飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標(biāo)及盲腸微生物區(qū)系的影響

從光雷 肖蘊(yùn)祺 張倩雲(yún) 張 雪 張倚劍 邵 丹 張 安 施壽榮*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225125；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009)

近年來(lái)，肉雞行業(yè)快速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖水平得到提高，但現(xiàn)代養(yǎng)殖模式也有肉雞飼養(yǎng)密度過(guò)高、免疫力較弱和生長(zhǎng)性能降低等弊端，從而催生肉雞養(yǎng)殖行業(yè)大量使用抗生素，但抗生素會(huì)造成畜禽體內(nèi)殘留和蓄積毒素、細(xì)菌耐藥譜增多等問(wèn)題。同時(shí)，隨著我國(guó)抗生素禁用的政策實(shí)施，會(huì)促使家禽生產(chǎn)成本提高。因此，開(kāi)發(fā)天然、低廉、無(wú)毒副殘留的抗生素替代物已刻不容緩?；愎?PlotytaryastrohilaceaSieb. et Zuce)又稱化香樹(shù)果，是胡桃科植物化香樹(shù)的果序，在我國(guó)民間的應(yīng)用較廣且歷史悠久，分布廣泛，多以葉、果序入藥[1]?；愎蛑泻休^豐富的植物單寧，其單寧屬于鞣花單寧(水解單寧)，經(jīng)過(guò)水解可以得到鞣花酸?；愎哂刑厥獾乃幚韺W(xué)和生物學(xué)活性，是其藥用價(jià)值的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外對(duì)化香果提取的鞣花單寧的研究多集中在抑制細(xì)胞毒性、抑制腸道內(nèi)有害菌、抗氧化、預(yù)防癌癥、抗衰老[2-3]及其作為復(fù)方中藥治療急性、慢性鼻炎和鼻竇炎等方面上[4]。由此可見(jiàn)，化香果單寧具有替代抗生素的潛力，但作為家禽飼料添加劑的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在研究飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標(biāo)及盲腸微生物區(qū)系的影響，為化香果單寧在家禽生產(chǎn)應(yīng)用中提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇288羽1日齡雄性愛(ài)拔益加(AA)肉雞，隨機(jī)分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12羽。對(duì)照組(PT0組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加100(PT100組)、500(PT500組)和1 000 mg/kg(PT1 000組)化香果單寧(棕褐色，單寧含量≥65%，由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所植物單寧化學(xué)利用課題組提供)。試驗(yàn)期42 d。

1.2 基礎(chǔ)飼糧及飼養(yǎng)管理

基礎(chǔ)飼糧按照NRC(1994)肉雞營(yíng)養(yǎng)需求配制并制粒，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。試驗(yàn)采用網(wǎng)床平養(yǎng)，網(wǎng)床規(guī)格125 cm×95 cm×65 cm。在飼喂期的前3 d，溫度控制在34 ℃左右，隨后每2 d降低1 ℃，直至溫度降至23 ℃左右。所有試驗(yàn)動(dòng)物均自由采食和飲水。每天采用24 h的光照方法。通風(fēng)和免疫均按照飼養(yǎng)管理手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)執(zhí)行。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) %

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 免疫器官指數(shù)

分別在肉雞21和42日齡時(shí)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取1羽進(jìn)行屠宰，解剖取出胸腺、脾臟和法氏囊稱重，按照公式計(jì)算免疫器官指數(shù)：

免疫器官指數(shù)(%)=[免疫器官鮮重(g)/
宰前活重(g)]×100。

1.3.2 血漿抗氧化指標(biāo)

分別在肉雞21和42日齡時(shí)，從每重復(fù)隨機(jī)選取1羽，使用肝素鈉抗凝采血管，翅靜脈采血，4 000 r/min離心10 min，分離得到血漿。測(cè)定血漿中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量。以上指標(biāo)均使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定。

1.3.3 血漿生化指標(biāo)

