻的差異表達(dá)基因用于后續(xù)分析。

1.2 方法

識(shí)別單個(gè)樣本的臨界狀態(tài)需要對(duì)照樣本組作為參考。通常,正常樣本可用作參考樣本,其表達(dá)譜可用作參考數(shù)據(jù)集,將參考樣本和病例樣本在每個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,可以提取單個(gè)樣本的信息。

1.2.1 構(gòu)建樣本特異性網(wǎng)絡(luò)

給定n個(gè)參考樣本,參考樣本數(shù)據(jù)中基因x和y之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation coefficient,記為P)可以計(jì)算為:

其中,xi和yi是第i個(gè)樣本中基因x和y的表達(dá)值,和是所有樣本中基因x和y的平均表達(dá)值,Pn(x,y)是n個(gè)參考樣本中兩個(gè)基因(x,y)之間的相關(guān)性。

將新的單個(gè)樣本s添加到參考樣本中后,可以基于總n+1個(gè)樣本通過(guò)等式(1)重新計(jì)算兩個(gè)基因之間的相關(guān)性(圖1A),記為Pn+1(x,y)。兩個(gè)特定基因(x,y)的單樣本相關(guān)性(記為sP)定義如下:

sP(x,y)是由添加到參考樣本中的新單個(gè)樣本引起的,因此它表征了該單個(gè)樣本與參考樣本的特定相關(guān)信息。由于P遵循正態(tài)分布,因此等式(2)中的sP同樣遵循具有n個(gè)共同樣本的差分正態(tài)分布,通過(guò)單樣本網(wǎng)絡(luò)理論[17]可以準(zhǔn)確評(píng)估sP的統(tǒng)計(jì)顯著性。具體地,可以通過(guò)等式(3)為每個(gè)sP計(jì)算“Z”分?jǐn)?shù),并且可以基于“Z”分?jǐn)?shù)從標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)累積分布近似地獲得每個(gè)sP的P值[18]。

通過(guò)等式(2)計(jì)算差異基因中所有基因?qū)χg的相關(guān)性sP,通過(guò)等式(3)評(píng)估其顯著性,如果它們的sP顯著,則認(rèn)為在兩個(gè)基因之間有邊緣連接。以差異基因?yàn)轫旤c(diǎn),sP的值作為連接邊的權(quán)重,構(gòu)建單個(gè)樣本特異性網(wǎng)絡(luò)(圖1B)。采用k-means聚類(lèi)算法將網(wǎng)絡(luò)分解為基于sP的多個(gè)模塊(圖1C)。

1.2.2 量化臨界狀態(tài)的復(fù)合指標(biāo)

s-DNB組內(nèi)基因的相關(guān)性可以建模為組內(nèi)成員之間成對(duì)sP絕對(duì)值的均值:

s-DNB組內(nèi)基因和組外其他基因的相關(guān)性可以建模為:

基于網(wǎng)絡(luò)分解的模塊,我們使用等式(7)來(lái)評(píng)估每一個(gè)模塊:

等式(7)就是依據(jù)系統(tǒng)接近臨界狀態(tài)時(shí)出現(xiàn)3種現(xiàn)象來(lái)構(gòu)造的[4]。根據(jù)等式(7)計(jì)算出來(lái)的指標(biāo)值是每個(gè)時(shí)刻每一個(gè)模塊的分值,選擇每個(gè)時(shí)刻得分最高的模塊作為當(dāng)前時(shí)刻的候選s-DNB(圖1D),并設(shè)置s-DNB的評(píng)分為α?；贒NB理論,所有時(shí)刻得分最高的點(diǎn)視為該樣本的臨界狀態(tài),該時(shí)刻對(duì)應(yīng)的候選s-DNB模塊為整個(gè)過(guò)程的s-DNB模塊。

圖1 識(shí)別單個(gè)樣本中候選s-DNB的算法流程圖(A)單個(gè)樣本基因相關(guān)性計(jì)算;(B)單個(gè)樣本特異性網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建;(C)聚類(lèi);(D)復(fù)合指標(biāo)計(jì)算。Fig.1 Algorithm flow chart for identifying candidate s-DNB in a single sample(A)Gene correlation calculation of a single sample;(B)Construction of a single sample-specific network;(C)Clustering;(D)Calculating composite indicators.

