飼糧中添加凹凸棒土對荷斯坦?fàn)倥ＩL性能、腹瀉率、血清生化指標(biāo)和腸道菌群的影響

王 棟 杜垣逸 鄭 鐸 尤振東 劉 云

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

犢牛腹瀉發(fā)病率高，且容易繼發(fā)感染呼吸道疾病，是造成犢牛生長遲緩和死亡的主要原因之一，給奶牛養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。生產(chǎn)上主要使用抗生素防控犢牛腹瀉，雖然抗生素可以有效緩解犢牛腹瀉，提高犢牛的生長性能，但由于抗生素的耐藥性和殘留問題越來越受到社會的關(guān)注[2]，此外，我國也已經(jīng)全面停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料。因此，尋找合適的抗生素替代品便成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。

凹凸棒土(palygorskite，PAL)，又名坡縷石，是一種硅鎂鋁酸鹽粘土礦物質(zhì)，廣泛存在于自然界，其特有的層狀晶體結(jié)構(gòu)賦予其良好的吸附性、離子交換性、流變性、脫色性以及粘性等理化特性[3]。在動物生產(chǎn)上，PAL具有促進(jìn)動物機(jī)體新陳代謝，提高飼料轉(zhuǎn)化率，提高抗氧化能力，改善機(jī)體免疫狀態(tài)和抑制致病菌定植的作用[4]。研究表明，飼糧中添加PAL可以有效地吸附黃曲霉毒素，緩解黃曲霉毒素對仔豬和肉雞的損傷[5]。Zhang等[6]的研究表明，飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL能降低斷奶仔豬的斷奶應(yīng)激，改善腸道屏障功能，降低腹瀉率，提高生長性能。此外，Qiao等[7]的研究還發(fā)現(xiàn)PAL具有調(diào)節(jié)蛋雞盲腸微生物菌群的作用。目前，PAL的研究主要集中在豬、肉雞和蛋雞，尚缺乏對犢牛的相關(guān)研究。因此，本研究以荷斯坦?fàn)倥檠芯繉ο?，通過在飼糧中添加PAL研究其對犢牛生長性能、腹瀉率、血清生化指標(biāo)和腸道菌群的影響，為PAL在犢牛生產(chǎn)中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用PAL中凹凸棒含量≥75%，膨潤土含量≤25%，鎂含量<4%，水分含量≤18%，粒度為60目。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計與飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗(yàn)在黑龍江省尚志市現(xiàn)代牧業(yè)進(jìn)行。選取健康的初生犢牛30頭，采用單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計，隨機(jī)分為2個組，每個組15個重復(fù)，每個重復(fù)1頭牛。犢牛于出生后2 h內(nèi)灌服初乳4 L。第2～21天，飼喂常乳，每天2次(08:00、16:30)，每次3 L。第22～31天，飼喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次4.5 L。第32天至斷奶，飼喂代乳粉，每天2次(08:00、16:30)，每次5 L。代乳粉主要成分含量：乳糖≥40%，蛋白質(zhì)≥22%，脂肪≥19%，水分≤4.0%，粗灰分≤8.0%，粗纖維≤0.3%。代乳粉用37 ℃溫水稀釋(150 g/L)后飼喂。犢牛出生后第3天開始添加開食料，其中對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，PAL組飼喂基礎(chǔ)飼糧+2 000 mg/kg PAL，自由采食和飲水?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。PAL的使用劑量參考Zhang等[6]的研究結(jié)果。試驗(yàn)期63 d，分3個階段：飼喂牛乳階段(1～21日齡)，飼喂代乳粉階段(22～56日齡)和斷奶后1周(57～63日齡)。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) %

1.3 樣品采集與指標(biāo)檢測

1.3.1 生長性能和腹瀉率

準(zhǔn)確稱量犢牛初生體重并在犢牛21、56和63日齡晨飼前空腹稱重，計算犢牛的平均日增重(ADG)。試驗(yàn)期間準(zhǔn)確記錄犢牛的采食量，計算犢牛平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。根據(jù)Wen等[8]的方法進(jìn)行糞便評分(0=堅固，1=黏稠度疏松或適中，2=非常松散或輕度腹瀉，3=水樣稀便)，糞便評分≥2，連續(xù)2 d或以上定義為腹瀉，記錄犢牛腹瀉天數(shù)和腹瀉頭數(shù)，計算腹瀉率。

