靈芝多糖對(duì)大腸桿菌感染IPEC-1細(xì)胞免疫功能的影響

翟俊磊 林 穎 王美艷 高玉云 王長康* 金 靈

(1.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州 350002)

新生仔豬因免疫力低下、腸道微生物系統(tǒng)發(fā)育不完善[1]、易受大腸桿菌感染，導(dǎo)致腹瀉，引起腸道炎癥，腸道屏障功能遭到破壞[2]。其中腸出血性大腸桿菌(enterohemorrhagicEscherichiacoli，EHEC)可提高促炎因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)基因表達(dá)量，造成腸道損傷，細(xì)胞膜通透性升高，水鹽代謝失衡[3-4]，造成仔豬腹瀉。另外，腸道疾病的發(fā)生與緊密連接蛋白磷酸化[5]及相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。研究表明，當(dāng)細(xì)菌感染腸道上皮細(xì)胞時(shí)，Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別細(xì)胞外的致病菌，促進(jìn)下游炎癥因子轉(zhuǎn)錄，激活腸道炎癥信號(hào)通路，引起炎癥反應(yīng)[6]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysaccharides)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低丙二醛含量、提高血清抗氧化酶活力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和降低促炎因子表達(dá)[7-9]，具有提高免疫、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等功能[10-12]，在畜牧業(yè)中應(yīng)用前景可觀。本試驗(yàn)選用的靈芝多糖來自于福建農(nóng)林大學(xué)菌草所研發(fā)的“混合菌草培養(yǎng)基”栽培的靈芝，其多糖含量遠(yuǎn)高于(2.5倍以上)傳統(tǒng)的棉籽殼和木屑培養(yǎng)基所栽培的靈芝，該方法降低了靈芝生產(chǎn)成本[13]。研究報(bào)道，在豬飼糧中添加靈芝多糖可提高血清白細(xì)胞介素-10(IL-10)含量，降低IL-1β含量，提高仔豬抗病力，緩解免疫應(yīng)激[14-15]。在雞飼糧中添加靈芝多糖可促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的增殖，顯著提高新城疫(ND)和傳染性法氏囊(IBD)抗體陽性水平[16-17]。此外，植物類多糖能改善腸道菌群、脂肪酸組成、腸道免疫功能和修復(fù)腸道損傷。趙玉蓉等[18]報(bào)道，牛膝多糖(ABPS)可顯著抑制沙門氏菌侵染IPEC-1細(xì)胞，提高緊密連接蛋白轉(zhuǎn)錄水平。靈芝多糖可通過影響機(jī)體細(xì)胞活力、細(xì)胞因子含量調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，但靈芝多糖如何調(diào)節(jié)豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1免疫功能的研究甚少。本試驗(yàn)旨在通過建議體外IPEC-1細(xì)胞炎癥模型，探討靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞增殖、周期、抑菌作用以及免疫功能的影響，為靈芝多糖改善動(dòng)物腸道健康提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

靈芝多糖：由福建農(nóng)林大學(xué)菌草研究所提供，從菌草栽培靈芝中提取、純化所得，深褐色粉末，易溶于水，平均相對(duì)分子質(zhì)量為5.1×105，多糖含量為94.84%。

豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-1：購自福州澤葉生物公司。

EHEC O157∶H7：購自BNCC公司。

試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和EDTA-胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素混合液購自美國Hyclone公司；CCK-8試劑盒和LDH釋放率檢測(cè)試劑盒購自日本dojindo公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；慶大霉素購自Hyclone公司；IL-6、IL-1β、TNF-α、干擾素-γ(IFN-γ)和IL-10酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物公司；Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒購自日本TaKaRa公司；SYBR qPCR試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司；LB培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇購自廣州鼎國生物有限公司。

主要儀器：MCO-170AICUVL-PC CO2培養(yǎng)箱購自日本PHCbi公司；恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；恒溫?fù)u床、低速離心機(jī)購自上海安亭科學(xué)儀器廠；Ts2倒置生物顯微鏡購自日本Nikon公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺(tái)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)購自德國Effedorf公司；酶標(biāo)儀、T100TM Thermal Cycler、熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；NovoCyte 1030型流式細(xì)胞儀購自美國ACEA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞活力的影響

待細(xì)胞融合生長至70%～80%，消化離心后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜；加入100 μL含有不同濃度(5、10、20、50、100、200、400和800 μg/mL)靈芝多糖的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置空白孔(不含細(xì)胞和靈芝多糖的培養(yǎng)基、加CCK-8)和對(duì)照孔(含細(xì)胞無靈芝多糖的培養(yǎng)基，加CCK-8)，每種處理設(shè)置6個(gè)重復(fù)，在37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 h后，加入10 μL CCK-8，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，于450 nm處測(cè)定吸光度(OD450 nm)。

