HPLC同時(shí)測(cè)定七清敗毒顆粒中黃芩苷和虎杖苷的含量

林萬(wàn)華，劉 翠，張 文，林 昊，王珍珍

（1.廣東容大生物股份有限公司 511517；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 510640；3.清遠(yuǎn)一生自然生物研究院有限公司 511517）

七清敗毒顆粒是中獸藥經(jīng)典處方，由黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍(lán)根、綿馬貫眾、大青葉七味中藥材組成，具有清熱解毒，燥濕止瀉的功效[1-2]，對(duì)畜禽多種細(xì)菌、病毒性疾病具有較好的防治效果，如白痢、感冒、傳染性支氣管炎等。本中藥配伍中黃芩和虎杖的象征成分為黃芩苷和虎杖苷；因此，鑒定黃芩苷和虎杖苷成分作為七清敗毒顆粒顆粒質(zhì)量判定依據(jù)?！吨袊?guó)獸藥典》2015版二部對(duì)七清敗毒顆粒質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)是采用薄層色譜法，分別檢測(cè)其中是否含有黃芩苷、虎杖苷等成分[1][3]，此鑒別方法較繁瑣，并未對(duì)黃芩苷和虎杖苷做含量測(cè)定。為科學(xué)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)七清敗毒顆粒質(zhì)量，本試驗(yàn)采用HPLC法對(duì)七清敗毒顆粒中黃芩苷和虎杖苷含量同時(shí)測(cè)定的方法進(jìn)行了研究。

1 儀器與材料

日本島津LC-20A高效液相色譜儀；超純水儀UPK-5T；超聲波儀；梅特勒—托利多天平MS105DU；黃芩苷對(duì)照品：Z0271109，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；虎杖苷對(duì)照品：111575-201603，中國(guó)食品藥品檢定研究院；樣品：七清敗毒顆粒2012003，廣東容大生物股份有限公司；試劑：甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為分析用純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

流動(dòng)相：乙腈-水-磷酸（25∶75∶0.1），色譜柱：島津C18 5u 4.6×250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：315nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 稀釋液：甲醇

2.2.2 黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取黃芩苷對(duì)照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液：精密稱取虎杖苷對(duì)照品10.0mg，置25mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并定容至刻度，搖勻，作為虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.4 混合對(duì)照品溶液：取上述1.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液5.0mL及1.3.3項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0mL到50mL容量瓶中，加稀釋液定容，搖勻，制成含黃芩苷40μg/mL、虎杖苷8μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 樣品溶液的配制

取七清敗毒顆粒適量，研細(xì)，置100mL棕色量瓶中，加甲醇40mL，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

2.4.1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性

取上述1.3.4項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液20μL按1. 2色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子（具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1）。

表1 黃芩苷、虎杖苷系統(tǒng)適用性試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.5 線性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 黃芩苷、虎杖苷線性實(shí)驗(yàn)

取上述1.3.2項(xiàng)黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液及1.3.3虎杖苷對(duì)照品儲(chǔ)備液分別稀釋成含黃芩苷5.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、40.00μg/mL、100.00μg/mL，虎 杖 苷1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL、20.00μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液，按1.2色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線性比較，黃芩苷峰面積的回歸方程為：Y＝54836X-115539（R2＝0.9997），說(shuō)明黃芩苷在5～100μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（具體見(jiàn)圖1），虎杖苷峰面積的回歸方程為：Y＝109836X-11176（R2＝0.9999），說(shuō)明虎杖苷在1～20μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（具體見(jiàn)圖2）。

