蠟樣芽孢桿菌主要毒素及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展

楊艷華,呂 鵬,陳克平

(江蘇大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,中國(guó)江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是一種在自然界中廣泛分布的β溶血性桿狀細(xì)菌,屬于芽孢桿菌屬、革蘭氏陽(yáng)性菌,經(jīng)常在土壤和食物中被發(fā)現(xiàn),在灰塵和污水中也可被分離鑒定。該菌大小為(1.0～1.2)μm × (3.0～5.0)μm,菌體桿狀,表面粗糙、扁平、不規(guī)則,能夠在8～50℃的環(huán)境條件下生存,但在低溫條件下生長(zhǎng)較為緩慢。蠟樣芽孢桿菌屬于好氧型細(xì)菌,在特殊的環(huán)境條件下也能兼性厭氧生存,能形成熱穩(wěn)定的內(nèi)生孢子[1]。芽孢具有高度耐熱、耐有毒化學(xué)物質(zhì)、耐UV射線、耐γ射線以及其他不利環(huán)境因素的特性,內(nèi)生孢子的這些特點(diǎn)決定了它能夠廣泛存在于米飯、牛奶、肉類(lèi)、新鮮蔬菜、海鮮等食物中[2]。蠟樣芽孢桿菌是引發(fā)食源性腸道類(lèi)疾病的一個(gè)主要病原微生物,對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅,包括家畜和野生動(dòng)物[3～7]。蠟樣芽孢桿菌引起食物中毒的主要癥狀分為腹瀉或嘔吐[8]。此外,該菌還涉及許多嚴(yán)重并且可能致命的非胃腸道感染,例如嚴(yán)重的眼部感染、骨髓炎、肝炎和炎癥反應(yīng)[9～10],甚至導(dǎo)致死亡[11]。因此,快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌是控制食品污染和感染后治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文概述了蠟樣芽孢桿菌主要毒素的基本情況及檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,旨在為研究人員開(kāi)展相關(guān)工作提供一定的借鑒和參考。

1 蠟樣芽孢桿菌的主要毒素

蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生多種毒素,根據(jù)其引起食物中毒的癥狀可分為致嘔吐型腸毒素和致腹瀉型腸毒素。污染食品的蠟樣芽孢桿菌可以通過(guò)產(chǎn)生這些毒素造成食物中毒。因此,蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素引起廣泛的關(guān)注。

1.1 致嘔吐型腸毒素

致嘔吐型腸毒素(cereulide)主要引起惡心、嘔吐的癥狀,其中毒可在兒童和老年人中表現(xiàn)出嚴(yán)重或致命的癥狀[12～13]。17歲瑞士男孩和7歲比利時(shí)女孩致死性的食物中毒均被鑒定由cereulide毒素引起,這種毒素會(huì)引起兒童惡心、嘔吐和肝功能衰竭[14]。Cereulide可在各器官中聚集[15],導(dǎo)致線粒體毒性,并伴有肝毒性、腦病和β細(xì)胞功能異常等臨床并發(fā)癥[14,16]。

Cereulide的結(jié)構(gòu)為[D-O-Leu-D-Ala-D-OVal-D-Val]3,是一種通過(guò)非核糖體途徑合成的十二環(huán)形多肽,其環(huán)形結(jié)構(gòu)使cereulide能夠抵抗各種惡劣環(huán)境,表現(xiàn)出熱穩(wěn)定性(150℃,60 min,pH＜9.5)、酸堿穩(wěn)定性(pH 2～11)以及對(duì)蛋白酶(如胰蛋白酶)的穩(wěn)定性等[17～18]。Cereulide 由 pBCE 質(zhì)粒上的ces基因簇合成,ces基因簇由cesA、cesB、cesC、cesD、cesH、cesP和 cesT 構(gòu)成[19～20]。其中,cesA/cesB的NADPH親和性對(duì)多肽的形成具有重要作用[21];cesC/cesD編碼ABC轉(zhuǎn)移體,對(duì)cereulide毒素的合成和運(yùn)輸起到一定的促進(jìn)作用[22];cesH編碼31 kD的水解酶,該水解酶屬于α/β水解酶家族,可用自身的啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá);cesP編碼磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(phosphopantetheinyl transferase,PPTase),主要參與非核糖體合成途徑的起始。研究表明,pBCE質(zhì)粒編碼的cesH水解酶可能負(fù)調(diào)節(jié)ces基因簇的合成;染色體基因Ppt chr和pBCE質(zhì)?；騝esP合成的PPTase均對(duì)cereulide的起始合成起促進(jìn)作用[23]。