細(xì)胞活力(%)=[(樣品孔吸光度-空白孔吸
光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100。

1.2.2 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞周期的影響

待細(xì)胞融合生長至70%～80%，消化離心后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；由靈芝多糖對(duì)細(xì)胞活力的試驗(yàn)結(jié)果，選用終濃度分別0(空白組)、5、10、20、50和100 μg/mL靈芝多糖處理24 h，收集細(xì)胞；用PBS清洗后，2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；70%乙醇固定過夜后，用PBS洗去固定液；細(xì)胞懸液用200目篩網(wǎng)過濾1次；加入提前配制好的500 μL PI/RNase A染色工作液，室溫避光30～60 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光。G0期為暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，去執(zhí)行一定生物學(xué)功能的細(xì)胞所處的時(shí)期(細(xì)胞靜止期)；G1期為合成前期；G2期為合成后期；S期為DNA合成時(shí)期；M期為細(xì)胞分裂期。增殖指數(shù)(PI)的計(jì)算公式為：

PI(%)=[(S期+G2/M期)/(G0/G1期+
S期+G2/M期)]×100。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

將EHEC菌液接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，連續(xù)接種活化3代。取10 μL菌懸液接種于10 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm=0.5，濃度約為2.5×109CFU/mL，細(xì)菌計(jì)數(shù)。菌液4 ℃、4 000 r/min離心10 min，棄掉上清，PBS重懸，用不含抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋至合適濃度(2×108CFU/mL)，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 EHEC增殖的測(cè)定

向96孔培養(yǎng)板中加入180 μL含1 mmol/L的NaH2PO4和25 mmol/L的NaHCO3的LB培養(yǎng)基；向96孔培養(yǎng)板中加入靈芝多糖，靈芝多糖的終濃度分別為0、5、10、20、50和100 μg/mL，接種EHEC至96孔板，每孔接種數(shù)量為2×104CFU；將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h；取出96孔培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測(cè)定590 nm處吸光度(OD590 nm)，OD590 nm可反映EHEC的增殖情況。

1.2.5 靈芝多糖預(yù)處理對(duì)IPEC-1細(xì)胞抵抗EHEC侵染能力的測(cè)定

細(xì)胞貼壁生長至70%～80%，消化離心后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后添加靈芝多糖，使其終濃度分別為0、5、10、20、50和100 μg/mL，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2遍，每孔加入200 μL濃度為l%的Triton X-100裂解液裂解細(xì)胞；收集細(xì)胞裂解液，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。取160 μL裂解液上清加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；每孔中加入提前配制好的EHEC菌懸液[感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=40]40 μL，將96孔培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，取出96孔培養(yǎng)板，酶標(biāo)儀測(cè)定OD590 nm，OD590 nm可反映細(xì)菌的增殖情況。

1.2.6 細(xì)胞因子分泌量的檢測(cè)

待細(xì)胞融合生長至70%～80%，按1×105個(gè)細(xì)胞/孔加入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入靈芝多糖(使其終濃度分別為0、5、10、20、50和100 μg/mL)培養(yǎng)24 h，然后用大腸桿菌(MOI=40)感染2 h，并設(shè)空白組，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，取培養(yǎng)上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD450 nm，計(jì)算INF-γ、IL-6、IL-10、TNF-α和IL-1β的分泌量。

1.2.7IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10基因表達(dá)量的檢測(cè)

待細(xì)胞融合生長至70%～80%，按2×105個(gè)細(xì)胞/孔加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入靈芝多糖(使其終濃度分別為0、50和100 μg/mL)培養(yǎng)24 h，大腸桿菌(MOI=40)感染2 h，并設(shè)空白組，每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。根據(jù)TaKaRa公司Trizol裂解法說明書提取總RNA，測(cè)定RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說明，利用熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10基因的表達(dá)情況。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線收集：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參基因，在NCBI上搜索豬IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10基因的全序列，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理和統(tǒng)計(jì)，用GraphPad Prism 8軟件中one-way ANOVA進(jìn)行方差分析并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，靈芝多糖作用IPEC-1細(xì)胞48 h后細(xì)胞活力明顯下降，且作用4 h時(shí)細(xì)胞活力優(yōu)于作用12 h時(shí)，故選擇24 h作為最佳作用時(shí)間。靈芝多糖作用24 h，濃度為5～100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力優(yōu)于濃度為200～800 μg/mL。

圖1 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on cell viability of IPEC-1 cells

