細葉小檗堿的抑菌穩(wěn)定性及其對細菌蛋白質(zhì)的影響

張俊順，高銘坤，郭 陽，駱嘉原，包怡紅，3*，符 群，3，張海婷

（1 東北林業(yè)大學林學院 哈爾濱 150040 2 中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 北京 100193 3 黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室 哈爾濱 150040）

細葉小檗（Berberis poiretii）為小檗科小檗屬漿果，分布廣泛，主要集中在我國西部地區(qū)，有250 余種，約占世界的50%[1-2]。細葉小檗含有的生物堿有小檗堿、小檗胺和苦參堿等活性物質(zhì)[3-4]，其中小檗堿含量高且具有較強的生物活性[5-6]，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血壓等功能[7-11]。細葉小檗在我國具有悠久的使用歷史，傳統(tǒng)的藥用部位和現(xiàn)代研究大多集中在根、莖等部位，而細葉小檗果實在臨床研究及食品研發(fā)方面同樣具有巨大利用價值[12]。Ding 等[13]對小檗堿的抑菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)小檗堿具有較好的抑菌活性。郭乙冰等[14]發(fā)現(xiàn)小檗堿治療炎癥性腸道疾病的能力較強，具有防治該疾病的潛在優(yōu)勢。Qin 等[15-16]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護作用。Liu 等[17]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿可顯著降低血糖和胰島素水平，改善肝臟中脂肪的積累。

蛋白質(zhì)是生命體遺傳信息的翻譯產(chǎn)物與生物生命活動的主要承擔者，細菌的正常代謝及繁殖等生命活動離不開蛋白質(zhì)的參與[18]。生物堿作為一類重要的活性物質(zhì)，來源廣泛，在食品中有較大的開發(fā)利用價值，如茶葉中的咖啡堿可取代部分食品添加劑和藥物，番茄中的青果堿具有開發(fā)成為天然食品防腐劑的潛力[19]。如今生物堿等小分子類活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系成為近年來的研究熱點。研究小檗堿對細菌蛋白質(zhì)的作用對研究其藥理作用以及在食品防腐方面的應用具有重要意義。本試驗研究細葉小檗果實中的小檗堿對食品中常見的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性，通過紫外線照射、溫度和pH 值的變化研究其穩(wěn)定性，探究小檗堿對菌體中蛋白質(zhì)的影響，也是對小檗堿抑菌穩(wěn)定性研究的重要補充，為天然產(chǎn)物中生物堿的抑菌機理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細葉小檗果實，購于黑龍江省鶴崗市。4 種供試菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和大腸桿菌（Escherichia coli），東北林業(yè)大學微生物試驗室提供；Y31J9H67024 小檗堿標準品（純度≥98%），上海源葉生物科技有限公司。

牛肉膏、蛋白胨、MH（B）培養(yǎng)基、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氯化鈉、丙烯酰胺、叔丁醇、氫氧化鈉等均為分析純試劑，天津市恒興化學試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-5500PC 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；HZQ-F 全溫振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；DYY-5D 型電泳儀電源，北京市六一儀器廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的測定 準確稱量小檗堿標準品2.5 mg，無水乙醇溶解，于25 mL 容量瓶中定容。分別吸取0.5，1，1.5，2，2.5 mL 于25 mL 容量瓶定容，于波長345 nm 處測定吸光度值[20]，小檗堿質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值為縱坐標，計算得標準曲線方程：y=0.0327x＋0.1261，R2=0.9996。

1.3.2 小檗堿的提取 將細葉小檗的果實洗凈，25 ℃干燥至恒重，粉碎后過100 目篩，制得小檗果實粉末備用。準確稱取20 g 粉末置于27%的乙醇溶液，按照液料比32∶1，300 W 超聲功率進行提取小檗堿[21]。使用紫外可見分光光度計測定吸光度，由標準曲線方程計算小檗堿濃度。

1.3.3 小檗堿抑菌活性的測定 采用濾紙片法測定小檗堿對4 種菌的抑菌活性[22]。無菌條件下，將培養(yǎng)基倒入滅過菌的平板冷卻凝固后，取100 μL菌懸液于培養(yǎng)基上并涂布均勻，4 片無菌濾紙片（直徑為6 mm） 放置于含菌平板上，其中3 片每片滴加10 μL 質(zhì)量濃度為4.10 mg/mL 的小檗堿，另一片滴加等量無菌水作為對照，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測量抑菌圈直徑大小。

