蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯品質(zhì)及微生物多樣性的影響

張 娟 史文嬌* 韓雪林 張 磊 李蘇濤,2 馮啟賢 李 妍,2 陽(yáng)伏林* 周 晶

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002)

圓葉決明是一種生長(zhǎng)于熱帶地區(qū)的多年生豆科決明屬植物[1]，起源自北美洲、中美洲和南美洲北部[2]，適應(yīng)性極強(qiáng)，具有耐高溫、耐酸、耐旱、耐貧瘠等生理特征[3]。圓葉決明是我國(guó)亞熱帶地區(qū)為數(shù)不多的豆科牧草之一，其粗蛋白質(zhì)(crude protein，CP)含量高(初花期可達(dá)15%)，且無(wú)毒無(wú)異味，適口性較好，因此具備成為反芻動(dòng)物優(yōu)質(zhì)牧草的潛質(zhì)。近年來(lái)，為了加快圓葉決明在廣東、福建等區(qū)域的應(yīng)用推廣，科研人員主要針對(duì)其品種繁育與生理生態(tài)特征開(kāi)展了較多工作[4]。圓葉決明生長(zhǎng)具有明顯的季節(jié)性，夏季生長(zhǎng)茂盛，冬季枯黃，生物量低，無(wú)法滿(mǎn)足畜禽對(duì)全年優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)牧草的需求。因此，在實(shí)際牧草生產(chǎn)過(guò)程中，常用的做法是在牧草生產(chǎn)盛期對(duì)其進(jìn)行刈割加工處理，以實(shí)現(xiàn)飼草料全年供求平衡。然而，我國(guó)南方地區(qū)多雨、潮濕，干草制備不易實(shí)現(xiàn)。所以，開(kāi)展青貯技術(shù)的開(kāi)發(fā)和利用研究有較好前景。研究表明，在青貯過(guò)程中，微生物變化是導(dǎo)致發(fā)酵飼料腐敗變質(zhì)的主要原因之一。因此，為更好預(yù)防青貯飼料的腐敗變質(zhì)，本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序方法鑒定青貯后不同處理之間微生物群落變化，相較于傳統(tǒng)的測(cè)定方法，該方法能夠更系統(tǒng)準(zhǔn)確鑒定物種多樣性和豐富度，從微觀角度分析青貯后微生物群落變化。

蘋(píng)果酸作為一種良好的新型青貯飼料添加劑，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，可快速降低pH，減少蛋白質(zhì)水解，加速乳酸菌的生長(zhǎng)，抑制酵母菌和霉菌的生長(zhǎng)[5-6]，提高微生物氮產(chǎn)量，減少甲烷產(chǎn)量，提高飼料的利用率[7]。由于青貯原料表面乳酸菌含量較少，自然發(fā)酵較難，因此采用添加青貯飼料添加劑的方法來(lái)改善青貯飼料品質(zhì)。目前，國(guó)內(nèi)外青貯飼料添加劑主要采用乳酸菌，它可通過(guò)增強(qiáng)乳酸菌活動(dòng)提高青貯原料中優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度，降低pH，加速發(fā)酵，抑制有害菌增殖，從而提高青貯品質(zhì)[8-9]。目前，添加蘋(píng)果酸和乳酸菌對(duì)各類(lèi)青貯原料的效果不一，其對(duì)圓葉決明青貯方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在探究蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯品質(zhì)的影響，并結(jié)合高通量測(cè)序解析青貯后微生物群落變化，為后續(xù)圓葉決明作為青貯飼料在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

圓葉決明于2020年9月采自福建省漳州市漳浦縣萬(wàn)安牧場(chǎng)種植區(qū)，距離地面8～10 cm處進(jìn)行刈割。圓葉決明原料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)見(jiàn)表1。蘋(píng)果酸(純度≥99.0%)購(gòu)自某生物科技有限公司，嗜酸乳桿菌(活菌數(shù)≥5×1010CFU/g)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