2.2 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞周期的影響

由表2可知，相比空白組相比，不同濃度靈芝多糖對(duì)G0/G1、S期、G2/M細(xì)胞分布和PI未產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同濃度(5～100 μg/mL)靈芝多糖之間上述指標(biāo)的差異亦不顯著(P<0.05)。

表2 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞周期的影響Table 2 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on cell cycle of IPEC-1 cells %

2.3 靈芝多糖對(duì)EHEC增殖的影響

由圖2可知，濃度為5、10、20、50和100 μg/mL的靈芝多糖可顯著抑制EHEC的增殖(P<0.05)，且濃度為20、50和100 μg/mL的靈芝多糖之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 靈芝多糖預(yù)處理對(duì)IPEC-1細(xì)胞抵抗EHEC侵染能力的影響

由圖3可知，濃度為50和100 μg/mL的靈芝多糖處理IPEC-1細(xì)胞24 h可顯著抑制EHEC增殖(P<0.05)，而濃度為5、10和20 μg/mL的靈芝多糖處理IPEC-1細(xì)胞24 h可顯著促進(jìn)EHEC增殖(P<0.05)。

2.5 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α、INF-γ和IL-10分泌量的影響

由圖4可知，通過對(duì)IPEC-1炎性因子分泌量進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白組相比，EHEC組的IL-6、IL-1β和IFN-γ分泌量顯著上升(P<0.05)，IL-10分泌量顯著下降(P<0.05)；與EHEC組相比，5、10、20、50和100 μg/mL靈芝多糖+EHEC組的IL-6、TNF-α和IFN-γ分泌量顯著降低(P<0.05)，20、50和100 μg/mL靈芝多糖+EHEC組的IL-1β分泌量顯著下降，5和50 μg/mL靈芝多糖+EHEC組的IL-10分泌量顯著上升(P<0.05)。

2.6 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10基因表達(dá)的影響

由圖5可知，與空白組相比，EHEC組的TNF-α和IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量升高(P>0.05)，IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量下降(P>0.05)；50和100 μg/mL靈芝多糖組的IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量與空白組差異不顯著(P>0.05)。與EHEC組相比，50和100 μg/mL靈芝多糖+EHEC組的IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，IL-6和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量下降(P>0.05)，IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量上升(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注相同小寫字母表示差異顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Value columns with the small letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as below.圖2 靈芝多糖對(duì)EHEC增殖的影響Fig.2 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on EHEC proliferation

EHEC:腸出血性大腸桿菌enterohemorrhagic Escherichia coli。下圖同 the same as below。圖3 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞抗EHEC活性的影響Fig.3 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on anti-EHEC activity of IPEC-1 cells

圖4 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞炎性因子分泌量的影響Fig.4 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on inflammatory factor secretion amounts of IPEC-1 cells

圖5 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-10基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Ganoderma lucidum polysaccharides on gene expression of IL-6, TNF-α, IL-1β and IL-10 of IPEC-1 cells

3 討 論

3.1 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞活力的影響

國家菌草工程技術(shù)研究中心在人、小鼠和奶牛等動(dòng)物上的研究證實(shí)靈芝多糖具有促進(jìn)免疫細(xì)胞增殖、清除氧化自由基、免疫增強(qiáng)等功能[19-20]，Huang等[21]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖200、100 mg/(kg·d)劑量組可提升小鼠自然殺傷細(xì)胞活性。王斌等[22]研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖可明顯刺激小鼠脾臟樹突狀細(xì)胞增殖，且與細(xì)胞因子有顯著的協(xié)同作用，具有類生長因子和協(xié)同生長因子的作用。腸道上皮細(xì)胞的增殖與腸道健康密切相關(guān)，小腸上皮細(xì)胞的增殖可提高絨毛高度，促進(jìn)消化吸收[23]和免疫應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答。CCK-8是一種綜合指標(biāo)比較好的檢測(cè)細(xì)胞活力的試劑，是通過檢測(cè)活細(xì)胞中脫氫酶活性來確定活細(xì)胞數(shù)，操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高[24-26]。本試驗(yàn)通過細(xì)胞活力驗(yàn)證靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞的存活率影響的結(jié)果表明，靈芝多糖作用24 h優(yōu)于作用12、48 h，且靈芝多糖濃度為5～100 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力優(yōu)于其他濃度，可能是因?yàn)槠涠嗵浅煞植荒芡耆到?，糖酵解途徑未完全發(fā)揮作用，且呈藥劑依賴效應(yīng)。而靈芝多糖作用48 h時(shí)細(xì)胞活力下降，則說明靈芝多糖作用時(shí)間過久會(huì)產(chǎn)生毒副作用，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