1.3.4 最低抑菌濃度的測定 將小檗堿提取液進行二倍稀釋，無菌96 孔板內(nèi)滴加20 μL 的4 種供試菌種菌液（107CFU/mL），90 μL 液體培養(yǎng)基，90 μL的不同濃度的提取液，對照組加入等量無菌水，37℃培養(yǎng)12 h 后，每孔取100 μL 涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h 后，以第1 個出現(xiàn)單菌落平板中的小檗堿的濃度為最低抑菌濃度[23]。

1.3.5 溫度對小檗堿抑菌活力變化率的影響 將同濃度的小檗堿在4，25，50，80 和100 ℃的溫度下處理15 min，冷卻至室溫進行抑菌試驗[24]，抑菌圈直徑用L1 表示，L0 表示對照組的抑菌圈直徑，抑菌活力變化率根據(jù)以下公式進行計算。

1.3.6 pH 值對小檗堿抑菌活力變化率的影響用1 mol/L 的NaOH 溶液和1 mol/L 的HCL 溶液調(diào)小檗堿pH 值分別為2，4，6，8，10，靜置15 min后，調(diào)回原pH 值，以蒸餾水作為對照，進行抑菌試驗[25]，觀察并測量不同pH 值下對4 種供試菌抑菌圈的大小，根據(jù)公式（1）計算抑菌活力變化率。

1.3.7 紫外線照射對小檗堿抑菌活力變化率的影響 將濃度相同的小檗堿分別在紫外燈（功率為20 W，垂直距離30 cm） 下照射10，20，30，40，50 min，對照組不進行處理，進行抑菌試驗，觀察并測量不同紫外線照射時間下的抑菌圈的大小[26]，根據(jù)公式（1）計算抑菌活力變化率。

1.3.8 小檗堿對細菌細胞外蛋白質(zhì)濃度的影響

4 種供試菌培養(yǎng)12 h 至對數(shù)生長期，試驗組菌懸液加入1 MIC 的小檗堿，對照組菌懸液加入等量的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS） 0.1 mol/L，置于37℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120 r/min，培養(yǎng)6 h 后取出，6 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍法，用紫外分光光度計于595 nm 處測定吸光值[27]。

1.3.9 小檗堿對細菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的影響4 種供試菌培養(yǎng)12 h 至對數(shù)生長期，試驗組菌懸液加入1 MIC 的小檗堿，對照組菌懸液加入等量0.1 mol/L PBS，置于37 ℃的恒溫振蕩培養(yǎng)箱，120 r/min，培養(yǎng)6 h 后取出，8 000 r/min 離心15 min，收集菌體，使用0.1 mol/L 無菌PBS 洗滌3 次，超聲破碎細胞（破碎條件：工作5 s，間歇15 s，共10 min，功率400 W），8 000 r/min，離心15 min，取上清液備用，以牛血清蛋白作為標準品，采用考馬斯亮藍法，使用紫外分光光度計于595 nm 處測定吸光值[28]。

1.4 小檗堿對細菌蛋白質(zhì)合成的影響

1 MIC 的小檗堿加入至4 種供試菌種的菌懸液（107CFU/mL），對照組加入等量無菌磷酸緩沖溶液（PBS），37 ℃培養(yǎng)12 h 后，5 000 r/min 離心15 min，棄上清液后，PBS 清洗3 次，加入20 μL 上樣緩沖溶液，沸水浴5 min，5 000 r/min 離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE 分析[29]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2010 與SPSS20 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素ANOVA 分析、Duncan 多重比較分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義，數(shù)據(jù)處理結(jié)果表示為“平均值±標準差”的形式。

