ApoE基因多態(tài)性與冠心病病變范圍及氯呲格雷抵抗的關(guān)系

王亞丹 鄭穎穎 艾景雪 李運(yùn)麗 高 瑞

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病)是以冠狀動脈粥樣硬化為基礎(chǔ)病理特征的常見慢性病，其發(fā)病可受多種病因及誘因影響，其中血脂異常被認(rèn)為是動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與冠心病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。載脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)作為血漿脂蛋白重要組成部分，參與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝，對維持血脂平衡十分重要。人體編碼ApoE基因位于第19號染色體，有ε2、ε3、ε4三種共顯性等位基因，共構(gòu)成ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4 6種基因型，ApoE基因表達(dá)不同可影響ApoE結(jié)構(gòu)及功能，繼而影響脂質(zhì)代謝。明確ApoE基因多態(tài)性與冠心病關(guān)系是臨床研究熱點(diǎn)，其結(jié)果或可為冠心病易感人群診斷、預(yù)防提供依據(jù)。

經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention,PCI)是疏通狹窄或閉塞冠狀動脈管腔、改善心肌灌注的技術(shù)，已成為冠心病重要治療手段。氯吡格雷作為抗血小板治療的重要藥物，在心腦血管疾病二級預(yù)防中有廣泛應(yīng)用，也是目前預(yù)防PCI術(shù)后血栓事件的常用藥物之一。但因個體差異，不同人對藥物反應(yīng)性不一，部分患者應(yīng)用氯吡格雷時(shí)，可表現(xiàn)出藥物對血小板聚集抑制率下降情況，即使規(guī)范用藥仍達(dá)不到預(yù)期效果，這一現(xiàn)象被稱為氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR)。若能早期預(yù)測冠心病患者CR風(fēng)險(xiǎn)，則可為臨床PCI術(shù)后個性化用藥提供參考?；谏鲜霰尘?，本研究探究了ApoE基因多態(tài)性與冠心病患者病變范圍及PCI術(shù)后氯吡格雷抵抗關(guān)系，旨在為臨床冠心病個性化診療提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象來源于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科2017年9月至2019年9月收治的116例冠心病患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：漢族，且無血緣關(guān)系；首次發(fā)??；因胸悶、心悸等癥狀入院，且經(jīng)冠脈造影確診；接受PCI治療；PCI術(shù)前給予300 mg氯吡格雷，術(shù)后給予75 mg/d氯吡格雷聯(lián)合100 mg/d阿司匹林；精神認(rèn)知正常；自愿接受基因檢測；可取得隨訪配合；簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：未行冠脈造影、無法確定冠脈病變情況者；合并糖尿病、甲狀腺疾病、肝腎功能不全等影響血脂代謝疾??；患有惡性腫瘤、急慢性感染、免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)疾??；入組前半年內(nèi)有調(diào)脂藥應(yīng)用、抗血小板治療或輸血史；基因檢測結(jié)果無法辨識者。116例患者中男性71例、女性45例，年齡41～69歲，平均(56.28±12.24)歲，身體質(zhì)量指數(shù)21.6～26.9 kg/m，平均(24.65±1.31)kg/m；冠脈病變單支35例，雙支47例，三支34例。

另選取80例經(jīng)冠脈造影排除冠心病的心內(nèi)科普通輕癥患者為對照組，除疾病相關(guān)診斷、治療標(biāo)準(zhǔn)外，其余納入、排除標(biāo)準(zhǔn)同冠心病組。對照組男性47例、女性33例，年齡37～70歲，平均(58.94±9.85)歲，身體質(zhì)量指數(shù)20.5～26.2 kg/m，平均(24.47±1.14)kg/m；診斷：陣發(fā)性房顫29例，普通心肌炎27例，室性早搏24例。冠心病組與對照組性別、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 基因多態(tài)性分析 EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血標(biāo)本5 mL，采用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司生產(chǎn))，嚴(yán)格按試劑盒說明書提取全血細(xì)胞基因組DNA。應(yīng)用紫光分光光度計(jì)(美國，QUAWELL公司，Q3000型)對樣品DNA濃度、純度進(jìn)行測定，待測DNA樣品OD260/OD280≈1.8。應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增ApoE特定基因片段，PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，引物購自武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。擴(kuò)增產(chǎn)物送外檢(上海華大基因科技有限公司)，采用Sinochips-PGA基因芯片閱讀儀分析ApoE基因分型。根據(jù)rs429358、rs7412堿基種類分為3種純合子和3種雜合子，并歸為3類基因表型。二者均T純合為ε2/2型，rs429358 T純合、rs7412 T和C雜合為ε2/3型，rs429358 T純合、rs7412 C純合為ε3/3型，二者均T和C雜合為ε2/4型，rs429358T和C雜合、rs7412處C純合為ε3/4型，二者均C純合為ε4/4型，其中等位基因表型分型ε2/2型、ε2/3型歸為E2表型。ε3/3型、ε2/4型歸為E3表型，ε3/4型、ε4/4型歸為E4表型。