3.2 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是反映細(xì)胞增殖與凋亡的重要指標(biāo)，細(xì)胞凋亡是清除異常細(xì)胞或損傷細(xì)胞，維持腸上皮細(xì)胞更新與正常存活的生理過程。其中G2/M期+S期反映細(xì)胞增殖能力。研究表明，G0/G1期停滯和S期降低，凋亡率增加[27-28]，是對(duì)細(xì)胞抑制的表現(xiàn)，G2/M期下降可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Jun氨基末端激酶(JNK)磷脂酸化水平增加。本研究結(jié)果表明，5～100 μg/mL靈芝多糖對(duì)細(xì)胞增殖無顯著作用，細(xì)胞周期結(jié)果表明，G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞分布各濃度靈芝多糖之間差異不顯著，細(xì)胞周期試驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞增殖結(jié)果相一致。Bai等[29]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖(150和300μg/mL)給藥24h顯著抑制人類結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HCT-116的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Jin等[30]研究發(fā)現(xiàn)，200 g/mL的靈芝多糖作用宮頸癌細(xì)胞48 h能減弱宮頸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡，限制宮頸癌細(xì)胞周期。因此，我們推測(cè)機(jī)體處于發(fā)病狀態(tài)時(shí)靈芝多糖可發(fā)揮其藥理作用。本研究在正常細(xì)胞狀態(tài)下給藥，對(duì)細(xì)胞無顯著作用，說明5～100 μg/mL靈芝多糖對(duì)細(xì)胞毒副作用小。

3.3 靈芝多糖對(duì)EHEC增殖的影響

腸道微生物的組成變化會(huì)影響宿主代謝網(wǎng)絡(luò)，影響腸道內(nèi)微生物的代謝水平。一定水平的短鏈脂肪酸能夠維持腸道屏障功能，抑制全身炎癥。大量研究證明，多糖和植物提取物可以改善腸道微生物的組成，促進(jìn)有益菌的生長[31-32]，抑制有害菌(如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌)的生長[33-36]。Tong等[37]和Guo等[38]研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可促進(jìn)瘤胃球菌、雙歧桿菌和短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌等良性細(xì)菌的生長，從而改善機(jī)體代謝。本研究通過體外抑菌試驗(yàn)驗(yàn)證靈芝多糖是否有一定程度抑菌作用，結(jié)果表明，靈芝多糖對(duì)EHEC在體外有一定抑制作用，原因可能是，靈芝多糖參與破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，從而起到抑菌作用。但靈芝多糖抑制大腸桿菌的具體作用機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

3.4 靈芝多糖預(yù)處理對(duì)IPEC-1細(xì)胞抵抗EHEC侵染能力的影響

小腸上皮細(xì)胞由腸上皮細(xì)胞膜和腸上皮細(xì)胞緊密連接組成[39]，因而小腸上皮細(xì)胞是抵御病原菌的第1道防線[40]。本研究就靈芝多糖能否加強(qiáng)IPEC-1細(xì)胞抵抗EHEC侵染能力以及細(xì)胞自身免疫功能進(jìn)行了探究。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁比較薄且化學(xué)組成較單一，只含有90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。有研究發(fā)現(xiàn)，中草藥對(duì)細(xì)菌的抑菌作用機(jī)制和靶位點(diǎn)有可能不同于抗生素或疫苗，其在一定程度上對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁的完整性有破壞作用，增強(qiáng)抑菌物質(zhì)的親和度，起到抑菌殺菌效果[41]。綜上所述，靈芝多糖可通過提高細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的分泌，從而達(dá)到抑菌殺菌效果。謝紅兵[42]研究表明多糖對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有顯著抑制作用。陳洪亮[43]在體外抑菌試驗(yàn)中也得到相同結(jié)果。毛曉峰[44]和趙露露等[45]報(bào)道黃芪多糖有一定程度抑菌效果，可緩解斷奶仔豬腹瀉。上述研究結(jié)果與本研究結(jié)果相符，濃度為50和100 μg/mL的靈芝多糖處理IPEC-1細(xì)胞24 h，可顯著抑制EHEC增殖。靈芝多糖可能通過影響核因子-κB(NF-κB)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)控機(jī)體炎性因子分泌量或基因表達(dá)量，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，提高抗菌能力。