Cereulide引發(fā)嘔吐的機(jī)制目前尚不完全清楚,已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)cereulide為纈氨霉素類(lèi)似物,具有與纈氨霉素一樣強(qiáng)的鉀離子載體特性[17]。Cereulide具有較高的疏水性,能夠通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行擴(kuò)散,并且對(duì)鉀離子具有很高的親和力,這兩個(gè)特點(diǎn)使其成為最佳的離子載體,可破壞細(xì)胞膜的電化學(xué)梯度。研究證實(shí),cereulide的毒性作用正是由于它是一種鉀離子載體,它是第一個(gè)被證明與食物中毒有關(guān)的非蛋白質(zhì)離子載體[24]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),2 nmol/L的cereulide可以阻止HepG2細(xì)胞的增殖[25],cereulide也可以引起HEp-2細(xì)胞的空泡化[26]。當(dāng)前,一般利用HEp-2細(xì)胞、鼠肝細(xì)胞和野豬精子運(yùn)動(dòng)性分析等方法檢測(cè)cereulide毒素的生物活性[27～28]。有文獻(xiàn)指出,可利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蠟樣芽胞桿菌cereulide毒素的快速檢測(cè)[29]。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,cereulide的檢測(cè)將會(huì)更為快捷、方便。

1.2 致腹瀉型腸毒素

腹瀉與一系列腸毒素有關(guān),包括溶血性腸毒素BL(hemolysin BL,Hbl)、非溶血性腸毒素(nonhaemolytic enterotoxin,Nhe)、細(xì)胞毒素K(cytotoxin K,CytK)和腸毒素FM(enterotoxin FM,EntFM)[20,30],以及潛在的腸毒素溶血素Ⅱ(enterotoxin hemolysin Ⅱ,HlyⅡ)和腸毒素 T(enterotoxin T,BceT)[31]。其中,Hbl、Nhe和CytK是引起腹瀉型食物中毒的3種主要毒素[32～33]。Hbl和Nhe均由3個(gè)亞基組成[32],而細(xì)胞毒素CytK由單一蛋白質(zhì)組件構(gòu)成,能夠引起細(xì)胞毒性[34]。上述3種毒素的致病機(jī)制目前尚不完全清楚,一般認(rèn)為是由于毒素可在細(xì)胞膜上形成孔洞,細(xì)胞膜上的孔洞造成細(xì)胞內(nèi)的鈉離子和氯離子流失,使細(xì)胞電位失去平衡。腹痛、腹瀉的癥狀多在攝入污染的食物8～16 h后發(fā)生,持續(xù)時(shí)間為12～24 h[35]。這種食物中毒主要由污染的牛奶、奶制品、蔬菜引起。不同蠟樣芽孢桿菌菌株含有不同的毒素基因,其致病性也不相同[36～37]。

1.2.1 溶血性腸毒素(Hbl)

Hbl最初從術(shù)后病人傷口分離出的蠟樣芽孢桿菌菌株F837/76中分離得到,其由HblB、L1和L2三個(gè)蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成,它們的產(chǎn)生和分泌獨(dú)立進(jìn)行,相對(duì)分子質(zhì)量分別為37.5 kD、38.2 kD和43.5 kD,只有3種亞基同時(shí)存在時(shí),Hbl才能產(chǎn)生最大的細(xì)胞毒性[38]。HblB、L1和L2亞基分別由hblA、hblD和hblC基因編碼,它們的操縱子相同,編碼順序依次為hblC、hblD和hblA[39]。三種蛋白質(zhì)亞基按一定的順序結(jié)合到細(xì)胞膜上,依次為HblB、L1和L2。當(dāng)用對(duì)應(yīng)的單克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)時(shí),通常會(huì)出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量相差不大的兩條帶,這可能是由于各組件產(chǎn)生了同源異型的變構(gòu)。Hbl復(fù)合體中的HblB組件包含一個(gè)長(zhǎng)的α-螺旋束和α/β頭部的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)同大腸桿菌毒素蛋白細(xì)胞溶血素A(cytolysin A,ClyA)的結(jié)構(gòu)極其相似,說(shuō)明它們可能具有相似的作用機(jī)制,可使細(xì)胞膜形成孔洞[40]。