1.2.2 血脂檢測 EDTA抗凝管采集患者空腹12 h肘靜脈血標(biāo)本5 mL，離心后(3 500 r/min，10 min)分離血清，采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀，檢測總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)水平，其中TC、TG檢測采用氧化酶法，HDL-C、LDL-C分別采用直接法、直接勻相法檢測。

1.2.3 冠脈病變嚴(yán)重程度評價(jià) 采用Gensini積分法評價(jià)冠脈病變嚴(yán)重程度，將冠脈分成14段，各節(jié)段對應(yīng)一定權(quán)重系數(shù)，包括左主干病變(權(quán)重系數(shù)5)、前降支近段(2.5)、前降支中段(1.5)、前降支遠(yuǎn)段(1)、回旋支近段(2.5)、回旋支遠(yuǎn)段(1)、第一對角支(1)、第二對角支(0.5)、右冠脈近段(1)、右冠脈中段(1)、右冠脈遠(yuǎn)段(1)、鈍緣支(1)、后降支(1)、左室后側(cè)支(1)；結(jié)合冠脈狹窄程度評分，其中狹窄程度≤25%、25%～50%、50%～75%、75%～90%、90%～99%、100%分別記1分、2分、4分、8分、16分、32分，各節(jié)段權(quán)重系數(shù)×狹窄程度評分相加之和即為Gensini總積分，分值越高，冠脈病變程度越嚴(yán)重。

1.2.4 氯吡格雷抵抗 于氯吡格雷首日給藥前、給藥后7天，采集(3.2%枸櫞酸抗凝管)空腹(10～14 h)肘靜脈血標(biāo)本2 mL，2 h內(nèi)于室溫條件下完成血小板聚集率(maximal platelet aggregation rate,MPAR)檢測，以5 μmol/L二磷酸腺苷為誘導(dǎo)劑，采用光比濁法測定MPAR，其中氯吡格雷給藥前、給藥后7天在二磷酸腺苷誘導(dǎo)下的MPAR差值≤10%視為存在CR，設(shè)為CR組，無CR者設(shè)為非CR組。

1.2.5 PCI術(shù)后臨床事件 術(shù)后1年內(nèi)，經(jīng)電話及門診隨訪，統(tǒng)計(jì)患者不良心血管事件(主要包括心源性死亡、不穩(wěn)定型心絞痛、非致死性心肌梗死、支架內(nèi)再狹窄等)及出血事件(主要包括皮膚黏膜出血、顱內(nèi)出血、內(nèi)臟出血等)發(fā)生情況。

2 結(jié)果

2.1 冠心病組與對照組血脂水平比較 冠心病組TC、TG、LDL-C水平均高于對照組(

P

<0.05)，兩組HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見表1。

表1 冠心病組與對照組血脂水平比較

2.2 冠心病組與對照組ApoE基因表型及等位基因頻率分布 冠心病組E4表型構(gòu)成比及等位基因ε4頻率均高于對照組(

P

<0.05)。見表2。

表2 冠心病組與對照組ApoE基因表型及等位基因頻率分布[例(%)]

2.3 ApoE基因表型及等位基因與冠心病易感性 調(diào)整性別、年齡、血脂等混雜因素后，E4表型較E3表型冠心病風(fēng)險(xiǎn)增加2.41倍，攜帶ε4等位基因較ε3等位基因風(fēng)險(xiǎn)增加1.86倍。見表3。

表3 ApoE基因表型及等位基因與冠心病易感性

2.4 冠心病患者不同ApoE基因型間血脂水平比較 E4表型TC、LDC-C水平均高于E2、E3表型(

P

<0.05)；但3組TG、HDL-C水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見表4。

表4 冠心病患者不同ApoE基因型間血脂水平比較

2.5 不同ApoE基因型間冠脈病變范圍分布比較 冠脈病變范圍在不同ApoE基因型間整體分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)，其中在E2、E3表型中，冠脈病變支數(shù)分布比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)，但在E4表型中，三支病變構(gòu)成比明顯高于單支病變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表5。

表5 不同ApoE基因型間冠脈病變范圍分布比較[例(%)]

2.6 不同ApoE基因型間Gensini積分水平比較 E4表型冠脈病變嚴(yán)重程度Gensini積分高于E2、E3表型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見表6。