分別在肉雞21和42日齡時(shí)，采用UniCel DxC 800 Synchron全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter，美國(guó))測(cè)定血漿中總膽固醇(T-CHO)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(CREA)、甘油三酯(TG)、尿素氮(UN)和尿酸(UA)含量，由揚(yáng)州市疾病預(yù)防控制中心測(cè)定。

1.3.4 盲腸微生物區(qū)系

無(wú)菌采集各組雞盲腸內(nèi)容物，液氮速凍后-80 ℃保存待送樣檢測(cè)。結(jié)合本試驗(yàn)肉雞的免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標(biāo)結(jié)果，決定送檢PT0和PT100組肉雞盲腸內(nèi)容物樣品。由諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序?；贗llumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)V3～V4高變區(qū)進(jìn)行雙末端測(cè)序，以分析盲腸菌群豐富度和多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)初步處理，各組之間使用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)和線性分析，組間采用Duncan氏法多重比較檢驗(yàn)。2組之間使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。結(jié)果用平均值和均值標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示顯著差異，0.05

2 結(jié) 果

2.1 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

由表2可知，PT500和PT1 000組21日齡肉雞的法氏囊指數(shù)顯著高于PT0和PT100組(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧具有提高21日齡肉雞的胸腺指數(shù)的趨勢(shì)(P=0.076)。飼糧添加化香果單寧對(duì)21和42日齡肉雞的脾臟指數(shù)無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表2 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響Table 2 Effects of dietary Plotytarya strohilacea Sieb. et Zuce tannin on immune organ indexes of broilers %

2.2 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，PT100組42日齡肉雞的血漿CAT活性顯著高于PT0、PT500和PT1 000組(P<0.05)，且血漿CAT活性與化香果單寧添加量呈顯著二次曲線相關(guān)(P<0.05)。PT0、PT100和PT500組42日齡肉雞的血漿GSH-Px活性顯著高于PT1 000組(P<0.05)，且血漿GSH-Px活性與化香果單寧添加量呈顯著二次曲線相關(guān)(P<0.05)。PT100組42日齡肉雞的血漿T-AOC顯著高于PT0組(P<0.05)，且血漿T-AOC與化香果單寧添加量呈顯著線性和二次曲線相關(guān)(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧對(duì)21和42日齡肉雞的血漿T-SOD活性和MDA含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

表3 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary Plotytarya strohilacea Sieb. et Zuce tannin on plasma antioxidant indexes of broilers

2.3 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

由表4可知，PT100、PT500和PT1 000組42日齡肉雞的血漿CREA含量顯著低于PT0組(P<0.05)，且血漿CREA含量與化香果單寧添加量呈顯著線性和二次曲線相關(guān)(P<0.05)。PT100和PT500組21日齡肉雞的血漿HDL含量顯著高于PT0組(P<0.05)。飼糧添加化香果單寧具有降低42日齡肉雞的血漿UN(P=0.096)和UA含量(P=0.070)的趨勢(shì)。飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿T-CHO、LDL和TG含量無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.4 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞響盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 盲腸微生物多樣性指數(shù)

由表5可知，PT100組和PT0組之間Chao1和Simpson指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表5 盲腸微生物多樣性指數(shù)Table 5 Cecal microbial diversity indexes

2.4.2 盲腸微生物相對(duì)豐度

由圖1和表6可知，科水平下的優(yōu)勢(shì)菌群(相對(duì)豐度>2%)包括：瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、坦納菌科(Tannerellaceae)、阿克曼菌科(Akkermansiaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、擬桿菌科(Bacteroidaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，分別占34.88%、10.86%、4.87%、12.42%、9.48%、5.63%和2.45%。PT100組的盲腸Tannerellaceae相對(duì)豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