hbl基因的表達(dá)由PlcR蛋白調(diào)節(jié),該蛋白質(zhì)通過(guò)與特定序列的結(jié)合調(diào)節(jié)hbl操縱子的表達(dá)。plcR基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在穩(wěn)定期,而在孢子形成期可被孢子形成因子Spo0A抑制[41]。三種蛋白質(zhì)亞基的氨基酸序列分析結(jié)果表明,它們的末端氨基酸均含有信號(hào)肽序列,說(shuō)明其通過(guò)一般分泌(Sec)途徑進(jìn)行分泌[33]。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,Hbl能引起細(xì)胞膜的裂解,使血脂平板產(chǎn)生溶血現(xiàn)象[35]。Hbl溶血活性的強(qiáng)弱與3種亞基的分子數(shù)目相關(guān),只有當(dāng)HblB亞基的相對(duì)分子質(zhì)量高于HblL1和HblL2的相對(duì)分子質(zhì)量時(shí),Hbl才具有最強(qiáng)的溶血活性。此外,Hbl對(duì)不同細(xì)胞系呈現(xiàn)不同的細(xì)胞毒性,并且其毒性可以通過(guò)HblB亞基的抗體中和而降低[42]。已有研究證實(shí),3種蛋白質(zhì)亞基構(gòu)建成的無(wú)毒性融合蛋白所制備的抗體可用于Hbl毒素的檢測(cè)[43]。

1.2.2 非溶血性腸毒素(Nhe)

Nhe是蠟樣芽孢桿菌的另外一種毒素,最早在1995年挪威發(fā)生的一場(chǎng)嚴(yán)重的食物中毒事件中被分離鑒定,引起該食物中毒事件的蠟樣芽孢桿菌為NVH0075/95菌株[44]。Nhe由 NheA、NheB、NheC 3種蛋白質(zhì)亞基組成,其相對(duì)分子質(zhì)量依次為41 kD、39.8 kD和36.5 kD;它們分別由nheA、nheB、nheC基因編碼,并且由相同的操縱子調(diào)控。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),NheA、NheB和NheC的末端氨基酸均含有信號(hào)肽序列,說(shuō)明它們通過(guò)Sec途徑進(jìn)行分泌,但3種蛋白質(zhì)亞基以獨(dú)立的方式分泌到細(xì)胞外[33]。Nhe和Hbl具有序列同源性,而HblB與ClyA具有較高的結(jié)構(gòu)相似性,因此Nhe對(duì)來(lái)自不同物種的紅細(xì)胞也具有溶血活性;由于共同的結(jié)構(gòu)和功能特性,Hbl/Nhe和ClyA家族的毒素可能構(gòu)成一個(gè)成孔細(xì)胞毒素的超家族[45]。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,Nhe對(duì)多種細(xì)胞存在細(xì)胞毒性,但對(duì)不同細(xì)胞系的細(xì)胞毒性不同。Nhe可在細(xì)胞質(zhì)膜表面形成孔洞,導(dǎo)致上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞的裂解,進(jìn)而造成食物中毒。Nhe通過(guò)其單一組分NheA、NheB和NheC的有序結(jié)合對(duì)Vero和CaCo-2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性,它們的結(jié)合順序依次為NheC、NheB 和NheA[46]。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng) NheA、NheB、NheC 3種蛋白質(zhì)亞基的摩爾濃度比為10∶10∶1時(shí),其對(duì)Vero細(xì)胞的毒性最強(qiáng);增加NheC蛋白組分的濃度,則降低其細(xì)胞毒性;如果將等摩爾濃度的NheC添加到含有NheA和NheB的溶液中,則會(huì)完全抑制其細(xì)胞毒性[38]。當(dāng)用NheB蛋白的單克隆抗體去除NheB蛋白或通過(guò)加入與NheB相互作用的化合物時(shí),Nhe的細(xì)胞毒性幾乎完全喪失[42]。上述結(jié)果表明,NheB蛋白組件在Nhe引起的細(xì)胞毒性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,過(guò)高的NheC蛋白組件濃度則降低細(xì)胞毒性,其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

