CYP2C19基因檢測(cè)與血藥濃度監(jiān)測(cè)在伏立康唑臨床個(gè)體化用藥中的應(yīng)用

肖 飛 任佳秀 莊星星 江彬彬 李 萌 倪受東 苗仁華

伏立康唑是新型的二代三唑類(lèi)抗真菌藥物，具有抗菌效力強(qiáng)，口服吸收好等特點(diǎn)，是臨床用于侵襲性真菌重癥感染的一線藥物。伏立康唑治療效果受遺傳因素和非遺傳因素的影響，遺傳因素主要是CYP2C19基因多態(tài)性對(duì)其肝臟CYP450代謝酶活性的的影響，進(jìn)而影響伏立康唑的藥代動(dòng)力學(xué)；臨床非遺傳因素包括患者肝腎功能、病理生理狀態(tài)、飲食和聯(lián)合用藥等的影響。穩(wěn)態(tài)谷濃度是評(píng)價(jià)伏立康唑體內(nèi)暴露劑量的常用指標(biāo)，與臨床療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)；但是伏立康唑呈現(xiàn)非線性藥代動(dòng)力學(xué)特征，具有治療窗窄、個(gè)體差異大以及不良反應(yīng)頻繁的特征。因此，探討伏立康唑個(gè)體差異的影響因素，對(duì)于伏立康唑的個(gè)體化指導(dǎo)具有十分重要的臨床意義。本研究在文獻(xiàn)研究和前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立了熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性以及酶聯(lián)免疫放大法測(cè)定伏立康唑血藥濃度，為伏立康唑臨床個(gè)體化用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 Fluotec 48E微量熒光檢測(cè)儀(西安天隆科技有限公司)；Viva-E全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)西門(mén)子公司)；熒光檢測(cè)儀V2.0.711工作站；BT25S電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；TGL16E高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 核酸純化試劑(10 mL/瓶，北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：202011006)；測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒(北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：20210218)伏立康唑測(cè)定試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號(hào)：20190401)；伏立康唑校準(zhǔn)品(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號(hào)：20190401)；伏立康唑質(zhì)控品(珠海麗珠試劑股份有限公司，批號(hào)：20190401)。伏立康唑?qū)φ掌?中國(guó)食品藥品檢定研究院，每支100 mg，純度：99.8%，批號(hào)：100862-201903)空白血清(上海斯信生物科技有限公司，批號(hào)為MR16118)。

1.3 研究對(duì)象 選擇2020年6月至2021年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬巢湖醫(yī)院血液內(nèi)科接受伏立康唑治療或預(yù)防侵襲性真菌感染的血液相關(guān)疾病患者?；颊咴谑褂梅⒖颠蚯盎蛘叻⒖颠蚝髾z測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性；口服伏立康唑3 d或者注射劑5劑給藥后視為血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)，測(cè)量血清初始穩(wěn)態(tài)血藥濃度。排除嚴(yán)重肝功能異?；颊?ALT、AST≥正常值上限3倍或嚴(yán)重腎功能損害患者(Ccr≤30 mL/min)。

1.4 伏立康唑藥物基因檢測(cè)方法 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)

CYP

2

C

19*2、

CYP

2

C

19*3以及

CYP

2

C

19*17基因多態(tài)性。血樣處理方法：氯化銨溶液(10×NHCl)與滅菌水按 1∶9比例稀釋為工作液；在1.5 mL離心管中先后加入1.0 mL NHCl工作液和100 μL抗凝血，顛倒混勻，室溫靜置5 min后，3 000 r/min離心5 min；棄掉上清，離心管的底部可觀察到白色米粒大小的白細(xì)胞沉淀；加入1.0 mL NHCl工作液，輕輕吹打白細(xì)胞使之懸浮，3 000 r/min離心5 min，棄上清；沉淀加入50 μL核酸純化試劑，吹打混勻，室溫靜置30 min；取2 μL處理后的白細(xì)胞樣本加入測(cè)序反應(yīng)通用試劑，震蕩混勻，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒初次使用時(shí)，需檢測(cè)試劑盒內(nèi)3種基因型的軟件參數(shù)設(shè)定液，用以修正參數(shù)，確保結(jié)果準(zhǔn)確。

1.5 伏立康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)方法 酶聯(lián)免疫放大法測(cè)定伏立康唑血藥濃度，接收的血液樣本，3 000 r/min離心10 min，按照Viva-E全自動(dòng)生化分析儀操作規(guī)范、伏立康唑測(cè)定試劑盒和伏立康唑質(zhì)控品說(shuō)明書(shū)，測(cè)定血藥濃度。

