仔豬腹瀉病原菌分離及其防治

林松泉

（廈門(mén)惠盈動(dòng)物科技有限公司，福建 廈門(mén) 361023）

新生仔豬黃、白痢是一種常見(jiàn)的細(xì)菌性疾病，主要是由大腸桿菌引起的，其發(fā)病率與死亡率較高[1-2]，尤其在冬季及早春時(shí)期，更容易暴發(fā)，該病已成為影響我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的因素之一[3]。在福建某養(yǎng)豬場(chǎng)，剛出生仔豬突發(fā)腹瀉、死亡的情況，表現(xiàn)為腹瀉，排出黃色或黃白色的稀糞或水樣糞，且該病具有傳染性。發(fā)病主要為1～3日齡的仔豬，在發(fā)病的2～4 d出現(xiàn)死亡，且死亡率高。通過(guò)解剖觀察，可見(jiàn)小腸充血，內(nèi)有黃色液狀內(nèi)容物，脹氣。

在國(guó)內(nèi)關(guān)于仔豬腹瀉防治的相關(guān)報(bào)道較多，但多數(shù)主要是采用磺胺嘧啶[4]、抗生素類(lèi)藥物[5-6]來(lái)治療，而采用益生菌“以菌治菌”的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)小腸內(nèi)容物及稀糞進(jìn)行病原菌分離、鑒定，并進(jìn)行藥物敏感性及益生菌抑制試驗(yàn)，為防治仔豬腹瀉提供理論依據(jù)，并分析益生菌制劑替代抗生素的可行性，為畜禽養(yǎng)殖業(yè)往無(wú)抗、減抗發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料及方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 發(fā)病仔豬稀糞及小腸內(nèi)容物。福建某發(fā)病豬場(chǎng)無(wú)菌收集腹瀉仔豬新鮮糞便、抽取剖檢仔豬小腸內(nèi)容物，低溫保存。

1.1.2 試驗(yàn)菌株?？莶菅挎邨U菌GDM1.372（Bacillus subtilis）、 地 衣芽孢 桿 菌 GDM1.11（Bacillus licheniformis）、 凝 結(jié) 芽 孢 桿 菌 GDM1.645 （Bacillus coagulans）、 植物乳桿菌 GDM1.191（Lactobacillus plantarum）、 干酪乳桿菌 GDM1.80（Lactobacillus casei）、 嗜 酸 乳 桿 菌 GDM1.208 （Lactobacillus acidophilus）、 產(chǎn)朊假絲酵母 GDM2.148（Candida utilis）和 釀 酒 酵 母 GDM2.90（Saccharomyces cerevisiae）購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心；鼠李糖乳桿菌 （Lactobacillus rhamnosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）為本實(shí)驗(yàn)室分離純化。

1.1.3 試驗(yàn)藥物及動(dòng)物。營(yíng)養(yǎng)瓊脂，生產(chǎn)批號(hào)：1101791，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯，生產(chǎn)批號(hào)：1094671，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；無(wú)菌脫纖維兔血，生產(chǎn)批號(hào)：20210818001，南京全隆生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；13種藥敏紙片，生產(chǎn)批號(hào)：210512，杭州濱和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；慶大霉素，生產(chǎn)批號(hào)：210618，上海沃凱化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；頭孢哌酮(先鋒必)，生產(chǎn)批號(hào)：20210708，輝瑞制藥有限公司產(chǎn)品；28日齡BALB/c小鼠購(gòu)自武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌分離及鑒定。取小腸內(nèi)容物、稀糞各10 g分別加入90 mL無(wú)菌生理鹽水，搖勻后再稀釋10倍，取10-2稀釋度0.1 mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于37℃好氧培養(yǎng)48 h，待長(zhǎng)出單菌落后，挑取菌落劃線純化。純化后進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，初步判斷菌株類(lèi)別，后將菌株進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，其中正向引物為27F：5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物為1492R：5'-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3'[7]，所得序列通過(guò)美國(guó)生物技術(shù)信息中心（NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST進(jìn)行在線同源性比對(duì)，并進(jìn)行革蘭氏染色特性、糖發(fā)酵試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)、硝酸鹽還原和明膠液化等生理生化試驗(yàn)，從而確定菌株名稱(chēng)。

1.2.2 溶血性試驗(yàn)。將純化后的菌株，挑取一環(huán)菌泥，稀釋于無(wú)菌生理鹽水中，備用。將無(wú)菌圓形濾紙片貼于含5%的兔血瓊脂平板上，吸取50 μL菌液接種于無(wú)菌圓形濾紙片上，37℃好氧培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)溶血圈形成。