1.2.3 細(xì)胞毒素K(CytK)

CytK最初從蠟樣芽孢桿菌菌株391-98中分離出來(lái),該菌株引起嚴(yán)重的食物中毒,并造成3人死亡[34]。CytK由單一蛋白質(zhì)組件構(gòu)成,其相對(duì)分子質(zhì)量為34 kD,具有高度細(xì)胞毒性,同時(shí)也具有壞死性和溶血性,能夠在脂質(zhì)雙層中形成孔洞。CytK蛋白由cytK基因編碼,該基因啟動(dòng)子區(qū)存在PlcR的識(shí)別位點(diǎn),PlcR通過(guò)結(jié)合到PlcR-box調(diào)節(jié)cytK基因的表達(dá)[34]。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),CytK與金黃色葡萄球菌的白血球素、γ-溶血素和α-溶血素,產(chǎn)氣莢膜梭菌的β-毒素,以及蠟樣芽孢桿菌的溶血素Ⅱ相似,均屬于β-桶成孔毒素家族;此外,CytK對(duì)人腸上皮細(xì)胞具有高毒性,并可能導(dǎo)致壞死性腸炎[47]。

Fagerlund等[30]研究發(fā)現(xiàn),CytK-1與其變體CytK-2具有很高的序列同源性,CytK-1和CytK-2蛋白之間的差異主要集中在某些區(qū)域;在細(xì)胞水平上,CytK-1對(duì)Vero和Caco-2細(xì)胞具有較高的細(xì)胞毒性;CytK-2具有溶血性,并且對(duì)人腸道Caco-2細(xì)胞和Vero細(xì)胞具有毒性,但其毒性約為CytK-1的20%;CytK蛋白的細(xì)胞毒性是由于其能在上皮細(xì)胞形成孔洞,使細(xì)胞外液流入細(xì)胞,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CytK蛋白的末端氨基酸含有信號(hào)肽序列,說(shuō)明它也通過(guò)Sec途徑進(jìn)行分泌[33]。

1.2.4 其他腹瀉型腸毒素

與3種主要致腹瀉型腸毒素Hbl、Nhe和CytK相比,腸毒素EntFM、HlyⅡ和BceT為潛在的腹瀉型毒力因子[48]。EntFM含有1個(gè)NlpC/P60結(jié)構(gòu)域,具有細(xì)胞壁肽酶的特征。該蛋白質(zhì)涉及細(xì)菌的形狀、運(yùn)動(dòng)性以及上皮細(xì)胞的黏附、生物膜的形成、巨噬細(xì)胞的空泡化和毒力等,但是關(guān)于其毒性的研究相對(duì)較少[49]。HlyⅡ?yàn)楣丫郐?桶成孔毒素,不耐熱,對(duì)蛋白水解酶比較敏感,與金黃色葡萄球菌的α-毒素或產(chǎn)氣莢膜梭菌的β-毒素有關(guān)[2]。毒素基因bceT含有1個(gè)開(kāi)放閱讀框,其編碼的多肽由336個(gè)氨基酸組成。該基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出Vero細(xì)胞毒性,并且在血管通透性實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性;同時(shí),其在結(jié)扎的小鼠回腸環(huán)中可引起液體積聚,注射后對(duì)小鼠具有致死性[50]。

總的來(lái)說(shuō),腹瀉型腸毒素復(fù)合物的細(xì)胞毒性占蠟樣芽孢桿菌總毒性的90%以上。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,Vero和原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)對(duì)Nhe最敏感,HepG2、Vero和A549細(xì)胞系對(duì)Nhe和Hbl高度敏感;在大多數(shù)細(xì)胞系中,Nhe和Hbl對(duì)細(xì)胞毒性的貢獻(xiàn)大致相同(40%～60%),但是,在HUVEC細(xì)胞中Nhe的相對(duì)活性約為90%,在A549細(xì)胞中Hbl的相對(duì)活性約為75%;CytK對(duì)CaCo-2表現(xiàn)出最高的細(xì)胞毒性[51]。