表1 圓葉決明原料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Nutritional quality of raw materials of Chamaecrista rotundifolia (DM basis) %

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本課題組經(jīng)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，得到圓葉決明青貯中蘋(píng)果酸適宜添加比例為1%(鮮重)。試驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組(CK組，無(wú)添加)、嗜酸乳桿菌組(試驗(yàn)Ⅰ組，添加1×106CFU/g嗜酸乳桿菌)、蘋(píng)果酸組(試驗(yàn)Ⅱ組，添加1%蘋(píng)果酸)、蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌組(試驗(yàn)Ⅲ組，添加1%蘋(píng)果+1×106CFU/g嗜酸乳桿菌)，每組3個(gè)重復(fù)，添加量均以鮮重為基礎(chǔ)，各組均勻噴灑10 mL配制好的添加劑與無(wú)菌水混合液。

1.3 青貯制作

將刈割的圓葉決明進(jìn)行晾曬至干物質(zhì)(dry matter，DM)含量25%左右，使用鍘刀切至1～2 cm小段，然后將不同添加處理的蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌均勻噴灑至晾曬后的圓葉決明，之后進(jìn)行裝袋，每袋400 g，混合均勻，每組3個(gè)重復(fù)，使用真空密封機(jī)進(jìn)行壓實(shí)抽氣。室溫儲(chǔ)存，青貯60 d拆封，取樣分析。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵特性

取200 g具有代表性的樣品，于65 ℃烘箱中烘干72 h，測(cè)定DM含量，將干燥樣粉碎過(guò)篩，測(cè)定基本營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。CP含量采用KDN-103F自動(dòng)定氮儀測(cè)定，中性洗滌纖維(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber，ADF)含量采用范式纖維法測(cè)定[10]，水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrates，WSC)含量采用蒽酮-硫酸比色法測(cè)定[11]。

取10 g具有代表性的樣品，加入90 mL純水于4 ℃冰箱浸提24 h，經(jīng)4層紗布過(guò)濾得到浸提液，即時(shí)測(cè)定pH，剩余樣品分裝保存用于氨態(tài)氮(NH3-N)和有機(jī)酸含量的測(cè)定。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法測(cè)定[12]，有機(jī)酸中乳酸(lactic acid，LA)、乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)含量采用高效液相儀(CT0-10AS，日本島津公司)測(cè)定[13-14]。

1.4.2 微生物多樣性測(cè)定

1.5 數(shù)據(jù)分析

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)利用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并繪制圖表，利用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan氏法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響

由表2可知，與CK組相比，各試驗(yàn)組DM和CP含量顯著升高(P<0.05)，但各試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與CK組相比，各試驗(yàn)組NDF含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅱ組NDF含量顯著低于試驗(yàn)Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅲ組NDF含量顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組ADF含量顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅲ組WSC含量顯著升高(P<0.05)，而試驗(yàn)Ⅰ組WSC含量顯著降低(P<0.05)。

表2 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on nutritional quality of Chamaecrista rotundifolia silage (DM basis) %

2.2 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯發(fā)酵特性的影響

由表3可知，與CK組相比，各試驗(yàn)組pH顯著降低(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組pH顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組氨態(tài)氮含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅲ組氨態(tài)氮含量顯著低于試驗(yàn)Ⅱ組(P<0.05)。與CK組相比，各試驗(yàn)組LA含量顯著增加(P<0.05)，但試驗(yàn)組之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組AA含量顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，各試驗(yàn)組PA含量顯著降低(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅱ組PA含量顯著低于試驗(yàn)Ⅰ和Ⅲ組(P<0.05)。

表3 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯發(fā)酵特性的影響(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 3 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on fermentation characteristics of Chamaecrista rotundifolia silage (DM basis)