1.2.3 藥物敏感性試驗(yàn)。將純化后的菌株活化后，挑取一環(huán)菌泥采用無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)菇K菌濃約為108CFU·mL-1，備用。吸取1 mL菌懸液加入50℃保溫的100 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中搖勻，傾倒平板，冷卻凝固后貼上藥敏紙片，靜置15 min后，將平皿置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.4 益生菌抑菌試驗(yàn)。采用牛津杯法[8]，從活化后的病菌中挑取菌泥，稀釋至活菌數(shù)約108CFU·mL-1，吸取1 mL菌懸液加入50℃保溫的100 mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中搖勻，傾倒平板，冷卻凝固后將牛津杯置于平板上，往牛津杯中加入發(fā)酵培養(yǎng)24 h的益生菌培養(yǎng)液 0.25 mL（菌濃約為 108CFU·mL-1），置于 37 ℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h。觀察有無(wú)抑菌圈產(chǎn)生，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.5 動(dòng)物致病性及治療試驗(yàn)。選取100只健康小鼠隨機(jī)分成5組，每組20只，分別為對(duì)照組、病菌感染組、慶大霉素組、頭孢哌酮組和益生菌組。其中病菌感染組、慶大霉素組、頭孢哌酮組和益生菌組的小鼠腹腔注射菌濃度約為106CFU·mL-1的病菌懸液，用量為0.5 mL/只，對(duì)照組注射0.5 mL/只的0.85%無(wú)菌生理鹽水。慶大霉素組與頭孢哌酮組按1 g/kg體重用藥量加入日糧及飲水中，而益生菌組在日糧及飲水中按1 g/kg體重加入復(fù)合乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液。3組日常喂食、管理一致，飲水自由，連續(xù)觀察7 d，計(jì)算小鼠死亡只數(shù)，并剖檢死亡小鼠，取臟器進(jìn)行病菌分離。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2020整理及標(biāo)準(zhǔn)差分析，結(jié)果以 “平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并采用SPSS22.0軟件中Duncan法進(jìn)行多重比較分析，其中P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 病菌分離及鑒定

在腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物及糞便中均分離出一株活菌數(shù)為104CFU·g-1的菌株，通過(guò)菌落形態(tài)及鏡檢菌體形態(tài)，初步判斷為同一種菌株。后經(jīng)16S rRNA測(cè)序，BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果表明該菌株基因系列與Escherichia coLi SCLE84的同源性為99.95%。

菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果為：MR試驗(yàn)、吲哚反應(yīng)和糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣等試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)、蔗糖利用和檸檬酸鹽利用等試驗(yàn)為陰性，具體結(jié)果如表1所示。

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果

由16S rRNA測(cè)序經(jīng)BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果與表1菌株的生化鑒定結(jié)果相結(jié)合，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，可以明確分離的菌株為大腸桿菌。

2.2 溶血性試驗(yàn)

分離菌株經(jīng)含5%兔血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，出現(xiàn)明顯的溶血圈，大小可達(dá)42.15±0.15 mm，說(shuō)明該菌株具有溶血性。

2.3 藥物敏感性試驗(yàn)

分離菌株經(jīng)左氟沙星、諾氟沙星和頭孢克洛等13種抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，菌株對(duì)左氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、青霉素G、氨芐青霉素和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)諾氟沙星、紅霉素中度敏感，對(duì)頭孢克洛、頭孢哌酮、頭孢呋辛、氯霉素和慶大霉素表現(xiàn)敏感，具體如表2所示。

表2 分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.4 益生菌抑菌試驗(yàn)

分離菌株經(jīng)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和凝結(jié)芽孢桿菌等10株益生菌的發(fā)酵培養(yǎng)液抑制，結(jié)果如表3所示。分離菌對(duì)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母及產(chǎn)朊假絲酵母表現(xiàn)為低敏感，對(duì)戊糖片球菌表現(xiàn)為中敏感，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌表現(xiàn)為高敏感。

表3 益生菌對(duì)大腸桿菌的抑制效果

2.5 動(dòng)物致病性及治療試驗(yàn)