2 結(jié)果與分析

2.1 小檗堿的抑菌活性及最低抑菌濃度的測定

小檗堿對4 種供試菌的抑菌圈直徑如表1所示，細葉小檗果小檗堿對4 種供試菌都出現(xiàn)了抑菌圈，且具有不同直徑，表明小檗堿對4 種供試菌有較好的抑制作用，其中對大腸桿菌的最低抑菌濃度為2.40 mg/mL，在4 種MIC 值中最小，且抑菌圈直徑最大，為（11.6±0.11）mm，表明小檗堿對大腸桿菌的抑制效果最好，原因可能是大腸桿菌為革蘭氏陰性細菌，與革蘭氏陰性細菌相比，其細胞壁更厚，結(jié)構(gòu)更加致密，對小檗堿具有一定的阻礙作用，難以進入細胞內(nèi)，因此對其抑菌效果減弱。

表1 小檗堿對4 種供試菌種的DIZ 及MIC 值Table 1 DIZ and MIC values of berberine against 4 tested bacteria

2.2 溫度對小檗堿抑菌活力變化率的影響

不同溫度處理對小檗堿抑菌活力變化率的影響如圖1所示，當溫度依次由4 ℃到100 ℃時，金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌活力變化率均呈降低趨勢，分別降至-8.51%，-8.32%，-7.89%和-8.93%，即隨著溫度的升高，小檗堿的抑菌活力降低。原因可能是小檗堿的熱穩(wěn)定性較差，高溫會破壞小檗堿的結(jié)構(gòu)，部分小檗堿發(fā)生降解，從而降低了部分小檗堿的活性。包怡紅等[30]通過研究小檗堿的熱降解模型，發(fā)現(xiàn)高溫會破壞小檗堿的結(jié)構(gòu)，發(fā)生降解且熱降解速率隨著溫度的升高而加快，因此抑菌活性也隨著溫度升高而降低，得出小檗堿最宜儲存溫度在60 ℃以下，在溫度高于90 ℃處理20 h 會使小檗堿完全失活。

圖1 溫度對小檗堿抑菌活力變化率的影響Fig.1 Effect of temperature on the rate of berberine antibacterial activity

2.3 pH 值對小檗堿抑菌活力變化率的影響

pH 值對小檗堿抑菌活力變化率的影響如圖2所示，當pH 值為6 時，小檗堿對4 種供試菌的抑菌活力變化率趨近于0；當pH＜6 時，其抑菌活力變化率為負值，且pH 值越低其抑菌活力減小，當pH 值為2 時，小檗堿對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活力變化率降至最低，分別為-10.45%，-11%，-9.4%和-12%。當pH＞6 時，小檗堿對4 種供試菌的抑菌活力變化率也開始降低，當pH 值為10 時，降至最低，分別為-5.9%，-6.8%，-8%和-8.23%，表明強酸或強堿會破壞小檗堿的結(jié)構(gòu)，導致其抑菌活性降低。在強酸或強堿的條件下穩(wěn)定性較差，可能由于小檗堿帶有正電荷，易與帶有負電荷離子或分子結(jié)合，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，抑菌活性降低[31]。當pH≥6.8 時，小檗堿的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，由抑菌效果較好的季銨型轉(zhuǎn)化為醛型或醇型結(jié)構(gòu)，導致抑菌效果降低[32]。

圖2 pH 值對小檗堿抑菌活力變化率的影響Fig.2 Effect of pH on the rate of berberine antibacterial activity

2.4 紫外線照射對小檗堿抑菌活力變化率的影響

由圖3可知，隨著紫外線照射時間延長（10～50 min），小檗堿的抑菌活力變化率始終保持在-3%與4%之間，基本未發(fā)生變化，說明紫外線照射對小檗堿的抑菌活力基本沒有影響，小檗堿的結(jié)構(gòu)與抑菌性能不受紫外線照射的影響，在紫外線照射的條件下具有較好的穩(wěn)定性。

圖3 紫外線照射對小檗堿抑菌活力變化率的影響Fig.3 Effect of ultraviolet irradiation on the rate of berberine antibacterial activity

2.5 小檗堿對細菌細胞外蛋白質(zhì)濃度的影響

由圖4可知，加入1 MIC 小檗堿的枯草芽孢桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別增加0.0194，0.007，0.0263 和0.0125 mg/mL，與未加入小檗堿的對照組相比均顯著增加（P＜0.05）。原因可能是小檗堿損壞了細胞膜[33]，破壞了細胞膜的完整性，而細胞膜能夠保障細胞生命活動正常進行，使胞內(nèi)的蛋白外泄，因此導致試驗組的蛋白質(zhì)釋放量增大。

