多酚復合普魯蘭酶改性藕粉的慢消化特性及結(jié)構(gòu)表征

樊律廷，葉 沁，盧文靜，諶 迪，肖朝耿*，孟祥河

（1 浙江工業(yè)大學食品科學與工程學院 杭州 310014 2 浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所 杭州 310021）

淀粉是日常生活所需碳水化合物的主要來源。根據(jù)在體外試驗中消化的速度和程度，淀粉一般分為三大類：1） 快消化淀粉（rapidly digestible starch，RDS），即前20 min 在口腔和腸道消化中的部分；2） 慢消化淀粉（slowly digestible starch，SDS），20～120 min 在小腸消化的部分；3） 抗性淀粉（resistant starch，RS），不能在小腸中吸收，主要在大腸中發(fā)酵[1-2]。近年來，隨著糖尿病和肥胖在世界范圍的流行，低血糖指數(shù)（Glycemic Index，GI）膳食成為防治糖尿病和肥胖的新熱點[3]。SDS 和RS 作為功能食品原料被廣泛應用于各種面制品中，以降低食物的GI[4-5]，而藕粉作為杭州西湖的特產(chǎn)，因低GI 的特點而越來越受到人們的喜愛，然而藕粉的直鏈淀粉含量高，容易在加工過程中發(fā)生回生，從而影響藕粉的商業(yè)價值[6]。為了進一步發(fā)揮藕粉慢消化性對肥胖人群和高血糖人群友好的優(yōu)勢以及抑制其加工過程中的回生，本文對藕粉進行改性研究。

近年的研究表明，多酚在結(jié)構(gòu)上存在羥基，可與多糖、蛋白質(zhì)等相互作用，這為多酚改性淀粉提供了可能[7-8]?；诙喾拥幕瘜W結(jié)構(gòu)，將其分為黃酮類、酚酸類和非黃酮非酚酸類多酚化合物[9]。多酚不僅可作為一種功能性成分進行添加，也可通過與淀粉的相互作用改變淀粉的結(jié)構(gòu)特性來影響淀粉的消化特性和餐后血糖反應[10]。多酚的加入可以抑制淀粉的回生和老化[11-12]，改善淀粉的性質(zhì)，提高其在食品加工中的商業(yè)價值。普魯蘭酶是一種脫支酶，作用于α-1，6 糖苷鍵，可產(chǎn)生更多的游離淀粉鏈[13]。目前對多酚復合普魯蘭酶改性淀粉的研究還較少。為進一步提高多酚和淀粉的結(jié)合效率，本文以藕粉為原材料，選取食品加工中常用的4 種類型的多酚：茶多酚（黃烷醇類）、原花青素（黃烷醇類）、蘋果多酚（酚酸類）、白藜蘆醇（芪氏）與普魯蘭酶復合改性藕粉，測定改性前、后藕粉的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性以及SDS 含量的變化，研究多酚復合普魯蘭酶對藕粉慢消化淀粉形成及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，為多酚與普魯蘭酶協(xié)同改性淀粉結(jié)構(gòu)，降低淀粉消化速率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藕粉，杭州采芝齋食品有限公司；普魯蘭酶，上海源葉生物科技有限公司；茶多酚、白藜蘆醇、蘋果多酚、原花青素純度均大于95%，上海麥克林生化科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

VERTEX70 紅外光譜儀，德國BRUKER 公司；Hitachi TM3000 掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Bruker D 8 型X-射線衍射儀 （XRD），德國BRUKER 公司；Scientz-18N 冷凍干燥機，寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；ZBRTE-718 恒溫振蕩器，常州智博瑞儀器。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備

1.3.1.1 普魯蘭酶改性藕粉樣品制備（PLRS） 將2.5 g 藕粉分散到100 mL 檸檬酸緩沖液（pH 4.4）中得到淀粉懸浮液，加入30 顆玻璃珠100 ℃，160 r/min 水浴振蕩30 min 后冷卻至58 ℃，按12 U/g淀粉添加普魯蘭酶，在58 ℃條件下160 r/min 水浴振蕩1 h，酶解結(jié)束后沸水浴滅活10 min，冷卻至室溫后在4 ℃回生48 h，冷凍干燥后將樣品研磨過100 目篩，置于干燥器中待用。