將分離菌進(jìn)行小鼠致病性試驗(yàn)，并通過(guò)分析分離菌的藥敏試驗(yàn)、益生菌抑制試驗(yàn)結(jié)果，選取慶大霉素、頭孢哌酮兩種抗菌藥與復(fù)合乳酸菌對(duì)感染分離菌的小鼠進(jìn)行治療，具體試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。病菌感染組在3 d內(nèi)死亡率達(dá)95%，說(shuō)明該分離菌具有較強(qiáng)的致病性。慶大霉素組死亡率為20%，頭孢哌酮組死亡率為10%，而益生菌組死亡率為25%，這3組的死亡率與對(duì)照組無(wú)顯著性差異 (P＜0.05)，在相同的用藥劑量下，頭孢哌酮的治療優(yōu)于慶大霉素，慶大霉素治療效果與益生菌組差異不大。在死亡小鼠的腸道、肝臟皆分離出與所注射菌株一致的病菌，未死亡小鼠剖檢后發(fā)現(xiàn)臟器未發(fā)生病變。

表4 大腸桿菌對(duì)小鼠致病性及治療

3 討論

從腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物及糞便中分離出一株活菌數(shù)為104CFU·g-1的菌株，經(jīng)16 S rRNA測(cè)序及生化特征鑒定為大腸桿菌，且該菌具有溶血性，感染小鼠3 d內(nèi)死亡率達(dá)95%，說(shuō)明分離菌具有較強(qiáng)的致病性，所以可以推測(cè)導(dǎo)致該養(yǎng)豬場(chǎng)仔豬發(fā)生腹瀉死亡的病原菌主要為致病性大腸桿菌。通過(guò)藥敏試驗(yàn)可知，該病菌對(duì)大多數(shù)的抗生素具有耐藥性，但對(duì)頭孢類(lèi)藥物表現(xiàn)敏感。在益生菌抑菌試驗(yàn)中，多數(shù)的乳酸菌能有效抑制該病菌，在動(dòng)物試驗(yàn)中，復(fù)合乳酸菌對(duì)感染病菌的小鼠治療效果與抗生素差異不大，說(shuō)明復(fù)合乳酸菌具有替代抗生素的潛力。

高飛等[10]、宋德平等[11]及付月華等[12]發(fā)現(xiàn)，從腹瀉仔豬糞便中分離出的大腸桿菌對(duì)頭孢類(lèi)藥物敏感，對(duì)常規(guī)多種抗生素具有耐藥性，該研究與本研究結(jié)果較為一致。而大腸桿菌對(duì)頭孢類(lèi)藥物敏感，對(duì)常規(guī)抗生素耐藥，原因可能為頭孢類(lèi)藥物價(jià)格較貴，養(yǎng)殖戶(hù)使用較少，所以大腸桿菌對(duì)它們還沒(méi)有產(chǎn)生抗藥性。且不同來(lái)源的大腸桿菌耐藥性不盡相同，隨著抗生素的長(zhǎng)期使用致使大腸桿菌的耐藥性不斷提高[13-14]。

益生菌在豬大腸桿菌的防治運(yùn)用中，陸克文等[15]、陳明亮等[16]主要介紹乳酸菌對(duì)豬大腸桿菌疾病的防治。乳酸菌可以通過(guò)產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，從而能有效抑制有害菌[17-19]，而凝結(jié)芽孢桿菌則可以通過(guò)產(chǎn)生凝固素（coagulin）、lactosporin 及乳酸來(lái)抑制病原菌[20-21]。 在本研究中，復(fù)合乳酸菌發(fā)酵液在治療感染病菌的小鼠中所表現(xiàn)出來(lái)的效果與抗生素基本一致，但抗生素的使用不僅提高病菌的耐藥性、而且還會(huì)造成藥物殘留及破壞生態(tài)環(huán)境[22]，畜禽肉類(lèi)產(chǎn)品中藥物殘留會(huì)危害人體健康[23-24]，而益生菌制劑則無(wú)上述危害。故益生菌制劑在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中具有良好的運(yùn)用前景，可成為抗生素重要替代品之一[25]。

4 結(jié)論

從腹瀉仔豬的小腸內(nèi)容物及糞便中分離出一株具有較強(qiáng)致病性、溶血性的大腸桿菌，該菌對(duì)多種抗生素表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)頭孢抗菌藥物則表現(xiàn)為敏感，但能被植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等乳酸菌發(fā)酵液抑制。故建議養(yǎng)殖場(chǎng)在治療動(dòng)物細(xì)菌性疾病時(shí)，先做病菌分離、藥物敏感性試驗(yàn)，選擇有效的抗菌藥物，對(duì)癥下藥，避免抗生素濫用。而養(yǎng)殖過(guò)程中使用益生菌制劑，可以有效減少或預(yù)防細(xì)菌性疾病的發(fā)生。