腹瀉率(%)=[腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)/
(試驗(yàn)頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù))]×100。

1.3.2 血清生化指標(biāo)

犢牛分別于21、56和63日齡晨飼前進(jìn)行頸靜脈采血，離心后制備血清。采用全自動生化儀檢測犢牛血清總蛋白(TP)濃度。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法在全自動生化儀上檢測檢測血清免疫球蛋白[免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)]、炎癥因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)]、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGFs)濃度。犢牛血清抗氧化指標(biāo)[總超氧化物歧化酶(T-SOD)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、總抗氧化能力(T-AOC)以及丙二醛(MDA)濃度]采用分光光度計法測定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3.3 腸道菌群

分別于21、56和63日齡晨飼前無菌采集犢牛直腸糞便，采用實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)法檢測犢牛直腸糞便中菌群的組成，具體操作參考焦金真等[9]的方法。采用TIANamp Stool DNA Kit試劑盒提取直腸糞便總細(xì)菌DNA，用ND-1000分析儀檢測DNA的濃度和純度。首先將提取的總細(xì)菌DNA分別與不同濃度總細(xì)菌、棲瘤胃普雷沃氏菌、大腸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌和乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行qPCR檢測，將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度和Ct值做回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣品Ct值帶入回歸方程計算目標(biāo)菌屬DNA拷貝數(shù)，結(jié)果用每克內(nèi)容物中細(xì)菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)[lg(拷貝數(shù)/g)]表示。PCR所用引物見表2。

表2 微生物的特異性引物序列Table 2 Specific primer sequences for microbes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，采用軟件SPSS 20.0的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行組間試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，P<0.05時為差異顯著，P<0.01時為差異極顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié) 果

2.1 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能的影響

由表3可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL可顯著提高1～21日齡犢牛的ADG(P<0.05)，顯著增加1～21日齡和57～63日齡犢牛的ADFI(P<0.05)；飼糧中添加PAL增加了22～56日齡和57～63日齡犢牛的ADG，但差異不顯著(P>0.05)；在整個試驗(yàn)期間，與對照組相比，飼糧中添加PAL對犢牛的F/G無顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能的影響Table 3 Effects of PAL supplementation on growth performance of calves

2.2 飼糧中添加PAL對犢牛糞便評分和腹瀉率的影響

由表4可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL可顯著降低1～21日齡和57～63日齡犢牛的糞便評分(P<0.05)，對22～56日齡犢牛的糞便評分無顯著影響(P>0.05)；飼糧中添加PAL在不同階段均降低了犢牛的腹瀉率，其中1～21日齡和57～63日齡犢牛的腹瀉率顯著低于對照組(P<0.05)。

表4 飼糧中添加PAL對犢牛糞便評分和腹瀉率的影響Table 4 Effects of PAL supplementation on fecal score and diarrhea incidence of calves

2.3 飼糧中添加PAL對犢牛血清TP、GH、IGFs以及免疫球蛋白濃度的影響

由表5可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL對各日齡犢牛血清TP、GH、IGFs的濃度均無顯著影響(P>0.05)。與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IgA、IgM以及56日齡犢牛血清IgG和63日齡犢牛血清IgA的濃度(P<0.05)。

表5 飼糧中添加PAL對犢牛血清TP、GH、IGFs和免疫球蛋白濃度的影響Table 5 Effects of PAL supplementation on serum TP, GH, IGFs and immunoglobulin concentrations of calves

續(xù)表5項目 Items日齡 Days of age組別 Groups對照 Control凹凸棒土 PALP值 P-value免疫球蛋白AIgA/(μg/mL)2164.04±1.91b75.55±3.86a0.0445666.01±3.1382.28±6.490.0876367.55±2.22b82.58±3.83a0.028免疫球蛋白GIgG/(μg/mL)21895.35±30.251164.58±35.810.12156860.91±56.81b1219.63±50.83a0.03663956.23±52.201195.91±59.530.119免疫球蛋白MIgM/(μg/mL)2166.81±5.01b82.01±2.15a0.0495669.20±5.3280.21±9.830.3816378.44±6.0298.95±10.100.228