2.3 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯微生物多樣性的影響

2.3.1 OTU分析

以97%的一致性進(jìn)行OTU聚類(lèi)，4組共得到1 919個(gè)不同的OTU。由圖1可知，與CK組相比，各試驗(yàn)組OTU數(shù)量明顯增加，4組OTU數(shù)量依次為試驗(yàn)Ⅲ組>試驗(yàn)Ⅰ組>試驗(yàn)Ⅱ組>CK組。其中，4組中核心OTU數(shù)量為151個(gè)，CK組及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組特有OTU數(shù)量分別為51、150、112、248個(gè)。

CK：對(duì)照組 control group；Ⅰ： Ⅰ組 group Ⅰ；Ⅱ：group Ⅱ； Ⅲ：group Ⅲ。下圖同 the same as below。圖1 青貯后微生物OTU分布Venn圖Fig.1 Venn diagram of microbial OTU distribution after silage

稀釋曲線能夠反映測(cè)序數(shù)據(jù)量的合理性及樣品的物種豐富度[15]。由圖2可知，樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量為40 120個(gè)，隨著測(cè)序數(shù)據(jù)量的增加，稀釋曲線逐漸趨于平緩，表明本次測(cè)序結(jié)果較為合理。

圖2 各組稀釋曲線Fig.2 Dilution curves of each group

2.3.2 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯微生物α多樣性的影響

α多樣性分析包含群落物種多樣性和豐富度的分析，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用于估計(jì)群落樣本中包含的物種總數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)用來(lái)描述群落多樣性(物種豐富度和均勻度)。由表4可知，與CK組相比，試驗(yàn)Ⅲ組Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)顯著增加(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅲ組Shannon指數(shù)顯著高于試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組(P<0.05)，試驗(yàn)Ⅲ組ACE指數(shù)顯著高于試驗(yàn)Ⅰ組(P<0.05)。

表4 各組α多樣性分析Table 4 Alpha diversity analysis of each groups

2.3.3 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯門(mén)水平微生物群落組成的影響

由圖3和表5可知，各組圓葉決明青貯門(mén)水平微生物群落組成無(wú)明顯差異，其中CK組優(yōu)勢(shì)菌門(mén)主要為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，73.20%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，23.45%)，兩者總相對(duì)豐度達(dá)96.65%。與試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度顯著下降(P<0.05)。與CK和試驗(yàn)Ⅰ組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組藍(lán)藻菌門(mén)(Cyanobacteria)相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅱ組藍(lán)藻菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅲ組擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Actinobacteriota：放線菌門(mén)；Bacteroidota：擬桿菌門(mén)；Halanaerobiaeota：鹽厭氧菌門(mén)；Campilobacterota：彎曲桿菌門(mén)；unidentified_Bacteria：不明細(xì)菌；Deinococcota：脫氨基可卡因菌門(mén)；Acidobacteriota：酸桿菌門(mén)；Others：其他。圖3 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯門(mén)水平微生物群落組成的影響Fig.3 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on microbial community composition at phylum level of Chamaecrista rotundifolia silage

表5 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度的影響Table 5 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on dominant bacterial phyla relative abundance of Chamaecrista rotundifolia silage %

2.3.4 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯屬水平微生物群落組成的影響

由圖4和表6可知，各組圓葉決明青貯屬水平優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_12)、腸桿菌屬(Enterobacter)等。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅰ和Ⅱ組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅰ組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著高于試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，各試驗(yàn)組梭狀芽孢桿菌屬、果膠桿菌屬(Pectobacterium)相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組未被定義葉綠體(unidentified_chloroplast)相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)；其中，試驗(yàn)Ⅱ組未被定義葉綠體相對(duì)豐度顯著高于試驗(yàn)Ⅲ組(P<0.05)。與CK組相比，試驗(yàn)Ⅲ組普氏梭菌屬(Faecalibacterium)相對(duì)豐度顯著增加(P<0.05)。

Lactobacillus：乳桿菌屬；Clostridium_sensu_stricto_12：梭狀芽孢桿菌屬；unidentified_chloroplast：未被定義葉綠體；Enterobacter：腸桿菌屬；Ochrobactrum：蒼白桿菌屬；Methylobacterium-Methylorubrum：甲基桿菌屬；Faecalibacterium：普氏梭菌屬；Pectobacterium：果膠桿菌屬；Weissella：魏斯氏菌屬；Others：其他。圖4 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯屬水平微生物群落組成的影響Fig.4 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on microbial community composition at genus level of Chamaecrista rotundifolia silage