Ruminococcaceae：瘤胃菌科；Tannerellaceae：坦納菌科；Akkermansiaceae：阿克曼菌科；Bacteroidaceae：擬桿菌科；Lachnospiraceae：毛螺旋菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Enterobacteriaceae：腸桿菌科；Marinifilaceae：海百合科；unidentified_Clostridiales：未分類(lèi)梭菌科；Others：其他。Parabacteroides：副擬桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Alistipes：另枝菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；unidentified_Enterobacteriaceae：未分類(lèi)腸桿菌科；Butyricimonas：丁酸弧菌；unidentified_Lachnospiraceae：未分類(lèi)毛螺菌科；unidentified_Ruminococcaceae：未分類(lèi)瘤胃菌科；unidentified_Clostridiales：未分類(lèi)梭菌科；Bilophila：嗜膽菌屬；Lactobacillus：乳酸桿菌屬；Bacillus：芽孢桿菌屬；Ruminiclostridium：瘤胃梭菌屬；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；unidentified_Christensenellaceae：未分類(lèi)克里斯滕森氏科；Flavonifractor：黃桿菌屬；Subdoligranulum：罕見(jiàn)小球菌屬；Oscillospira：顫螺菌；Blautia：勞特氏菌屬；Hydrogenoanaerobacterium：產(chǎn)氫厭氧桿菌屬；unidentified_Erysipelotrichaceae：未分類(lèi)韋榮球菌科；Acinetobacter：不動(dòng)桿菌屬。圖1 盲腸微生物相對(duì)豐度(A：科水平；B：屬水平)Fig.1 Relative abundance of cecal microbes (A: family level; B: genus level)

表6 科水平和屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群Table 6 Dominant flora at family level and genus level

屬水平下的優(yōu)勢(shì)菌群(相對(duì)豐度>2%)包括：副擬桿菌屬(Parabacteroides)、阿克曼菌屬(Akkermansia)、另枝菌屬(Alistipes)、擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)，分別占7.95%、4.59%、9.49%、4.37%和4.64%。PT100組的盲腸副擬桿菌屬(Parabacteroides)相對(duì)豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

2.4.3 組間差異性腸道菌群

本試驗(yàn)用線性判別分析(LDA)實(shí)現(xiàn)降維和評(píng)估差異顯著物種的影響大小，LDA閾值設(shè)定為3。由圖2可知，PT100組差異優(yōu)勢(shì)菌是副擬桿菌，其相對(duì)豐度顯著高于PT0組(P<0.05)。

Tannerellaceae：坦納菌科；Parabacteroides：副擬桿菌屬；Parabacteroides_distasonis：狄氏副擬桿菌；Subdoligranulum：罕見(jiàn)小球菌屬；Bacterium_ic1277：桿菌ic1277；Bacterium_ic1391：桿菌ic1391；Oscillibacter：顫桿菌；unidentified_Peptococcaceae：未分類(lèi)消化球菌科；Butyricicoccus：丁酸球菌屬；Anaerolinea：厭氧繩菌屬；Desulfotomaculum_ruminis：瘤胃脫硫腸狀菌；Desulfotomaculum：脫硫腸狀菌屬；Micrococcales：微球菌目；unidentified_Lachnospiraceae：未分類(lèi)毛螺菌科；Bacilli：桿菌綱；unidentified_Ruminococcaceae：未分類(lèi)瘤胃菌科。圖2 組間差異性腸道菌群Fig.2 Differential intestinal flora between groups

3 討 論

3.1 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官指數(shù)的影響

前期試驗(yàn)表明，飼糧添加化香果單寧具有提高肉雞生長(zhǎng)性能的趨勢(shì)[5]，但化香果單寧對(duì)肉雞免疫器官的影響還未見(jiàn)有報(bào)道。免疫器官指數(shù)是評(píng)價(jià)動(dòng)物機(jī)體免疫水平的指標(biāo)之一[6]。禽類(lèi)的免疫器官主要包括脾臟、胸腺和法氏囊。胸腺是細(xì)胞免疫的中樞器官，法氏囊是禽類(lèi)特有的體液免疫器官，在動(dòng)物健康狀態(tài)下胸腺和法氏囊指數(shù)增大，代表機(jī)體的免疫機(jī)能增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧添加化香果單寧能夠促進(jìn)肉雞前期胸腺和法氏囊發(fā)育，這與前人研究結(jié)果相似。Srikhun等[2]研究表明，植物單寧能夠降低肉雞的法氏囊損傷，有利于免疫器官發(fā)育。也有研究表明，飼糧添加橡椀單寧能夠提高肉雞法氏囊和脾臟指數(shù)[6]。由此可見(jiàn)，化香果單寧在肉雞免疫器官發(fā)育方面具有一定促進(jìn)作用。