1.3.1.2 多酚和普魯蘭酶復合改性藕粉樣品制備（多酚-PLRS：茶多酚-PLRS、白藜蘆醇-PLRS、原花青素-PLRS、蘋果多酚-PLRS） 其它步驟同1.3.1.1 節(jié)，在酶解結(jié)束后按藕粉質(zhì)量10%的比例分別添加茶多酚、白藜蘆醇、原花青素、蘋果多酚至淀粉液，沸水浴160 r/min 振蕩30 min，冷卻至室溫后再回生干燥并收集。

1.3.1.3 多酚改性藕粉樣品制備（多酚-LRS：茶多酚-LRS、白藜蘆醇-LRS、原花青素-LRS、蘋果多酚-LRS） 將2.5 g 藕粉分散到100 mL 蒸餾水中得到淀粉懸浮液，加入30 顆玻璃珠100 ℃，160 r/min 水浴振蕩30 min 后按藕粉質(zhì)量10%的比例分別添加茶多酚、白藜蘆醇、原花青素、蘋果多酚至淀粉液，沸水浴160 r/min 振蕩30 min，冷卻至室溫，冷凍干燥后將樣品研磨過100 目篩，置于干燥器中待用。

1.3.2 紅外光譜測定 采用傅里葉紅外光譜儀對所制備的藕粉樣品進行測定，參照肖遙等[14]的方法：將藕粉樣品和溴化鉀以1∶300 的比例混合置于瑪瑙研缽中，在紅外燈下研磨均勻，壓片后進行掃描。測定條件：掃描波長范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4 cm-1。

1.3.3 X-射線衍射測定 所制備的藕粉樣品采用X-射線衍射儀進行測定，參照Han 等[15]的研究。測定條件：X-射線發(fā)生器管壓40 kV，電流40 mA，發(fā)射狹縫0.25 nm，銅Kα 射線，掃描角度2θ=5～45°，掃描速度2°/s，掃描方式為連續(xù)掃描。數(shù)據(jù)采用Jade 6 進行處理。

1.3.4 掃描電子顯微鏡（SEM） 取適量的淀粉樣品黏在導電膠帶上，對樣品進行鍍金處理，使用掃描電子顯微鏡，觀察樣品的微觀形貌。

1.3.5 慢消化淀粉含量測定 采用Englyst 等[16]方法和Miao 等[1]的方法稍作修改，取40 mg 樣品加入3 mL 0.2 mol/L 醋酸鈉緩沖液于25 mL 錐形瓶中，加5 顆玻璃珠，沸水浴10 min，冷卻至室溫后，于37 ℃160 r/min 的條件下水浴振蕩5 min后加入1 mL 混合酶液（290 U/mL 豬胰α 淀粉酶和15 U/mL 葡萄糖糖苷酶）。在水解20 min 和120 min 時分別取0.1 mL 上清液于離心管中，加0.9 mL 無水乙醇滅酶并 離心 （4 000 r/min，15 min），離心后，采用3，5 二硝基水楊酸（DNS）法測定上清液中的葡萄糖含量，測3 次取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用origin 9.0，SPSS 22.0 和Jade 6 軟件進行分析，試驗結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚對藕粉紅外光譜的影響

采用傅里葉紅外光譜研究多酚對藕粉分子結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如圖所示。

對于淀粉的紅外光譜，3 384 cm-1附近的吸收峰和分子間氫鍵數(shù)量呈正相關(guān)，1 047 cm-1附近的吸收峰與淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中的結(jié)晶區(qū)密切相關(guān)[17]，1 022 cm-1附近的吸收峰與淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中的非結(jié)晶區(qū)相關(guān)，1 047 cm-1，1 022 cm-1吸收峰強度的比值R1047/1022能夠反映淀粉的晶體結(jié)構(gòu)（短程有序結(jié)構(gòu)），比值越大，有序度越高[18]，而995 cm-1和1 022 cm-1吸收峰的比值R995/1022反映的是淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)[19-20]，比值越大，形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)越多。