表6 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度的影響Table 6 Effects of malic acid and Lactobacillus acidophilus on dominant bacterial genus relative abundance of Chamaecrista rotundifolia silage %

2.3.5 各組之間圓葉決明青貯微生物群落的差異物種

由圖5可知，通過(guò)LEfSe分析(線性判別分析分?jǐn)?shù)>4)對(duì)圓葉決明青貯微生物群落的差異物種進(jìn)行分析，4組中共找到27個(gè)相對(duì)豐度差異的物種。門(mén)水平差異物種為試驗(yàn)Ⅱ中藍(lán)藻菌門(mén)；屬水平差異物種為試驗(yàn)Ⅰ中乳桿菌屬，試驗(yàn)Ⅱ組中未被定義葉綠體，試驗(yàn)Ⅲ組中山羊葡萄球菌屬(Staphylococcus_caprae)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium_prausnitzii)和殼聚糖酶產(chǎn)生菌屬(Mitsuaria)。CK組在門(mén)水平和屬水平均無(wú)差異物種出現(xiàn)。

Lachnospirales：無(wú)色螺旋菌目；Lachnospiraceae：螺旋藻科；Rhizobiaceae：根瘤菌科；Staphylococcus_caprae：山羊葡萄球菌屬；Oscillospirales：示波螺旋目；Mitsuaria：殼聚糖酶產(chǎn)生菌屬；Mitsuaria：松江菌屬；Ruminococcaceae：瘤胃球菌科；Faecalibacterium_prausnitzii：普拉梭菌屬；Staphylococcus：葡萄球菌；Lactobacillus_pantheris：混合乳酸桿菌；unidentified_chloroplast：未被定義葉綠體；Chloroplast：葉綠體；Cyanobacteria：藍(lán)藻菌門(mén)； Bacilli：桿菌綱；Lactobacillales：乳桿菌目；Lactobacillus：乳桿菌屬；Lactobacillus_rhamnosus：鼠李糖乳桿菌；Lactobacillus_zymae：乳酸桿菌；Clostridia：梭狀芽胞桿菌；Lactobacillus_dextrinicus：乳酸桿菌屬。圖5 各組之間圓葉決明青貯微生物群落的差異物種Fig.5 Different species of Chamaecrista rotundifolia microbial community silage among all groups