隨樣本監(jiān)測(cè)伏立康唑高、中、低濃度質(zhì)控品的結(jié)果，根據(jù)Westgard室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則，以連續(xù)3或1判定系統(tǒng)是否失控；如失控重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察 按照Viva-E全自動(dòng)生化分析儀操作規(guī)范、伏立康唑測(cè)定試劑盒和伏立康唑質(zhì)控品說(shuō)明書(shū)，將伏立康唑校準(zhǔn)品(校準(zhǔn)濃度 0、0.5、1.5、4.0、8.0、16.0 μg/mL)分別測(cè)定1次，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：

其中

R

=2.621 9；

K

=2.069 13；a=-8.928 6；b=6.190 42。測(cè)量范圍0.5～16.0 μg/mL。

2.2 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質(zhì)控樣品6份。按“2.2項(xiàng)”方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。按照《中華人民共和國(guó)藥典(2020版)》關(guān)于生物樣品分析方法的要求對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行日內(nèi)精密度和日間精密度考察，結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均低于10%，符合要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質(zhì)控樣品6份。室溫放置12 h，按“2.2項(xiàng)”方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，6次檢測(cè)結(jié)果的RSD值均<10%，提示樣品在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取伏立康唑?qū)φ掌愤m量，用空白血清制備濃度分別為1.0 、5.0和10.0 μg/mL的質(zhì)控樣品6份。按“2.2項(xiàng)”方法進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，監(jiān)測(cè)濃度除以標(biāo)識(shí)濃度乘以100%，計(jì)算提取回收率。見(jiàn)表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果(n=6)

2.5 個(gè)體化用藥分析 伏立康唑主要經(jīng)肝臟CYP2C19代謝。CYP2C19基因存在多態(tài)性，其酶有4種不同的代謝類(lèi)型：快代謝型(RM，*1

/

*1)，超快代謝型(UM，*1

/

*17，*17

/

*17)，中間代謝型(IM，*1

/

*2，*1

/

*3，*17

/

*2，*17

/

*3)，慢代謝型(PM，*2

/

*2，*2

/

*3，*3

/

*3)。本研究的10例患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果為快代謝型3例、中間代謝型5例和慢代謝型2例；根據(jù)患者代謝型制定或調(diào)整給藥劑量，本研究10例患者有7例患者的血藥濃度在有效范圍內(nèi)，另外3例患者的血藥濃度值也接近有效范圍，且無(wú)不良反應(yīng)出現(xiàn)，臨床醫(yī)生會(huì)實(shí)時(shí)調(diào)整劑量，并持續(xù)檢測(cè)血藥濃度，使得血藥濃度均在推薦范圍內(nèi)(0.5～5.0 μg/mL)。見(jiàn)表2。

表2 10例患者的伏立康唑藥物基因檢測(cè)與血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 基因型檢測(cè)方法和結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)采用的熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)，利用報(bào)告分子與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測(cè)體系在鏡下對(duì)待DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。熒光原位雜交技術(shù)開(kāi)發(fā)于30 多年前，是細(xì)胞遺傳學(xué)研究中最具范式改變的技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、原位等諸多優(yōu)點(diǎn)，故目前已成為藥學(xué)、遺傳學(xué)、微生物生態(tài)學(xué)各個(gè)領(lǐng)域研究中強(qiáng)有力的工具。本實(shí)驗(yàn)采用的方法技術(shù)成熟可靠，儀器設(shè)備和試劑均合格，出具檢測(cè)報(bào)告真實(shí)且及時(shí)，美中不足的是實(shí)驗(yàn)程序單次運(yùn)行時(shí)間較長(zhǎng)，為保證實(shí)驗(yàn)的正常運(yùn)作，需要操作人員實(shí)時(shí)監(jiān)管。

CYP2C19的基因多態(tài)性是導(dǎo)致伏立康唑體內(nèi)代謝個(gè)體間差異的主要影響因素。在本研究中的10例患者，其中快代謝型3例，中間代謝型5例和慢代謝型2例。在亞洲人群中CYP2C19弱代謝者發(fā)生率則高達(dá)15%～20%，而弱代謝者伏立康唑的血藥濃度比較強(qiáng)代謝者高約4倍。根據(jù)臨床藥物基因組學(xué)實(shí)施聯(lián)盟發(fā)布的指南，CYP2C19基因檢測(cè)可以避免伏立康唑高濃度所致的不良反應(yīng)，該指南不推薦慢代謝型的患者使用伏立康唑；若必須使用，應(yīng)當(dāng)?shù)陀谂R床治療的標(biāo)準(zhǔn)劑量進(jìn)行治療，同時(shí)嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血藥濃度，以減少伏立康唑血藥濃度過(guò)高而引起的不良反應(yīng)；對(duì)于超快代謝型患者應(yīng)當(dāng)選擇不依賴(lài) CYP2C19代謝的其他抗真菌藥；對(duì)快和中代謝的患者使用標(biāo)準(zhǔn)劑量進(jìn)行治療。如其中1號(hào)患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)顯示為慢代謝型，伏立康唑給藥劑量為0.2 g，每天1次時(shí)，血藥濃度為0.01 μg/mL，低于推薦治療范圍；后期調(diào)整治療方案0.2 g，每天2次時(shí)，血藥濃度升高至0.85 μg/mL，臨床療效明顯提高。4號(hào)患者的CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)顯示為慢代謝型，伏立康唑給藥劑量為0.2 g，每12小時(shí)1次時(shí)，血藥濃度為14.51 μg/mL，高于臨床推薦的治療范圍，患者出現(xiàn)階段性的視力障礙不良反應(yīng)；后調(diào)整治療劑量0.2 g，每天1次，不良反應(yīng)消失，血藥濃度下降至3.04 μg/mL。鑒于該因素對(duì)伏立康唑血藥濃度的重要性，開(kāi)展 CYP2C19基因型的檢測(cè)對(duì)伏立康唑臨床合理使用具有指導(dǎo)意義。