3.2 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿抗氧化指標(biāo)的影響

單寧能夠有效清除動(dòng)物體的氧自由基(ROS)，且能夠提高動(dòng)物機(jī)體的抗氧化酶活性，從而降低機(jī)體的氧化應(yīng)激[7]。CAT是動(dòng)物機(jī)體主要抗氧化酶之一，其具有清除機(jī)體的ROS和一氧化氮(NO)，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激損傷[8]。GSH-Px在體內(nèi)能夠催化分解過(guò)氧化氫，也是機(jī)體主要抗氧化酶之一，其有利于保持細(xì)胞膜的功能和結(jié)構(gòu)完整性。T-AOC則是反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加化香果單寧能夠顯著提高肉雞的血漿CAT活性和T-AOC，且血漿CAT活性和T-AOC與化香果單寧添加量呈劑量依賴關(guān)系。另外，化香果單寧添加量還與血漿GSH-Px活性呈二次曲線相關(guān)，飼糧添加100 mg/kg化香果單寧時(shí)血漿GSH-Px活性最高。這與前人研究結(jié)果相似，如有研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加植物單寧有利于肉雞抗氧化功能的增強(qiáng)，從而保護(hù)脂質(zhì)的過(guò)度氧化[9]。López-Andrés等[10]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加單寧能夠提高機(jī)體的抗氧化功能。Liu等[11]研究表明，在熱應(yīng)激條件下添加單寧能夠顯著提高肉兔的血漿T-AOC，降低熱應(yīng)激對(duì)機(jī)體的影響。Farahat等[12]在肉雞飼糧中添加植物單寧能夠降低其肌肉中MDA含量。Ye等[13]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加單寧具有提高田鼠肝臟中CAT活性的趨勢(shì)。綜上所述，化香果單寧具備較強(qiáng)抗氧化能力，且飼糧添加100 mg/kg化香果單寧時(shí)抗氧化效果最佳。

3.3 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞血漿生化指標(biāo)的影響

血漿生化指標(biāo)可用于評(píng)價(jià)動(dòng)物體的生理和病理狀態(tài)。T-CHO、HDL、TG和LDL含量均與動(dòng)物的脂代謝相關(guān)[6]，TG、HDL和T-CHO均在肝臟內(nèi)合成。TG是體內(nèi)廣泛存在的脂類(lèi)，其在肝臟中異常沉積會(huì)誘導(dǎo)肝臟巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，導(dǎo)致脂肪肝及肝硬化的發(fā)生，若血液中TG含量增多則表明機(jī)體發(fā)生了代謝性疾病[14]。T-CHO是所有含膽固醇的脂蛋白總和，其與動(dòng)脈粥樣硬化疾病具有相關(guān)性[15]。HDL能夠抑制LDL的作用，從而減輕心血管疾病的發(fā)生[16]。LDL與患心血管疾病率呈正相關(guān)[17]。梁萌[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加藤茶提取物(富含多酚)能夠降低肉雞血液LDL和TC含量，能夠調(diào)節(jié)肉雞脂質(zhì)代謝，利于肉雞機(jī)體健康。Li等[19]研究表明，飼糧添加多酚能夠降低肉雞血液T-CHO和LDL含量。Zeng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，單寧能夠與血脂水平相關(guān)的生物分子結(jié)合，從而降低血脂水平。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在21日齡時(shí)，飼糧添加100和500 mg/kg化香果單寧能夠顯著提高肉雞血漿HDL含量，表明化香果單寧能夠改善肉雞前期血漿生化指標(biāo)，但對(duì)肉雞后期血漿T-CHO、TG和LDL含量均無(wú)顯著影響。這與前人研究結(jié)果[6,19,21]并不完全一致，可能是因?yàn)樵囼?yàn)動(dòng)物和單寧提取來(lái)源等不同所導(dǎo)致的差異，具體原因還需進(jìn)一步研究。