2 結(jié)果與分析

在每個(gè)采樣點(diǎn),對(duì)當(dāng)前時(shí)刻基因做差異分析,設(shè)置參數(shù)P為0.05,log2(FC)(FC:fold change)為0.5。8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別獲得了 53、135、721、896、439、475、714、625 個(gè)差異表達(dá)基因,取其并集共得到2 308個(gè)基因,差異基因的火山圖見(jiàn)圖2。通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行1.2中的操作,最終確定急性肺損傷的臨界狀態(tài)在8 h,由于個(gè)體差異,不同樣本的s-DNB不完全相同,根據(jù)試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)值,設(shè)置s-DNB的評(píng)分為α=4.0,分別得到6個(gè)病例樣本的s-DNB模塊。生物實(shí)驗(yàn)(GSE2565)發(fā)現(xiàn),最突出的生理影響發(fā)生在接觸后8 h內(nèi),肺水腫增加,最終存活率下降。在因氯化碳吸入引起急性肺損傷的小鼠中,12 h后觀察到50%～60%的死亡率,24 h后觀察到60%～70%的死亡率[15]。具體地,圖3顯示了復(fù)合指標(biāo)F的變化情況,6個(gè)病例樣本在臨界狀態(tài)的得分分別為6.333 3、5.853 7、5.294 6、5.739 5、4.592 8、4.979 8。從圖 3 可以看到,第 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(8 h)的值最大,且超過(guò)給定閾值4.0,表明基于s-DNB的預(yù)測(cè)與實(shí)際疾病發(fā)展一致。

圖2 差異基因的火山圖P＜0.05,log2(FC)＞0.5,紅色表示上調(diào)基因,藍(lán)色表示下調(diào)基因。Fig.2 Volcano map of differential genesP＜0.05,log2(FC)＞0.5,red means up-regulated genes,and blue means down-regulated genes.

圖3 復(fù)合指標(biāo)變化曲線橫坐標(biāo)表示肺組織暴露時(shí)間,縱坐標(biāo)表示復(fù)合指標(biāo),6條折線代表6個(gè)病例樣本復(fù)合指標(biāo)的變化情況。Fig.3 The changing curves of composite indicatorThe abscissa represents the lung tissue exposure time,the ordinate represents the composite index,and the six broken lines represent the changes in the composite indexes of six case samples.

s-DNB是代表疾病從正常狀態(tài)過(guò)渡到疾病狀態(tài)的重要網(wǎng)絡(luò),因此它們與發(fā)病機(jī)理中涉及的基因相關(guān)聯(lián)。本研究采用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID(https://david.abcc.ncifcrf.gov/)[19]中的 GO注釋和KEGG通路分析來(lái)研究s-DNB的生物功能行為。由于s-DNB模塊越大,包含的冗余基因可能越多,所以我們對(duì)個(gè)數(shù)為130的s-DNB模塊進(jìn)行了GO分析,發(fā)現(xiàn)所識(shí)別的s-DNB基因與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞趨化性、細(xì)胞增殖、調(diào)亡的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞黏附連接、氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān),具體見(jiàn)表1。文獻(xiàn)研究表明:細(xì)胞凋亡的失調(diào)在急性肺損傷和其他相關(guān)疾病的發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用[20～21];急性肺損傷是肺部炎癥反應(yīng)的廣泛表現(xiàn)[22]。KEGG通路分析結(jié)果顯示,s-DNB中的基因與細(xì)胞衰老、凋亡、免疫、氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān),具體見(jiàn)表2。文獻(xiàn)研究表明:內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的部分蛋白質(zhì)加工有助于肺纖維化的發(fā)生[23];p53通路基因在癌癥易感性位點(diǎn)中顯著富集,腫瘤易感基因通常在癌癥中發(fā)生突變[24]。

表1 GO功能分析Table 1 GO function analysis

表2 KEGG通路分析Table 2 KEGG pathway analysis

為了分析s-DNB的動(dòng)力學(xué)分子機(jī)制,我們進(jìn)一步構(gòu)建了s-DNB模塊的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)圖(圖 4)。PPI網(wǎng)絡(luò)從系統(tǒng)的角度論述了疾病的分子機(jī)制,網(wǎng)絡(luò)中包含104個(gè)s-DNB基因節(jié)點(diǎn)和300條相互作用關(guān)系。使用CytoHubba插件中的MCC(maximal clique centrality)算法計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的最大團(tuán)中心性,篩選出最大團(tuán)中心度排名前10 的關(guān)鍵基因:HSPA5(heat shock protein 5)、HSPA9(heat shock protein 9)、HSPA1A(heat shock protein 1A)、HSPA1B(heat shock protein 1B)、HSPB1(heat shock protein 1)、HSPB8(heat shock protein 8)、HSPH1(heat shock 105 kDa/110 kDa protein 1)、HSP90AA1[heat shock protein 90,alpha(cytosolic),class A member 1]、HSP90AB1[heat shock protein 90 alpha(cytosolic),class B member 1]、DNAJB1[DnaJ(Hsp40)homolog,subfamily B,member 1],這10個(gè)關(guān)鍵基因的熱圖展示見(jiàn)圖5,可以看到所選基因在病例樣本中的表達(dá)值均高于參考樣本的表達(dá)值,說(shuō)明這些基因在疾病的發(fā)展進(jìn)程中起著正調(diào)控的作用。

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖顏色表示節(jié)點(diǎn)度的變化,顏色越紅,度越大。Fig.4 PPI network diagramThe colors represent the change in the degree of nodes.The redder the color,the greater the degree.