如圖1、圖2所示，與原藕粉相比，多酚作用的過程中沒有新峰出現(xiàn)，即沒有產(chǎn)生新的化學鍵，可知多酚和淀粉是通過非共價相互作用（氫鍵）相結(jié)合的。圖中3 384 cm-1處的吸收峰強度減弱，主要是由于羥基數(shù)的減少，多酚和淀粉鏈之間形成氫鍵，這也可能是結(jié)晶區(qū)較PLRS 顯著升高的原因。與結(jié)晶區(qū)相關(guān)的R1047/1022值如表所示，PLRS以及多酚-PLRS 的R1047/1022值較原淀粉顯著降低（P＜0.05），R1047/1022值的大小排序為原藕粉＞PLRS＞多酚-PLRS，韓雪琴[10]的研究也表明添加多酚后的復合物的R1047/1022值低于原淀粉。從表中得知，淀粉結(jié)晶區(qū)在淀粉的脫支再回生過程中顯著降低（P＜0.05），多酚在此基礎(chǔ)上的作用使得結(jié)晶度顯著升高（P＜0.05），原因可能是多酚和淀粉之間氫鍵的形成。

圖1 原藕粉紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of native lotus root starch

圖2 改性藕粉的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of modified lotus root starch

R995/1022反映的是淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)。由表中可知，在普魯蘭酶作用后再回生的樣品，淀粉的螺旋結(jié)構(gòu)顯著增加，而經(jīng)原花青素、茶多酚、蘋果多酚作用后再回生的樣品的螺旋程度相較于僅使用酶作用的樣品顯著降低（P＜0.05），可知這3 種多酚一定程度上阻礙了淀粉回生，抑制了回生過程中螺旋結(jié)構(gòu)的形成。而與白藜蘆醇作用后樣品的R995/1022值高于其它樣品，對回生的抑制作用不明確，這可能是由于白藜蘆醇本身不溶于水以至于在水相中難以和淀粉結(jié)合[21]。

對比紅外光譜圖中加酶與不加酶R995/1022值的區(qū)別雖不顯著，但多酚-LRS 的R995/1022值低于多酚-PLRS，表明酶和多酚復合改性的藕粉形成了更多的雙螺旋，脫支酶的加入使多酚和淀粉的結(jié)合效率升高。

2.2 多酚對藕粉X 射線衍射圖譜的影響

表1 多酚和普魯蘭酶對蓮子淀粉分子有序結(jié)構(gòu)R1047/1022 與R995/1022 值的影響Table 1 Effects of polyphenols and pullulanase on the ordered structure of R1047/1022 and R995/1022 values of lotus root starch

為研究蓮藕淀粉與多酚復合對蓮藕淀粉晶體結(jié)構(gòu)的影響，采用X 射線衍射儀測定蓮藕淀粉、多酚與蓮藕淀粉的復合物的衍射圖譜。淀粉的晶型分為A 型、B 型、C 型和V 型，C 型是A、B型結(jié)晶的混合[22-23]，配體進入淀粉的螺旋空腔形成V 型結(jié)晶[24]。A 型結(jié)晶在15°，17°，19°，23°處有衍射峰，B 型結(jié)晶在5.6°，17°，22°，24°處有衍射峰，V型結(jié)晶的出峰位置為7°，13.1°，20°[25]。

如圖2和表2所示，原藕粉在17.0°，23.0°附近有強衍射峰，在15.0°和26.6°附近有較弱的反射強度，表明原藕粉的晶型為A 型，改性后的淀粉衍射峰發(fā)生了顯著變化，在衍射角22.0°和24.0°附近出現(xiàn)衍射峰，說明藕粉的晶型由A 型轉(zhuǎn)變?yōu)镃 型，且淀粉原有的特征峰變成了相對平緩的“饅頭峰”，表明淀粉的結(jié)晶度下降，表2也顯示改性后淀粉結(jié)晶度顯著下降，形成了短程有序結(jié)構(gòu)，而多酚-PLRS 與PLRS 相比結(jié)晶度有不同程度的升高，其中原花青素和白藜蘆醇較為顯著。在2.1 節(jié)中提到，多酚可以抑制淀粉的回生，而回生會引起結(jié)晶度的升高，但從表2可以看出，多酚作用后結(jié)晶度反而升高了，推測這可能是由于多酚和淀粉之間形成的氫鍵對結(jié)晶度的影響大于多酚對回生的抑制作用，因而結(jié)晶度整體呈上升趨勢，這與2.1 節(jié)的結(jié)論相符合。而多酚-PLRS 并沒有出現(xiàn)V型結(jié)晶的衍射峰，表明沒有形成V 型結(jié)晶，這可能是由于選取的這幾種多酚分子質(zhì)量較大無法進入淀粉的螺旋腔體。