3.2 伏立康唑血藥濃度分析 根據(jù)《伏立康唑個(gè)體化用藥指南》，推薦伏立康唑血藥濃度維持在0.5～5.0 μg/mL(1B，強(qiáng)推薦，中等質(zhì)量證據(jù))。該推薦在本研究中得到認(rèn)可，血藥濃度在0.5～5.0 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，其臨床療效顯著優(yōu)于血藥濃度<0.5 μg/mL的患者；且隨著血藥濃度超過(guò)5.0 μg/mL，其臨床療效并不能進(jìn)一步增加。當(dāng)伏立康唑血藥濃度>5.0 μg/mL其視覺(jué)障礙、皮疹等不良反應(yīng)的發(fā)生率顯著升高。其中CYP2C19慢和中間代謝型伏立康唑血藥濃度比快代謝型高3倍，抗真菌療效好，但不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)較高。本研究的10例患者，有7例患者的血藥濃度在有效范圍內(nèi)，另外3例患者的血藥濃度值也接近有效范圍，并且在后續(xù)檢測(cè)中，臨床醫(yī)師會(huì)實(shí)時(shí)調(diào)整劑量，臨床藥理學(xué)研究亦證明，血藥濃度與視覺(jué)障礙更具有相關(guān)性，血藥濃度越高，視覺(jué)障礙發(fā)生的可能性越大。因此，深層次的了解伏立康唑的藥代動(dòng)力學(xué)特征以及個(gè)體化影響因素對(duì)臨床科學(xué)合理的使用該藥尤為關(guān)鍵。因此，伏立康唑血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果是臨床調(diào)整藥物治療方案的重要依據(jù)。

3.3 臨床用藥建議 對(duì)于快代謝型患者，使用常規(guī)劑量的伏立康唑由于肝臟代謝能力較強(qiáng)可能無(wú)法達(dá)到治療效果，治療失敗風(fēng)險(xiǎn)大，可適當(dāng)增加藥物劑量或替換其他藥物。對(duì)于中間代謝型型患者，使用常規(guī)劑量的伏立康唑由于肝臟細(xì)胞色素氧化酶P450代謝能力較弱可能會(huì)引起藥時(shí)曲線下面積血藥濃度升高，較易發(fā)生不良反應(yīng)，但風(fēng)險(xiǎn)較低，建議按照標(biāo)準(zhǔn)劑量但應(yīng)關(guān)注不良反應(yīng)。而慢代謝型患者使用常規(guī)劑量后，體內(nèi)血藥濃度大，清除率下降，不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)高，但治療效果較好，需要權(quán)衡之后給藥。伏立康唑血藥濃度除了與CYP2C19基因多態(tài)性相關(guān)之外，還與患者肝腎功能、病理生理狀態(tài)、飲食和聯(lián)合用藥等其他因素的相關(guān)。因此，單純的檢測(cè)CYP2C19基因多態(tài)性不足以調(diào)整患者伏立康唑的個(gè)體化治療方案，還需要結(jié)合血藥濃度監(jiān)測(cè)判斷患者治療方案的合理性。

綜上所述，個(gè)體化用藥實(shí)踐過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因檢測(cè)雖然可以預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的部分藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，但是無(wú)法準(zhǔn)確指導(dǎo)藥物的治療劑量。當(dāng)藥物的體內(nèi)代謝過(guò)程往往受到多個(gè)藥物代謝酶參與或者藥物代謝存在多個(gè)通路和途徑時(shí)，代謝酶基因型難以與血藥濃度進(jìn)行直接相關(guān)。單一血藥濃度監(jiān)測(cè)又無(wú)法解釋特殊代謝型患者血藥濃度的異常結(jié)果，以及無(wú)法預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程。因此，上述問(wèn)題的出現(xiàn)促進(jìn)了CYP2C19基因檢測(cè)與血藥濃度監(jiān)測(cè)在指導(dǎo)臨床個(gè)體化合理用藥過(guò)程中的有效結(jié)合。