CREA、UN和UA是動(dòng)物機(jī)體代謝的產(chǎn)物[22]。CREA和UN含量變化與腎小球?yàn)V過(guò)率相關(guān)[23]。腎功能不全時(shí)，CREA和UN在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致血液中兩者含量升高，會(huì)對(duì)組織器官造成毒害[24]。UA是衡量氨基酸利用率和蛋白質(zhì)分解程度的指標(biāo)，其含量升高提示機(jī)體患有相關(guān)疾病(原發(fā)性和繼發(fā)性)[25]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧添加化香果單寧能夠降低肉雞血漿CREA含量，其中以PT100組血漿CREA含量最低，且血漿CREA含量與化香果單寧添加量存在劑量依賴關(guān)系。另外，飼糧添加化香果單寧還具有降低血漿UN和UA含量的趨勢(shì)，提示飼糧條件化香果單寧可能能夠提高肉雞的蛋白質(zhì)合成和沉積效率，從而有利于動(dòng)物生產(chǎn)[26]。在結(jié)合本試驗(yàn)血漿抗氧化指標(biāo)結(jié)果，推測(cè)化香果單寧能夠清除機(jī)體自由基，維持細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)完整性，降低組織器官內(nèi)氧化脂質(zhì)含量，降低自由基對(duì)腎臟和肝臟的損傷，從而降低血漿CREA和UN含量。

3.4 飼糧添加化香果單寧對(duì)肉雞響盲腸微生物區(qū)系的影響

本試驗(yàn)采用第3代高通量測(cè)序技術(shù)，3代全長(zhǎng)擴(kuò)增子測(cè)序主要通過(guò)對(duì)16S RNA全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，構(gòu)建SMRT Bell文庫(kù)，通過(guò)分析得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異，在通過(guò)主坐標(biāo)分析(PCoA)、非加權(quán)組平均法(UPGMA)和LefSe等降維圖和樣品聚類(lèi)樹(shù)進(jìn)行展示。根據(jù)本試驗(yàn)免疫器官指數(shù)以及血漿抗氧化和生化指標(biāo)結(jié)果，進(jìn)一步研究了PT0組和PT100組肉雞盲腸微生物區(qū)系的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧添加100 mg/kg化香果單寧能夠顯著增加盲腸Parabacteroides相對(duì)豐度，其還是肉雞的優(yōu)勢(shì)菌屬。目前研究表明，Parabacteroides具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫和代謝功能，有利于機(jī)體的健康[27]。Kverka等[28]研究表明，Parabacteroides能夠顯著降低急性和慢性結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥的嚴(yán)重程度。Koh等[29]研究發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides能夠增加腸道緊密連接蛋白表達(dá)，保持腸道屏障的完整性，有利于腸道健康。根據(jù)本試驗(yàn)免疫器官指數(shù)、血漿抗氧化和生化指標(biāo)以及前期生長(zhǎng)性能[5]的結(jié)果，推測(cè)化香果單寧是通過(guò)增加腸道Parabacteroides相對(duì)豐度保持腸道屏障完整性，改善血漿生化指標(biāo)，從而提高抗氧化功能，促進(jìn)肉雞的生長(zhǎng)性能。

4 結(jié) 論

飼糧添加化香果單寧能夠增加肉雞盲腸差異優(yōu)勢(shì)菌屬Parabacteroides相對(duì)豐度，提高抗氧化功能，改善血漿生化指標(biāo)，并且有利于肉雞免疫器官發(fā)育。