表6 不同ApoE基因型間Gensini積分水平比較分)

2.7 CR組與非CR組ApoE基因表型分布及等位基因頻率比較 116例患者中，共37例出現(xiàn)CR，檢出率31.90%。CR組E4表型構(gòu)成比及等位基因ε4頻率均高于非CR組(

P

<0.05)。見表7。

表7 CR組與NCR組ApoE基因表型分布及等位基因頻率比較[例(%)]

2.8 ApoE基因表型及等位基因與CR易感性 調(diào)整性別、年齡、血脂等混雜因素后，E4表型較E3表型CR風(fēng)險(xiǎn)增加2.58倍，攜帶ε4等位基因較ε3等位基因風(fēng)險(xiǎn)增加2.26倍。見表8。

表8 ApoE基因表型及等位基因與CR易感性

2.9 不同ApoE基因型間PCI術(shù)后臨床事件的差異比較 隨訪1年內(nèi)，E2、E3、E4表型患者PCI術(shù)后不良心血管事件、出血事件發(fā)和生率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)。見表9。

表9 不同ApoE基因型間PCI術(shù)后臨床事件的差異比較[例(%)]

3 討論

隨著人口老齡化進(jìn)程加快以及人們飲食、生活習(xí)慣變化，我國冠心病發(fā)病率逐年上升，且有年輕化趨勢，該病已成為威脅人們健康與生活質(zhì)量的重要慢性病之一。目前，冠心病發(fā)病機(jī)制雖未完全闡明，但已有流行病學(xué)研究顯示，血脂代謝紊亂與冠心病發(fā)病關(guān)聯(lián)密切，其中LDL-C及相關(guān)脂蛋白水平上升在啟動、維持動脈粥樣硬化方面占重要地位。近些年來，隨著分子生物學(xué)研究進(jìn)展、精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念推廣以及基因檢測技術(shù)發(fā)展，基因檢測在臨床多種疾病診斷及預(yù)防中展現(xiàn)出良好應(yīng)用前景，探究影響脂代謝基因與冠狀動脈疾病易感性關(guān)系已成為臨床研究熱點(diǎn)之一。

ApoE是機(jī)體最重要載脂蛋白之一，可作為配體與乳糜微粒受體結(jié)合，利于經(jīng)腸道攝入的TC、TG進(jìn)入肝臟代謝，而存在于肝細(xì)胞膜的ApoE受體也是乳糜微粒清除的決定因子；ApoE還能與肝臟中高密度脂蛋白受體、極低密度脂蛋白受體等結(jié)合，利于TC、TG的運(yùn)輸及平衡分布；這些作用機(jī)制奠定了ApoE在機(jī)體脂質(zhì)利用、轉(zhuǎn)運(yùn)、儲存、排泄等方面的重要地位。人體ApoE基因多態(tài)性取決于19號染色體ε2、ε3、ε4三個常見等位基因，可決定6種基因型，一般歸為E2、E3、E4 3種基因表型，等位基因中以ε3出現(xiàn)頻率最高(50%～90%)，為野生型；ε2、ε4出現(xiàn)頻率則相對較低(分別1%～15%、5%～35%)，均為變異體，前者突變表現(xiàn)為同工蛋白質(zhì)ApoE3上第158位置精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?，而后者表現(xiàn)為ApoE3上112位置半胱氨酸突變?yōu)榫彼?，這些氨基酸突變引起ApoE異構(gòu)體對脂質(zhì)蛋白受體親和力改變，繼而導(dǎo)致高脂蛋白血癥。相關(guān)文獻(xiàn)顯示，E3表型對血脂異常無明顯偏性，在人群中占比最高；E2表型為長壽基因型，無論是冠心病或非冠心病者，ApoE2攜帶者血漿ApoE濃度相比其他基因型往往更高，而血漿TC、LDL-C濃度更低，這主要因?yàn)锳poE2與LDL受體親和力下降，使得血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白及其殘基清除下降，繼而誘導(dǎo)肝細(xì)胞LDL受體反饋性升高，導(dǎo)致LDL分解增快，最終下調(diào)TC、LDL-C；而E4表型則與血脂異常升高有關(guān)，這可能因?yàn)橄啾華poE3而言，ApoE4對脂蛋白代謝速率更快，血漿乳糜微粒、極低密度脂蛋白及其殘基清除增加，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞LDL受體反饋性下調(diào)，從而使得TC、LDL-C水平升高。