2 蠟樣芽孢桿菌的流行情況

在中國(guó),涉及蠟樣芽孢桿菌的食源性疾病通常通過(guò)乳制品或乳制品來(lái)源的食物發(fā)生[7,52～57]。中國(guó)是人口大國(guó),液態(tài)奶和奶粉的消費(fèi)量較大,特定的市場(chǎng)需求和生理差異造成了蠟樣芽孢桿菌在中國(guó)的流行。2011—2016年在中國(guó)主要城市進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果顯示,蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于巴氏消毒奶中,大約27%的巴氏消毒奶含有蠟樣芽孢桿菌[53]。報(bào)告顯示,分離出的100個(gè)蠟樣芽孢桿菌菌株分布于香港、廣州、深圳、哈爾濱、寧夏、北海、?？诘瘸鞘谢蚴》?。總的來(lái)說(shuō),中國(guó)南方乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染率相對(duì)低于北方地區(qū),其在中國(guó)北方的污染率為31%,在南方的污染率為25%。例如,遼寧省嬰兒配方奶粉中蠟樣芽孢桿菌的污染率為42%,而云南省嬰兒配方奶粉中蠟樣芽孢桿菌的污染率僅為12%[53]。其他省份或地區(qū),如北京、遼寧、甘肅、云南和東北地區(qū),蠟樣芽孢桿菌的污染率分別為30%、27%、19%、10%和16%[54,58～59]。2012—2013 年和 2015 年發(fā)布的兩份關(guān)于中國(guó)市場(chǎng)嬰兒配方奶粉的調(diào)查報(bào)告表明,蠟樣芽孢桿菌的陽(yáng)性率分別為14%和42%[7,60]。Zhuang等[61]調(diào)查發(fā)現(xiàn),中國(guó)嬰兒配方奶粉樣品中蠟樣芽孢桿菌的污染率為8.2%。我國(guó)乳制品中蠟樣芽孢桿菌毒素基因的種類(lèi)及其檢測(cè)情況詳見(jiàn)表1。其他國(guó)家或地區(qū)同樣也存在蠟樣芽孢桿菌的流行情況。美國(guó)的一項(xiàng)全國(guó)性調(diào)查表明,202份生鮮混合牛奶樣本中蠟樣芽孢桿菌的陽(yáng)性率為8.9%[62],德國(guó)巴伐利亞測(cè)試的冰淇淋中蠟樣芽孢桿菌的檢出率高達(dá)62.7%,而墨西哥銷(xiāo)售的手工奶酪中蠟樣芽孢桿菌的檢出率為28.4%[63]。比較而言,非洲國(guó)家由于衛(wèi)生條件較差,其乳制品更易受到蠟樣芽孢桿菌的污染。此外,米飯、涼皮、肉類(lèi)及肉制品、即食蔬菜等其他食品中蠟樣芽孢桿菌的污染也不容樂(lè)觀,并對(duì)人類(lèi)健康造成嚴(yán)重威脅[64～67]。因此,世界各國(guó)均迫切需要解決其境內(nèi)蠟樣芽孢桿菌的污染問(wèn)題。

表1 我國(guó)乳制品中芽孢桿菌毒素基因的種類(lèi)及檢測(cè)情況Table 1 The positive rate of toxin genes in Bacillus samples from dairy products in China