2.4 飼糧中添加PAL對犢牛血清炎癥因子濃度和抗氧化指標(biāo)的影響

由表6可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IL-4的濃度(P<0.05)，顯著降低了63日齡犢牛血清TNF-α和IL-6的濃度(P<0.05)。與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了63日齡犢牛血清GSH-Px的活性和T-AOC(P<0.05)，顯著降低了63日齡犢牛血清MDA的濃度(P<0.05)。

表6 飼糧中添加PAL對犢牛血清炎癥因子濃度和抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of PAL supplementation on serum inflammation cytokine concentrations and antioxidant indexes of calves

2.5 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響

由表7可知，與對照組相比，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛腸道總菌以及63日齡犢牛腸道雙歧桿菌和芽孢桿菌的數(shù)量(P<0.05)，顯著降低了21和63日齡犢牛腸道大腸桿菌的數(shù)量(P<0.05)，對犢牛腸道乳酸菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量沒有顯著影響(P>0.05)。

表7 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響Table 7 Effects of PAL supplementation on intestinal microflora of calves lg(拷貝數(shù)/g)

3 討 論

3.1 飼糧中添加PAL對犢牛生長性能和腹瀉率的影響

犢牛腹瀉是犢牛的多發(fā)疾病，也是世界各地養(yǎng)牛企業(yè)生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)損失的主要原因。2007年美國乳制品國家動物健康監(jiān)測系統(tǒng)的報告指出，半數(shù)未斷奶犢牛的死亡歸因于腹瀉[13]。因此，對腹瀉的有效防控是犢牛生產(chǎn)管理中的一項重要議題。研究發(fā)現(xiàn)，PAL不但能夠改善飼糧的適口性，促進(jìn)動物機(jī)體新陳代謝和提高飼料轉(zhuǎn)化率，而且還具有吸除腸道毒素，提高腸道屏障完整性和維持腸道微生態(tài)平衡的作用[14]。對泌乳奶牛的研究表明，飼糧中添加PAL能顯著提高泌乳奶牛的產(chǎn)奶量和牛乳中蛋白質(zhì)的含量，且無毒副作用[15]。在斷奶仔豬[16]和肉雞[17]的研究中發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL可顯著提高生長性能且與抗生素促生長劑的差異不顯著。此外，Su等[18]的研究表明，飼糧中添加PAL能通過增加肉雞空腸和回腸的絨毛高度以及黏蛋白2(MUC2)、閉鎖連接蛋白-1(ZO-1)和緊密連接蛋白2(Claudin2)的mRNA和蛋白表達(dá)提高腸道屏障的功能，降低腹瀉率，提高生長性能。Lv等[19]的研究也表明，飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL能顯著降低斷奶仔豬的糞便評分和腹瀉率，提高生長性能。目前，對PAL的研究主要集中于仔豬和肉雞，缺乏對犢牛的相關(guān)研究。本研究通過在犢牛飼糧中添加2 000 mg/kg的PAL發(fā)現(xiàn)，添加PAL不但顯著提高了1～21日齡犢牛的ADG和ADFI，而且顯著降低了1～21日齡犢牛的糞便評分和腹瀉率。綜合前人和本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL有提高動物生長性能和降低腹瀉率的作用。在本研究中犢牛ADG和ADFI的提高可能與降低了腹瀉率有關(guān)，而腹瀉率的降低可能與PAL提高了犢牛的腸道屏障功能和抑制大腸桿菌等有害菌的生長、維持正常的腸道微生態(tài)平衡有關(guān)。