圖5 10個(gè)關(guān)鍵基因在所有樣本中的熱圖Fig.5 Heatmap of 10 key genes in all samples

HSP90AA1和HSP90AB1同屬于HSP90家族,在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)降解和形態(tài)演變中具有關(guān)鍵作用[25]。HSPA5、HSPA9、HSPA1A和HSPA1B都是HSP70家族成員。HSPA5參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊和組裝,Shen等[26]發(fā)現(xiàn),HSPA5與ATF6相結(jié)合在響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)彼此分離,并通過(guò)抑制高爾基體定位信號(hào)和細(xì)胞分裂來(lái)保留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的ATF6,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激期間HSPA5的解離使ATF6可以轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體。HSPA9主要位于線粒體,也存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、質(zhì)膜和細(xì)胞質(zhì)囊泡中,在細(xì)胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)和線粒體維持中起作用。HSPA1A和HSPA1B又稱HSP70-1和HSP70-2,研究表明二者的同時(shí)消耗可抗癌細(xì)胞增殖[27]。Choi等[28]發(fā)現(xiàn)HSPB1可以抵抗細(xì)胞壓力,并與癌癥進(jìn)展和肺纖維化有關(guān);Li等[29]分析了HSPB1基因多態(tài)性與肺癌患者放射性損傷風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)HSPB1的RS2868371基因型可能與輻射引起的食道損害有關(guān)。HSPB8在多種癌癥中發(fā)揮作用:通過(guò)激活ERK-CREB途徑促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng),并可能成為胃癌患者的潛在預(yù)后因素[30];通過(guò)抑制磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途徑減少肝癌細(xì)胞的遷移[31];可以調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移[32]等。Liang等[33]的研究表明,用白介素-1β抗體或HSPH1抑制劑治療可減輕急性肺損傷大鼠的肺損傷;Lenna等[34]發(fā)現(xiàn)DNAJB1與肺動(dòng)脈高壓的嚴(yán)重程度(通過(guò)肺動(dòng)脈壓測(cè)量)呈正相關(guān)。這些已有的研究進(jìn)一步驗(yàn)證了我們方法的有效性。

3 結(jié)論

與一般生物標(biāo)志物相比,動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)生物標(biāo)志物更適合于表征系統(tǒng)狀態(tài)的轉(zhuǎn)移。本研究基于差異關(guān)聯(lián)的信息預(yù)測(cè)疾病狀態(tài),構(gòu)造用于量化單個(gè)樣本的早期預(yù)警信號(hào)。我們使用肺組織暴露在光氣和空氣中的小鼠急性肺損傷生物數(shù)據(jù),基于差異基因之間的差分皮爾遜相關(guān)系數(shù)構(gòu)建樣本特異性網(wǎng)絡(luò)并模塊化,根據(jù)系統(tǒng)達(dá)到臨界狀態(tài)分子網(wǎng)絡(luò)的3種變化構(gòu)建早期預(yù)警信號(hào),識(shí)別出了s-DNB模塊,找到了疾病的臨界點(diǎn)。指標(biāo)變化顯示,在8 h系統(tǒng)達(dá)到了臨界狀態(tài),這與原始數(shù)據(jù)[暴露后4～12 h,光氣暴露小鼠的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)水平明顯高于空氣暴露小鼠,且小鼠在接觸光氣8 h內(nèi),肺水腫增加,最終存活率下降]相吻合。針對(duì)關(guān)鍵基因的功能分析、PPI網(wǎng)絡(luò)分析、熱圖展示以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,都進(jìn)一步驗(yàn)證了我們方法的有效性。此外,文中用于檢測(cè)臨界狀態(tài)的s-DNB評(píng)分的閾值是本研究中的經(jīng)驗(yàn)值,但它對(duì)結(jié)果沒(méi)有顯著影響。由于個(gè)體差異性,同一疾病的每個(gè)個(gè)體都有不同的DNB,要確定每種疾病所有個(gè)體的共同臨界閾值可能需要整個(gè)群體的數(shù)據(jù),以系統(tǒng)有效的方式識(shí)別s-DNB閾值是我們未來(lái)的重要工作。