3 蠟樣芽孢桿菌的主要檢測(cè)方法

3.1 傳統(tǒng)方法

傳統(tǒng)的蠟樣芽孢桿菌孢子或細(xì)胞檢測(cè)方法包括:平板計(jì)數(shù)法、免疫學(xué)方法和液質(zhì)聯(lián)用法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS;LCMS/MALDI-TOF)。平板計(jì)數(shù)法使用ISO7932標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)和檢測(cè),但該方法無(wú)法說(shuō)明細(xì)菌產(chǎn)生毒素的能力,也不能將蠟樣芽孢桿菌與芽孢桿菌菌群中的其他細(xì)菌真正區(qū)分開(kāi)來(lái),因而具有一定的局限性[68]。免疫學(xué)方法可針對(duì)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、芽孢和毒素的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),包括鞭毛、細(xì)胞表面抗原及NheA、NheB、NheC、HblL1和HblL2等蛋白質(zhì)[69～70]。酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)通過(guò)靶向特異性單克隆抗體,直接從蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的毒性成分。這種單克隆抗體能夠純化NheB和NheB/C復(fù)合物等毒素,并中和細(xì)胞毒性,如抗NheB組分的單克隆抗體能夠中和Nhe的細(xì)胞毒性(高達(dá)98%)[70～71]。液相色譜-質(zhì)譜分析(LCMS/MALDI-TOF)通常用于快速檢測(cè)嘔吐食品中的芽孢桿菌分離物[7,72～73]。質(zhì)譜技術(shù)主要是通過(guò)細(xì)菌組分所擁有的特異峰圖進(jìn)行菌種鑒定,該方法可用于菌種特異性的鑒定[74]。隨著細(xì)菌質(zhì)譜鑒定數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步完善,質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用也變的越來(lái)越簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確。相關(guān)報(bào)告顯示,從細(xì)菌提取物中鑒定出的cereulide在m/z 1 191處達(dá)到峰值,檢測(cè)限(limit of detection,LOD)為 30 ng/mL[29]。

3.2 PCR和LAMP法

PCR基因序列分析法包括普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)、多重PCR(multiplex PCR,mPCR)、微滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR,ddPCR)和交叉引物擴(kuò)增法(crosspriming amplification,CPA)[75]等,該方法主要通過(guò)靶向 16S rRNA[76]、groEL/gyrB[77]和 panC[78]等基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR或交叉引物擴(kuò)增法等,對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌株進(jìn)行鑒定或分析。其中,普通PCR、RT-PCR、mPCR是通過(guò)檢測(cè)毒素基因來(lái)鑒定蠟樣芽孢桿菌的主要分析技術(shù)[7]。普通PCR操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短,但是檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性較低,需要進(jìn)一步驗(yàn)證。與普通PCR相比,mPCR更加靈敏、快速、準(zhǔn)確,mPCR可以同時(shí)檢測(cè)同源性較高的芽孢桿菌菌群中的菌株,對(duì)于病原菌的檢測(cè)也更為便捷[79～80]。RT-PCR的擴(kuò)增和檢測(cè)一步完成,檢測(cè)周期短,且特異性強(qiáng)、靈敏度高、假陽(yáng)性低。同時(shí),RTPCR既可以定性也可以定量,能更有效解決PCR的污染問(wèn)題,因而應(yīng)用更為廣泛[80]。研究人員將疊氮溴化丙錠染料和RT-PCR技術(shù)結(jié)合,該方法能有效區(qū)分死菌和活菌。與RT-PCR相比,ddPCR檢測(cè)不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以有效減小誤差,該方法適用于低濃度樣本的檢測(cè),靈敏度和穩(wěn)定性更高。美中不足的是,ddPCR定量的范圍小,不適合高豐度樣本的檢測(cè),并且價(jià)格昂貴、耗時(shí)[80～81]。事實(shí)上,牛奶中通常含有較低濃度的孢子,在進(jìn)行PCR分析檢測(cè)之前需要進(jìn)行耗時(shí)的微生物富集步驟。此外,牛奶中含有的高濃度離子和脂肪已被證實(shí)能抑制RT-PCR。另一種核酸擴(kuò)增技術(shù)是環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),該方法在等溫環(huán)境下工作,可用于蠟樣芽孢桿菌的快速、定點(diǎn)和便攜式檢測(cè)[82～83]。旋轉(zhuǎn)反應(yīng)芯片(rotate and react SlipChip,RnR-Slip-Chip)借助LAMP技術(shù)被開(kāi)發(fā)用于同時(shí)檢測(cè)包括蠟樣芽孢桿菌在內(nèi)的多種細(xì)菌病原體[84],該方法進(jìn)樣后通過(guò)一步旋轉(zhuǎn)使靶菌與芯片上的3種試劑立即混合并反應(yīng),60 min內(nèi)可直接觀察識(shí)別,成功率達(dá)100%。但是,這項(xiàng)技術(shù)能否同時(shí)適用于蠟樣芽孢桿菌孢子的檢測(cè)尚有待進(jìn)一步研究。