3.5 靈芝多糖對(duì)IPEC-1細(xì)胞免疫功能的影響

小腸上皮細(xì)胞主要利用谷氨酰胺和葡萄糖提供能量，而IPEC-1細(xì)胞具有典型小腸上皮細(xì)胞的特征，并且小腸是動(dòng)物機(jī)體消化、吸收的主要場(chǎng)所，因此小腸上皮細(xì)胞的免疫健康極其重要[46]。炎性因子TNF-α和IL-6在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)后迅速產(chǎn)生[47]，在細(xì)菌感染性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[48]，引起腸道上皮損傷和屏障障礙[49]。本試驗(yàn)通過應(yīng)用EHEC，可致IPEC-1細(xì)胞發(fā)生損傷、免疫功能減弱，為后續(xù)體內(nèi)研究提供依據(jù)。本試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)建立的驗(yàn)證模型(EHEC-IPEC-1細(xì)胞體外炎癥模型)EHEC(MOI=40)侵染2 h，可使細(xì)胞存活率下降至60%左右，炎性因子分泌量上升。另已有文獻(xiàn)證明， EHEC(MOI=10)浸染1 h，可使仔豬腸道形態(tài)發(fā)生變化，破壞仔豬屏障功能，造成炎癥反應(yīng)[50]。研究發(fā)現(xiàn)，黑靈芝多糖可明顯抑制小鼠體內(nèi)TNF-α分泌量[51-52]。在體外細(xì)胞試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖(5、10、20、50和100 μg/mL)處理RAW264.7細(xì)胞后，呈劑量依賴效應(yīng)，降低促炎因子誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和TNF-α的表達(dá)量，而抗炎因子IL-10的表達(dá)量明顯增加[53-54]。在脂多糖(LPS)刺激的人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，靈芝多糖(10 μg/mL)明顯降低IL-1β的表達(dá)。上述研究表明，靈芝多糖可抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫能力。

機(jī)體相關(guān)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子是細(xì)胞免疫系統(tǒng)關(guān)鍵的信號(hào)因子，細(xì)胞炎性因子分泌量與轉(zhuǎn)錄水平的高低是免疫功能正常與否的重要標(biāo)志，炎性因子IL-6、IL-1β、IL-10和IFN-γ等的改變與人和動(dòng)物腸道的感染有關(guān)。崔小珍等[55]研究表明松針多糖顯著抑制LPS應(yīng)激下雞巨噬細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和TNF-α分泌。本試驗(yàn)中，在炎癥狀態(tài)下，靈芝多糖提高IL-10和降低IFN-γ、IL-6、IL-1β和TNF-α分泌量，證明靈芝多糖是通過調(diào)控炎性因子分泌量，來緩解由細(xì)菌感染引起的炎癥疾病。Walsh等[56]報(bào)道，褐藻多糖顯著抑制促炎因子IL-6和IL-1β基因表達(dá)量，緩解仔豬腸道炎癥。Khan等[57]用蘑菇多糖治療小鼠，發(fā)現(xiàn)與M1表型相關(guān)的細(xì)胞因子(IFN-γ、IL-1β和TNF-α)基因表達(dá)下調(diào)，與M2表型相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IL-12和IL-13)基因表達(dá)上調(diào)。研究報(bào)道，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)，細(xì)胞因子分泌量和基因表達(dá)會(huì)激活免疫應(yīng)答系統(tǒng)，促進(jìn)藥物作用于機(jī)體[51,58-59]，通過免疫信號(hào)通路介導(dǎo)下游基因變化，從而發(fā)揮免疫作用，但調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的免疫機(jī)制還需探究。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在EHEC侵染IPEC-1細(xì)胞后，20、50和100 μg/mL靈芝多糖+EHEC組IL-6、IL-1β、IFN-γ和TNF-α的分泌量顯著降低，5和10 μg/mL靈芝多糖+ EHEC組IL-1β的分泌量減少，5和50 μg/mL靈芝多糖+EHEC組IL-10的分泌量顯著升高。通過轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定，50和100 μg/mL 靈芝多糖+EHEC組IL-1βmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低，IL-6和TNF-αmRNA相對(duì)表達(dá)量下降，IL-10 mRNA相對(duì)表達(dá)量上升。綜上表明，濃度為50和100 μg/mL的靈芝多糖可緩解EHEC誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

5～100 μg/mL靈芝多糖作用IPEC-1細(xì)胞24 h細(xì)胞活力均在100%左右，且對(duì)細(xì)胞毒副作用小，有抑菌作用，可增強(qiáng)IPEC-1細(xì)胞抗EHEC感染的能力。大腸桿菌感染IPEC-1細(xì)胞可使其發(fā)生炎癥反應(yīng)，靈芝多糖預(yù)處理能夠緩解大腸桿菌誘導(dǎo)的促炎性因子表達(dá)的上調(diào)及抑炎性因子表達(dá)的下調(diào)。