圖1 黃芩苷線性范圍數(shù)據(jù)圖

圖2 虎杖苷線性范圍數(shù)據(jù)圖

2.5.2 黃芩苷、虎杖苷測(cè)定線性色譜圖

圖3 黃芩苷、虎杖苷測(cè)定線性液相色譜圖

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

2.6.1 黃芩苷、虎杖苷重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取1.3.4混合對(duì)照品溶液適量，按1. 2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣5次，獲得黃芩苷峰面積的RSD為0.1%，虎杖苷峰面積的RSD為0.09%，表明該色譜條件對(duì)黃芩苷和虎杖苷檢測(cè)的重復(fù)性良好。具體見(jiàn)表2。

表2 黃芩苷進(jìn)樣重復(fù)性數(shù)據(jù)

2.7 回收率試驗(yàn)

2.7.1 黃芩苷、虎杖苷回收率試驗(yàn)

精密取已知黃芩苷含量（6.5mg/mL）、虎杖苷含量（0.78mg/mL）的同一批樣品約0.50g（共9份）置于100mL容量瓶中，分別加入上述1.3.2項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0mL、5.0mL、6.0mL及1.3.3項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.8mL、1.0mL、1.2mL，按上述1.4項(xiàng)要求處理，進(jìn)樣測(cè)定。測(cè)定并計(jì)算黃芩苷的平均回收率為99.9% ，虎杖苷的平均回收率為100.06%。具體見(jiàn)表3、表4。

表3 黃芩苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

表4 虎杖苷回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2.8 混合對(duì)照品溶液的測(cè)定

取上述1.3.4項(xiàng)下的黃芩苷、虎杖苷混合對(duì)照品溶液，按1.2色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得黃芩苷、虎杖苷混合對(duì)照品色譜圖譜如下（圖4）。

圖4 黃芩苷、虎杖苷液相色譜圖

2.9 供試品的測(cè)定

取3批七清敗毒顆粒樣品及對(duì)照品溶液，按外標(biāo)法測(cè)定，每批樣品進(jìn)樣2次，計(jì)算樣品中黃芩苷、虎杖苷含量（圖譜見(jiàn)圖5）。3批七清敗毒顆粒樣品的含量測(cè)定結(jié)果分別為黃芩苷6.51mg/g、6.50mg/g、6.51mg/g，虎杖苷0.78 mg/g、0.78mg/g、0.79mg/g。

圖5 七清敗毒顆粒樣品的液相色譜圖

3 討論

3.1黃芩藥材中的黃芩苷含量測(cè)定液相條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（C18色譜柱），以甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm；虎杖藥材中虎杖苷含量測(cè)定液相條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（23∶77）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為306nm[1]。黃芩苷在波長(zhǎng)為280nm、316nm處有最大吸收，虎杖苷在217nm、306nm、314nm處有最大吸收。從藥典中可以明確，黃芩苷的含量測(cè)定采用280nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，而虎杖苷則選擇了306nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本方法參考了藥典檢測(cè)條件，選擇了315nm波長(zhǎng)兼顧兩個(gè)被測(cè)成分在314nm～316nm中有最大吸收，以保證檢測(cè)的最大靈敏度。

3.2 在流動(dòng)相確立方面，參考了中國(guó)獸藥典黃芩苷、虎杖苷檢測(cè)的色譜條件，結(jié)合侯麗麗[2]、黃良永[5]等方法研究結(jié)果，確立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定七清敗毒顆粒中黃芩苷、虎杖苷含量的方法：乙腈—水—磷酸（25∶75∶0.1），色譜柱：島津C18 5u 4.6×250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：315nm，流速：1.0mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL；其中在流動(dòng)相中增加0.1%的磷酸，起到適當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH改變色譜峰型作用。

3.3為避免黃芩苷與虎杖苷兩個(gè)物質(zhì)的檢測(cè)響應(yīng)值相互影響，特做了兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度檢測(cè)嘗試，最終確立黃芩苷在濃度為 5～100μg/mL，虎杖苷在濃度為 1～20μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢測(cè)峰相應(yīng)值大小相當(dāng)，積分條件統(tǒng)一。該方法具有線性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為其質(zhì)量判定提供了更科學(xué)的依據(jù)。