3.3 生物傳感器

近年來(lái),基于生物傳感器和納米技術(shù)的新方法因其簡(jiǎn)單、靈敏和快速而受到廣泛關(guān)注。當(dāng)前,能夠有效并且特異性地靶向細(xì)菌孢子的識(shí)別元件(例如抗體、適體)數(shù)量相對(duì)較少,因此生物傳感器的開(kāi)發(fā)尚處于起步階段[68]。與其他方法相比,電化學(xué)生物傳感器因成本低、靈敏度高并且易于小型化而發(fā)展較為迅速[85～87]。Mazzaracchio 等[88]開(kāi)發(fā)了一種無(wú)標(biāo)記的阻抗式DNA適體傳感器,其蠟樣芽孢桿菌的檢出限為3×103CFU(colony-forming unit)/mL,線性范圍為 104～5×106CFU/mL,該傳感器的選擇性好,被證實(shí)具備檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的能力。表面等離子體共振(surface plasmon resonance,SPR)是一種靈敏的無(wú)標(biāo)記微生物檢測(cè)方法。Kong等[89]利用噬菌體內(nèi)溶素修飾的SPR芯片檢測(cè)了蠟樣芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞,其檢測(cè)限為102CFU/mL,該方法采用消減抑制試驗(yàn)提高了SPR傳感器檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌孢子的敏感性。當(dāng)前,研究人員需要加速開(kāi)發(fā)更加靈敏、快速和高特異性的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)新技術(shù)、新方法,以提高蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)能力和準(zhǔn)確性。

另外,還有其他方法可用于蠟樣芽孢桿菌及其毒素基因的檢測(cè),由于篇幅限制這里不再一一闡述。為便于理解,表2列出了蠟樣芽孢桿菌及其毒素基因檢測(cè)的主要方法及相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)。

表2 蠟樣芽孢桿菌及其毒素基因的檢測(cè)方法Table 2 Detection methods of B.cereus and its toxin genes

4 結(jié)論和展望

隨著生活水平的提高,人們的食品安全意識(shí)和對(duì)優(yōu)質(zhì)食品的需求顯著提高。然而,蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件仍時(shí)有發(fā)生[7,68]。蠟樣芽孢桿菌是一種產(chǎn)生內(nèi)生孢子的病原體,可引起食物中毒,癥狀為嘔吐和腹瀉,其排出的毒素也是損害肝組織和炎癥性疾病(如胃腸炎和腦膜炎)的主要元兇[8,90]。蠟樣芽孢桿菌的毒力因子在細(xì)胞毒性中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,了解蠟樣芽孢桿菌及其毒素在細(xì)胞水平上的作用將有助于預(yù)防芽孢桿菌感染。在過(guò)去的幾十年里,雖然科研人員為確保食品安全付出了艱辛的努力,但我國(guó)乳制品中蠟樣芽孢桿菌的污染仍然是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題。另一方面,無(wú)毒性的蠟樣芽孢桿菌可作為藥物用于改善腸道微環(huán)境,因而作為人類(lèi)的益生菌被利用,并且這一領(lǐng)域正受到越來(lái)越多的關(guān)注[91～93]。但是,有毒性的蠟樣芽孢桿菌因攜帶各種毒素或抗生素耐藥性的基因而可能給人類(lèi)帶來(lái)嚴(yán)重的健康風(fēng)險(xiǎn)。與其他致病菌相比,蠟樣芽孢桿菌因其內(nèi)生孢子的高傳遞性、高活力和高耐受性而具有更高的風(fēng)險(xiǎn)[7,93～95]。此外,蠟樣芽孢桿菌因可與其宿主細(xì)胞持續(xù)相互作用而難以控制。傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法耗時(shí)、效率低、靈敏度偏低。近年來(lái),研究人員開(kāi)發(fā)了基于分子生物學(xué)和生物傳感器的新方法,如LAMP、電化學(xué)生物傳感器和表面離子共振等。盡管新的便攜式檢測(cè)方法相比目前使用的方法更具優(yōu)勢(shì),但該方法不易實(shí)現(xiàn),因而只有少數(shù)幾種方法可商業(yè)化?？偟膩?lái)講,我們要充分認(rèn)識(shí)蠟樣芽孢桿菌的危害,了解其毒性因子的致病機(jī)制,盡快開(kāi)發(fā)高效、快速、準(zhǔn)確的蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)的新方法、新技術(shù),盡量將其危害降低到最低水平,以保障人們的生命安全。