3 討 論

3.1 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和發(fā)酵特性的影響

本試驗(yàn)通過(guò)添加蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明進(jìn)行青貯處理，主要目的是通過(guò)快速降低pH，抑制CP降解，提高圓葉決明青貯飼料品質(zhì)。pH的快速降低可抑制有害菌活性，防止蛋白質(zhì)降解。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有添加劑處理的青貯飼料pH顯著降低，表明該添加劑均能有效改善圓葉決明青貯品質(zhì)，這一結(jié)論與Ke等[16]研究結(jié)果一致。有機(jī)酸、氨態(tài)氮是判定青貯飼料品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，是乳酸菌與有害菌競(jìng)爭(zhēng)的代謝產(chǎn)物。AA、PA在提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面均具有良好的效果[17]，AA具有很好的抑菌作用，可有效抑制開(kāi)窖后腐敗菌的繁殖[18]；PA可抑制好氧菌、酵母菌及梭菌增殖[19]，從而減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的降解，保障青貯飼料品質(zhì)。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組AA、PA含量顯著低于CK組，可能是因?yàn)閜H的快速降低抑制有害菌增殖，發(fā)酵過(guò)程以同型發(fā)酵為主[20]，并且隨著青貯的持續(xù)發(fā)酵，乳酸菌含量不斷積累，蘋(píng)果酸同時(shí)會(huì)向LA轉(zhuǎn)變[21]，因此這也導(dǎo)致添加試驗(yàn)Ⅱ組LA含量顯著升高，AA含量顯著下降。有機(jī)酸的添加會(huì)使秸稈軟化濕潤(rùn)，纖維結(jié)構(gòu)松散，有利于NDF和ADF含量的降低[22]。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組NDF和ADF含量顯著低于CK組，表明添加蘋(píng)果酸具有降低NDF和ADF含量的效果；而與試驗(yàn)Ⅱ組相比，試驗(yàn)Ⅲ組NDF和ADF含量均升高，表明混合添加蘋(píng)果酸和乳桿菌對(duì)降低圓葉決明青貯纖維含量有抑制作用。李孟偉等[23]在研究蘋(píng)果酸對(duì)反芻動(dòng)物生長(zhǎng)性能和瘤胃發(fā)酵的影響中發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酸作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，可有效提高CP含量和木質(zhì)纖維素的表觀消化率，減少青貯飼料氨態(tài)氮的產(chǎn)生。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅱ組氨態(tài)氮含量顯著低于CK組，與上述結(jié)果一致；試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組DM、CP、WSC含量顯著升高。這說(shuō)明添加蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌可減少DM損失，抑制蛋白質(zhì)水解，原因可能是蘋(píng)果酸為整個(gè)青貯過(guò)程提供了更多的發(fā)酵底物[24]；嗜酸乳桿菌能夠加快發(fā)酵進(jìn)程，抑制有害菌活性，減少底物損耗，從而保證青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。但本試驗(yàn)中，與CK組相比，試驗(yàn)Ⅰ組WSC含量顯著減少，可能是添加嗜酸乳桿菌加大了對(duì)發(fā)酵底物的需求，從而使青貯飼料的WSC含量顯著降低。

3.2 蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌對(duì)圓葉決明青貯微生物多樣性的影響

青貯是一個(gè)微生物群落演變的過(guò)程，主要是有益菌逐漸主導(dǎo)，抑制有害菌群生長(zhǎng)的過(guò)程[25]。α多樣性主要反映微生物群落物種豐富度、多樣性及測(cè)序深度，主要通過(guò)Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)物種的豐富度，Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)物種的多樣性。李莉等[26]在研究象草中添加纖維素酶和淀粉青貯30 d后發(fā)現(xiàn)，添加纖維素酶和淀粉組Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅲ組OTU數(shù)量、Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)均高于CK組，表明試驗(yàn)Ⅲ組物種多樣性和豐富度較高；但在本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅰ組Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)低于CK組，ACE指數(shù)高于CK組，表明添加嗜酸乳桿菌有益于圓葉決明青貯乳酸桿菌增殖，抑制有害菌增殖。

本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，圓葉決明青貯后門(mén)水平優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，其次為藍(lán)藻菌門(mén)，與He等[27]研究結(jié)果一致。厚壁菌門(mén)是革蘭氏陽(yáng)性菌，主要包括產(chǎn)芽孢、非產(chǎn)芽孢和支原體菌群，可降解大分子物質(zhì)，如纖維素、淀粉、蛋白質(zhì)等[28]，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)可同時(shí)降解纖維類(lèi)物質(zhì)，為微生物活動(dòng)提供更多底物[29]。變形菌門(mén)是一類(lèi)革蘭氏陰性菌，包括很多病原菌，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等[30]，可與乳酸菌競(jìng)爭(zhēng)底物，且會(huì)導(dǎo)致CP含量下降和氨態(tài)氮含量的升高。擬桿菌門(mén)可做為糖、淀粉等非纖維性碳水化合物的主要分解者[31]，可有效改善動(dòng)物腸道微生物環(huán)境。藍(lán)藻菌門(mén)作為熱帶牧草的主要微生物，在發(fā)酵過(guò)程中通常會(huì)被乳桿菌屬和腸桿菌屬所代替[32]。