3.2 飼糧中添加PAL對犢牛血清生化指標(biāo)的影響

PAL的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用已被廣泛報道。免疫球蛋白是反映機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)，主要包括IgG、IgM、IgA，由淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞分泌產(chǎn)生，是機(jī)體抵御疾病、防范感染的重要屏障[20]。因此，血清中免疫球蛋白的濃度與犢牛的免疫力密切相關(guān)。此外，炎癥因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中也發(fā)揮重要作用，IL-6和TNF-α由單核巨噬細(xì)胞和Th1細(xì)胞分泌，主要起促發(fā)炎癥的作用，是應(yīng)激性損傷的直接介導(dǎo)物，IL-4和IL-10由Th2細(xì)胞分泌，可減輕炎癥反應(yīng)，在激活局部及全身抗體應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[21]。研究表明，飼糧中添加PAL不僅可以提高肉雞的ADG，還能夠提高肉雞血清IgA、IgG、IgM的濃度和降低肉雞血清和腸道IL-6、TNF-α、白細(xì)胞介素-8(IL-8)和干擾素-γ(IFN-γ)的濃度，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)[22]。Zhang等[6]對斷奶仔豬的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL顯著增加了21日齡犢牛血清IgA、IgM、IL-4和56日齡犢牛血清IgG的濃度，顯著降低了63日齡犢牛血清IL-6和TNF-α的濃度，與以上研究結(jié)果一致。綜上所述，飼糧中添加PAL能通過提高動物機(jī)體的免疫功能和降低炎癥反應(yīng)維持機(jī)體的健康狀態(tài)。動物機(jī)體免疫功能的提高和炎癥反應(yīng)的降低有利于抵抗應(yīng)激，這可能也是PAL組犢牛ADG增加和腹瀉率降低的原因之一。

機(jī)體細(xì)胞內(nèi)環(huán)境隨著生物代謝的進(jìn)行會產(chǎn)生超氧陰離子自由基、羥自由基和過氧化氫等活性氧簇，當(dāng)累積超過一定限度，便會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，通常情況下，自由基的產(chǎn)生、利用和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)過多的自由基無法被清除時，就會引起機(jī)體氧化損傷[23-24]。因此，抗氧化能力是維持機(jī)體健康的重要因素。血清GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC均可反映機(jī)體的抗氧化能力，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其濃度能反映體內(nèi)自由基的含量和細(xì)胞的損傷程度。本研究發(fā)現(xiàn)，63日齡犢牛血清MDA的濃度高于21和56日齡犢牛，推測這可能與斷奶對犢牛造成了應(yīng)激有關(guān)，相較于對照組，PAL組63日齡犢牛血清GSH-Px的活性和T-AOC顯著提高，而MDA的濃度則顯著降低，這表明飼糧中添加PAL可改善犢牛由于斷奶而產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Zhou等[25]的研究也發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2%的PAL能顯著提高肉雞血清和空腸T-AOC，降低MDA的濃度。此外，對斷奶仔豬的研究也表明，飼糧中添加PAL能顯著降低血清和小腸中過氧化氫、MDA和機(jī)體內(nèi)自由基等的濃度[15]。綜上可知，飼糧中添加PAL能通過提高抗氧化酶活性和降低氧化終產(chǎn)物濃度提高動物機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力。

3.3 飼糧中添加PAL對犢牛腸道菌群的影響

穩(wěn)定的腸道菌群對犢牛的生長、健康和免疫功能至關(guān)重要。犢牛由于胃腸道尚未完全發(fā)育，為病原菌在腸道內(nèi)定植提供了有利條件，導(dǎo)致腹瀉等腸道相關(guān)疾病的發(fā)生，其中大腸桿菌是誘發(fā)犢牛腹瀉的主要原因之一[26]。雙歧桿菌、芽孢桿菌、乳酸菌等腸道有益菌能通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)和位點(diǎn)，產(chǎn)生多黏菌素和短桿菌肽等生物活性物質(zhì)抑制病原菌的入侵和定植，保護(hù)腸道免受損傷[27-28]。Qiao等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加PAL可以通過增加蛋雞盲腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量有益調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)。此外，Yao等[29]的研究表明，喂服PAL能有效防治鼠沙門氏菌感染引起的小鼠腹瀉。這與本研究的結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，PAL組1～21日齡和57～63日齡犢牛的糞便評分和腹瀉率顯著降低，PAL組21和63日齡犢牛腸道大腸桿菌的數(shù)量也顯著降低，而63日齡犢牛腸道有益菌雙歧桿菌和芽孢桿菌的數(shù)量則顯著增加。因此，我們推測PAL降低犢牛腹瀉的原因可能與腸道大腸桿菌數(shù)量的減少和雙歧桿菌、芽孢桿菌數(shù)量的增加有關(guān)。以上結(jié)果表明PAL在維持腸道微生態(tài)平衡和機(jī)體健康方面具有有益的作用。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，飼糧中添加2 000 mg/kg PAL能提高荷斯坦?fàn)倥５腁DG(1～21日齡)，提高血清免疫球蛋白濃度和抗氧化應(yīng)激能力，降低炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸道有益菌和抑制大腸桿菌的生長，降低腹瀉率。