圖4 小檗堿對細菌細胞外蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.4 The effect of berberine on the concentration of bacteria extracellular protein

2.6 小檗堿對細菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的影響

由圖5可知，沙門氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細胞外蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別減少0.045，0.013，0.0409 和0.038 mg/mL。加入1 MIC 小檗堿的試驗組蛋白質(zhì)釋放量與未加入小檗堿的對照組相比均顯著降低（P＜0.05），原因可能是小檗堿抑制了細菌胞內(nèi)蛋白的表達，蛋白的合成受阻，造成蛋白含量減少，而蛋白質(zhì)參與生物各項生命活動，從而干擾細菌的正常代謝活動。

圖5 小檗堿對細菌細胞內(nèi)蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.5 The effect of berberine on the protein concentration in bacterial cells

2.7 小檗堿對細菌總蛋白質(zhì)濃度的影響

通過計算細菌細胞總蛋白濃度（細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)濃度總和），來驗證小檗堿對細菌中蛋白質(zhì)合成總量的影響。由圖6可知，加入1 MIC 小檗堿的試驗組細胞外蛋白質(zhì)濃度金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌4 種供試菌的細胞總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別減少0.0284，0.0117，0.0382 和0.009 mg/mL，加入1 MIC 小檗堿的試驗組細菌總蛋白質(zhì)濃度與未加入小檗堿的對照組相比均顯著減少（P＜0.05），說明小檗堿可減少細菌蛋白的合成量，使細菌的蛋白質(zhì)合成受到抑制，進而影響細菌的各項生命活動，達到抑菌效果。

圖6 小檗堿對細菌細胞總蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.6 The effect of berberine on the bacterial protein concentration

2.8 小檗堿對菌體蛋白合成的影響

如圖7所示，試驗組與對照組的蛋白條帶相比具有顯著區(qū)別。總體而言，4 組對照組的條帶數(shù)量明顯多于試驗組，且條帶更清晰。試驗組的金黃色葡萄球菌條帶在44.3 ku 處的條帶與對照組相比明顯變淺，大腸桿菌在116，66.4 ku 與44.3 ku處的條帶消失且條帶數(shù)量均減少，沙門氏菌在44.3 與200 ku 之間的條帶變淺，枯草芽孢桿菌在44.3 ku 附近處的條帶變淺，較不明顯。表明小檗堿抑制了4 種供試菌種細胞內(nèi)蛋白的表達，細菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)減少，與小檗堿對細菌細胞蛋白質(zhì)合成的影響的測定結(jié)果是一致的。

圖7 小檗堿對菌體蛋白合成的影響Fig.7 Effect of berberine on bacterial protein synthesis

3 結(jié)論

如今，綠色健康食品越來越受到消費者的關(guān)注，安全性更高的天然食品防腐劑的開發(fā)利用顯得更加重要。細葉小檗果小檗堿作為一種天然抑菌物質(zhì)，對食品中常見的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌均有抑制作用，其中對大腸桿菌的抑制效果更好，DIZ 與MIC 的值分別為（11.6±0.11）mm 和2.40 mg/mL。紫外線照射對小檗堿的抑菌活力幾乎沒有影響，強酸、強堿及高溫會破壞部分小檗堿的結(jié)構(gòu)，使其抑菌活力降低，表明紫外線照射對小檗堿的穩(wěn)定性基本沒有影響，而在強酸、強堿及高溫條件下穩(wěn)定性較差。此外，小檗堿可使4 種供試菌細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)外泄，導致細胞外的蛋白質(zhì)濃度增大，同時也會抑制細胞內(nèi)蛋白的表達，使細胞總蛋白濃度減少，從而發(fā)揮其抑菌作用，因此，細葉小檗果小檗堿具有開發(fā)成為天然食品防腐劑的潛力，此后應進行細胞毒性試驗和食品應用中的研究，確定其安全性，為其在天然食品防腐劑中的開發(fā)應用以及進一步探究小檗堿與細菌中蛋白質(zhì)的相互作用關(guān)系提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。