本研究結(jié)果顯示，冠心病組E4表型構(gòu)成比及ε4等位基因頻率明顯高于對照組，與E3表型相比，E4表型發(fā)生冠心病的

OR

值為2.41，且冠心病患者中E4表型組TC、LDC-C水平均明顯高于E2、E3表型，這提示ApoE4可能通過影響血脂代謝而增加冠心病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。既往研究也認(rèn)為ApoE基因多態(tài)性與冠心病發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，其可能作用機(jī)制有以下幾點(diǎn)：其一，ApoE不同表型表達(dá)的ApoE濃度不同，且以E4表型者最低，而高濃度ApoE在抗動脈粥樣硬化中具有重要作用；其二，不同ApoE異構(gòu)體在機(jī)體代謝速率有較大差異，與相應(yīng)受體結(jié)合活性也有所不同，其中以E4表型相對活性更高，可引起LDL受體反饋性下調(diào)，從而導(dǎo)致TC、LDL-C等水平明顯升高，而這些富含膽固醇脂蛋白經(jīng)長期蓄積氧化，可誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，與冠心病發(fā)生關(guān)系密切；此外，ApoE基因多態(tài)性可通過與其他冠心病危險(xiǎn)因素如吸煙、飲酒等相互作用，進(jìn)一步增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冠心病患者E3、E2表型中冠脈病變支數(shù)未表現(xiàn)出明顯差異，但在E4表型中，三支病變構(gòu)成比明顯高于單支病變，且冠脈病變嚴(yán)重程度Gensini積分明顯高于E2、E3表型，提示冠心病ApoE4攜帶者可能更容易出現(xiàn)多支病變，且病情更嚴(yán)重。不過楊春霞研究認(rèn)為，ApoE4攜帶者多支病變比例較ApoE2、ApoE3者比例更高，但通過危險(xiǎn)因素分析，發(fā)現(xiàn)其與冠脈多支病變并無明顯相關(guān)性，這一結(jié)果可能受地域、飲食習(xí)慣、生活環(huán)境等影響，值得進(jìn)一步研究。PCI是冠心病首選治療方式，不過PCI術(shù)后有一定支架內(nèi)血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，其發(fā)生可直接影響患者療效及預(yù)后，因此術(shù)后抗血小板治療十分重要。當(dāng)前氯吡格雷是PCI術(shù)后常用抗血小板藥物之一，其應(yīng)用可有效降低支架內(nèi)血栓形成及術(shù)后不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，且一般認(rèn)為，氯吡格雷相比阿司匹林在防治心血管疾病方面效果更優(yōu)。但在實(shí)際中，由于CR現(xiàn)象存在，患者治療效果大打折扣，早期識別患者CR風(fēng)險(xiǎn)對指導(dǎo)PCI術(shù)后個體化用藥、改善預(yù)后具有重要意義。臨床上影響氯吡格雷代謝因素較多，基因多態(tài)性被認(rèn)為是其中最重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)，CR組E4表型構(gòu)成比及等位基因ε4頻率均明顯高于非CR組(

P

<0.05)，而與E3表型相比，E4表型發(fā)生CR的OR值為2.58，提示ApoE4攜帶者可能存在更高的CR風(fēng)險(xiǎn)。目前，雖無直接證據(jù)證實(shí)ApoE基因多態(tài)性與CR相關(guān)，但有研究認(rèn)為，血漿高LDL-C水平是影響PCI術(shù)后CR的危險(xiǎn)因素之一，其原因在于高血脂患者血液多處于高凝狀態(tài)，血管內(nèi)皮功能、纖溶系統(tǒng)易受損，可影響血小板膜結(jié)構(gòu)、降低抗血小板效果，故可出現(xiàn)CR現(xiàn)象，而ApoE4攜帶者血漿LDL-C較非攜帶者往往明顯升高，或可以解釋這一結(jié)果。但本研究發(fā)現(xiàn)，隨訪1年內(nèi)，E2、E3、E4表型患者PCI術(shù)后不良心血管事件、出血事件發(fā)生率并無明顯差異，這一結(jié)果提示ApoE基因多態(tài)性對血脂影響可能并不足以直接增加患者PCI術(shù)后不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，該結(jié)果也可能受研究樣本量限制，后期可擴(kuò)大樣本分析，進(jìn)一步為患者后期不良心血管事件防控提供依據(jù)。

綜上所述，冠心病患者ApoE基因E4表型比例相比非冠心病者增加，且與患者血脂、冠脈病變范圍、病變嚴(yán)重程度以及PCI術(shù)后氯吡格雷抵抗有一定關(guān)系，檢測該類人群ApoE基因多態(tài)性或可為其病情評估、疾病防治、PCI術(shù)后用藥指導(dǎo)等提供依據(jù)，值得深入研究。