通過(guò)進(jìn)一步分析圓葉決明青貯后微生物群落變化，結(jié)果表明，各組微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，各組優(yōu)勢(shì)菌屬均為乳桿菌屬，但經(jīng)屬水平物種注釋及LEfSe分析，試驗(yàn)Ⅰ組乳桿菌屬相對(duì)豐度高達(dá)87.05%，顯著高于CK組。乳桿菌屬是厚壁菌門(mén)的一種菌屬，在青貯過(guò)程中能產(chǎn)生LA，快速降低pH[33]，同時(shí)會(huì)抑制有害菌的滋生，進(jìn)而減少CP、WSC含量的降解。Yang等[34]研究結(jié)果表明青貯飼料中LA含量與乳桿菌屬相對(duì)豐度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組LA含量顯著高于CK組，且試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組，這可能是由于添加的蘋(píng)果酸導(dǎo)致較強(qiáng)的酸性環(huán)境反而抑制乳酸菌的活性[35]，從而使得乳桿菌屬相對(duì)豐度顯著降低；且通過(guò)α多樣性分析發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)Ⅰ組的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較低，表示該組微生物多樣性較低，因此添加嗜酸乳桿菌使得乳酸菌能夠快速主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵過(guò)程，從而抑制有害菌的增殖，當(dāng)乳桿菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)，微生物多樣性呈下降狀態(tài)[36]。研究表明，梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬均可利用青貯飼料的LA和WSC，產(chǎn)生丁酸[37-38]，阻止乳酸菌生長(zhǎng)，且可通過(guò)氧化還原反應(yīng)導(dǎo)致青貯飼料的腐敗變質(zhì)[39]。腸桿菌屬的存在可能會(huì)消耗底物產(chǎn)生氨態(tài)氮，同時(shí)促進(jìn)青貯飼料蛋白質(zhì)的降解，破壞青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)成分，這也可能是導(dǎo)致試驗(yàn)組氨態(tài)氮含量較低的主要原因。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組LA含量顯著增加，梭狀芽孢桿菌屬和腸桿菌屬相對(duì)豐度降低，說(shuō)明各試驗(yàn)組通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的LA足以將pH降低至抑制腸桿菌屬和梭狀芽孢桿菌屬增殖的水平，使其有助于提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)；試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組較低的AA含量可能是試驗(yàn)組較低的腸桿菌屬相對(duì)豐度抑制了將LA轉(zhuǎn)變?yōu)锳A的過(guò)程[40]，因此導(dǎo)致試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組AA含量顯著降低。此外，通過(guò)LEfSe分析，顯示試驗(yàn)Ⅲ組中屬水平差異物種為普拉梭菌屬。研究表明，普拉梭菌屬是糞桿菌屬種的唯一種屬，其自身有助于丁酸鹽的產(chǎn)生[41]，在生產(chǎn)中丁酸多以丁酸鹽和丁酸甘油酯的形式存在，較高含量的丁酸會(huì)促進(jìn)有害微生物分解蛋白質(zhì)、糖類(lèi)等物質(zhì)，因此較高的普拉梭菌屬相對(duì)豐度會(huì)降低青貯飼料品質(zhì)。

4 結(jié) 論

蘋(píng)果酸和嗜酸乳桿菌均能有效改善圓葉決明青貯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)、發(fā)酵特性，具體表現(xiàn)在DM、CP和LA含量升高，氨態(tài)氮含量下降；并且能夠改善圓葉決明青貯微生物的結(jié)構(gòu)和組成，具體表現(xiàn)在乳桿菌屬相對(duì)豐度增加，變形菌門(mén)、梭狀芽孢桿菌屬、腸桿菌屬相對(duì)豐度降低。本試驗(yàn)條件下，以單獨(dú)添加嗜酸乳桿菌青貯效果較好。

致謝：

感謝福建農(nóng)林大學(xué)莊益芬教授在青貯試驗(yàn)過(guò)程中的指導(dǎo)；感謝福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院陳鑫珠、黃秀聲、楊有泉等老師在試驗(yàn)材料與試驗(yàn)菌株獲取方面的幫助。