表2 多酚對藕粉結(jié)晶度的影響Table 2 Effect of polyphenols on the crystallinity of lotus root starch

2.3 多酚對藕粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

圖3 多酚對藕粉X 射線衍射圖譜的影響Fig.3 Effect of polyphenols on the XRD spectra of lotus root starch

用掃描電鏡觀察多酚作用前后淀粉的微觀結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖4所示。未經(jīng)改性的原藕粉顆粒呈長條狀，尺寸較小，大小不一，但表面光滑且完整圓潤，較為分散。圖4b 為PLRS 的微觀形態(tài)，可以看出藕粉的原有結(jié)構(gòu)被完全破壞，改性后的藕粉顆粒結(jié)構(gòu)破碎，呈不規(guī)律的塊狀，且顆粒間有聚集情況，大小不均，表面粗糙，存在深淺不一的孔洞。圖4c～4f 是多酚-PLRS 的微觀結(jié)構(gòu)，蘋果多酚-PLRS（c）多呈塊狀結(jié)構(gòu)，顆粒棱角較尖銳，可以看出顆粒相對于單酶作用的樣品表面雖然粗糙程度有所降低，但表面的孔洞更加細密且開始出現(xiàn)裂紋。茶多酚-PLRS （d） 較PLRS 表面粗糙程度進一步升高，出現(xiàn)“疙瘩”狀的突起，更加疏松。白藜蘆醇-PLRS（e）呈薄厚不均的片層結(jié)構(gòu)，表面有細密的孔洞。而原花青素-PLRS（f）表面較之茶多酚-PLRS、白藜蘆醇-PLRS 更為粗糙，孔洞更深，表面分布著細小的碎片?？梢钥闯觯男院蟮牡矸塾胁煌潭鹊目锥闯霈F(xiàn)，可能是糊化后淀粉結(jié)構(gòu)的破壞加上冷凍干燥過程中水分的蒸發(fā)形成的疏松多孔的結(jié)構(gòu)[26]?？傮w來說，多酚復合物中，茶多酚-PLRS 和原花青素-PLRS 表面更為粗糙，可能是由于這兩者不同程度阻礙了淀粉回生過程中結(jié)構(gòu)的重組，使其結(jié)構(gòu)更為疏松。而觀測到蘋果多酚-PLRS、白藜蘆醇-PLRS 的表面相較于PLRS 的粗糙程度有所緩和，而在XRD 和紅外的結(jié)果分析表明這兩者對回生也存在抑制作用，推測可能是兩者對淀粉回生的抑制作用不明顯。

圖4 多酚對藕粉微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of polyphenols on microstructure of lotus root starch

2.4 多酚對藕粉慢消化特性的影響

如表3所示，對比不同樣品的SDS 含量，PLRS 的SDS 含量和原藕粉相比從16.44%增加到18.05%，增加了9.79%。而藕粉經(jīng)脫支與多酚作用改性后，SDS 含量也有不同程度的增加，這是由于藕粉與多酚的相互作用降低了藕粉的消化性[27-28]。其中，蘋果多酚-PLRS、茶多酚-PLRS 和原花青素-PLRS 的SDS 含量和原藕粉相比顯著增加（P＜0.05），分別增加了18.57%，38.75%和29.92%，而白藜蘆醇-PLRS 的SDS 相對于原藕粉沒有顯著變化。結(jié)合2.1 節(jié)、2.3 節(jié)的結(jié)果可以推測，白藜蘆醇和淀粉可能沒有發(fā)生相互作用，而其它3 種淀粉在淀粉脫支后抑制了淀粉的回生，與淀粉鏈以氫鍵的形式連接，雖然抑制了重結(jié)晶形成更緊密的結(jié)構(gòu)，但是氫鍵的作用對SDS 的影響更顯著，使其整體SDS 含量仍然呈上升趨勢。蘋果多酚-PLRS、茶多酚-PLRS 和原花青素-PLRS 的SDS 含量和PLRS 相比也有不同程度的升高，分別增加了8.42%，26.37%，18.34%，而白藜蘆醇和PLRS相比反而下降，可以得知，蘋果多酚、茶多酚和原花青素三者與普魯蘭酶對淀粉的改性有協(xié)同作用，其中茶多酚-PLRS 的SDS 含量最高，達到22.81%，原花青素-PLRS 其次，為21.36%，而白藜蘆醇與普魯蘭酶則沒有協(xié)同作用。

表3顯示，淀粉在未脫支的情況下直接與多酚進行作用的效果較差，多酚-LRS 的SDS 含量和原藕粉相比均有不同程度的下降。趙蓓蓓[29]研究發(fā)現(xiàn)多酚與淀粉的復合物消化率低于原淀粉，與本試驗結(jié)果不符。本試驗中多酚-LRS 的SDS含量的下降可能是由于未經(jīng)脫支的藕粉與多酚的結(jié)合效率低，形成的氫鍵少，以至于改性中糊化-冷凍干燥的過程對淀粉結(jié)構(gòu)的影響大于藕粉和多酚之間形成氫鍵的影響，試驗結(jié)果的不同可能是由于試驗原料以及淀粉的結(jié)構(gòu)不同。表格橫向比較可以看出，茶多酚-PLRS 和原花青素-PLRS 的SDS 含量遠高于茶多酚-LRS 和原花青素-LRS，蘋果多酚和白藜蘆醇則不顯著，推測這兩種多酚本身與藕粉的結(jié)合度不高，因此受脫支酶的影響較小，而茶多酚-PLRS 與茶多酚-LRS 相比SDS含量增加了36.42%，原花青素-PLRS 與原花青素-LRS 相比增加了53.01%，說明原花青素和普魯蘭酶的協(xié)同作用較好。

表3 多酚對藕粉SDS 含量的影響Table 3 Effect of polyphenols on the SDS content of lotus root starch

部分多酚在淀粉脫支后和淀粉的作用進一步提高了淀粉的SDS 含量，這些多酚與普魯蘭酶有協(xié)同作用，脫支后的淀粉形成了更多的短直鏈，為多酚與淀粉的結(jié)合提供了更多的結(jié)合位點，試驗選取的幾種多酚中，茶多酚與原花青素對淀粉SDS 含量的增益效果相對較好。

3 結(jié)論

本文研究發(fā)現(xiàn)茶多酚、原花青素、蘋果多酚與脫支后的藕粉以氫鍵的形式相互結(jié)合，多酚的加入阻礙了淀粉的回生，不僅改變了藕粉的結(jié)構(gòu)特性，還影響了藕粉的餐后血糖反應，增加了藕粉的SDS 含量，其中茶多酚和原花青素對藕粉SDS 含量的影響相對更顯著，而白藜蘆醇與藕粉的結(jié)合程度較低，紅外和XRD 的結(jié)果顯示，白藜蘆醇對藕粉脫支后回生的抑制效果不明顯，且藕粉SDS含量沒有顯著升高，表明白藜蘆醇并不適用于淀粉改性。此外，普魯蘭酶和多酚有一定協(xié)同作用，脫支后形成的短直鏈產(chǎn)生更多羥基使其與多酚的結(jié)合位點增加，形成了更多的氫鍵，因而SDS 含量較多酚與藕粉直接作用顯著升高。綜上所述，茶多酚-PLRS 和原花青素-PLRS 的各方面表現(xiàn)較好，SDS 含量分別達到了22.81%和21.36%，因此在4種多酚中，茶多酚和原花青素比較適合與普魯蘭酶復合用于淀粉改性，為藕粉改性提供了新的參考。