鹽酸小檗堿改善高脂誘導的小鼠非酒精性脂肪肝機制

張秀茹，李婷婷，劉淑文，吳啟賜，林志超，潘裕添，古麗米然·阿里同別克

(閩南師范大學菌物產(chǎn)業(yè)工程技術中心，福建漳州363000)

非酒精脂肪肝(NAFLD)是一種慢性疾病，被認為是長期高脂肪飲食的結果，其特征是肝臟脂肪堆積，出現(xiàn)炎癥和肝組織損傷[1]。NAFLD的臨床范圍從單純性脂肪變性到不可逆轉的非酒精性脂肪肝炎(NASH)，表現(xiàn)為較強的炎癥和組織損傷。

鹽酸小檗堿(BBR)，又名黃連素，是中藥黃連的主要成分，基本結構為苯基四羥基喹啉，主要用于腹瀉和炎癥的治療。相關研究表明：BBR能顯著改善脂代謝紊亂及胰島素敏感性[2]，通過抑制巨噬細胞的促炎因子的表達、分泌以及激活細胞內(nèi)NF-κB等炎癥信號通路，從而改善脂肪細胞的葡萄糖代謝和炎癥反應[3]，另外，BBR能夠通過增高Nrf2的核內(nèi)表達，降低氧化應激水平，減輕炎癥狀態(tài)，進而緩解NAFLD[4]。目前，BBR在NAFLD的治療方面是否具有抑制脂肪合成，同時抑制炎癥通路激活的雙重調(diào)控作用尚不清楚。因此，本研究通過高脂飼料誘導構建小鼠NAFLD，觀察小鼠肝臟的變化，并初步探討B(tài)BR調(diào)節(jié)炎癥以及抑制脂肪合成的作用機制，以期為NAFLD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑

BBR(貨號：T4S0797，純度為97.01%)，上海陶素生物科技有限公司；谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒，南京建成生物工程研究所；Toll樣受體4(TLR4)抗體(abcam，ab13556)、IκBα抗體(abcam，ab32518)、p-IκB抗體(abcam，ab113133)、甾醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)抗體(abcam，ab191857)，英國abcam公司貿(mào)易有限公司。

1.1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，上海斯萊克實驗動物有限責任公司。動物房室內(nèi)保持12 h晝夜節(jié)律，溫度(25±2) ℃，自由飲食飲水。

1.1.3 細胞實驗

HepG2細胞用含有總體積10%的胎牛血清、100 μ/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素培養(yǎng)基培養(yǎng)在體積分數(shù)5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.2 方法

1.2.1 動物分組

將24只小鼠隨機分成3組，即普通飼料喂養(yǎng)組(Control)、高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD)、BBR給藥組(HFD +BBR)，每組8只。

1.2.2 造模及給藥

對HFD組與HFD+BBR組的小鼠進行HFD高脂喂養(yǎng)8周，造模完成后，HFD+BBR組每天用200 mg/kg BBR灌胃，4周后處死小鼠，收集血液和肝臟(前一晚禁食不禁水)。

1.2.3 肝臟指數(shù)及指標的測定

肝臟指數(shù) =肝臟重量(g)/體質量(g)

全自動生化分析儀檢測ALT和AST的含量，作為肝臟指標。

1.2.4 肝臟組織的病理觀察

參考丁靜等[4]的方法，用石蠟包埋肝臟組織，切成4 μm薄片，放入60 ℃烘箱烘干，先后浸泡于二甲苯溶液中15 min，重復3次；置于無水乙醇中浸泡min，重復2次；置于體積分數(shù)為95%乙醇溶液中浸泡5 min，重復2次；置于體積分數(shù)為85%乙醇溶液中浸泡5 min，1次；置于體積分數(shù)為75%乙醇溶液中浸泡5 min，1次；置于體積分數(shù)為50%乙醇溶液中5 min，1次。之后進行常規(guī)HE染色，置于顯微鏡下觀察，分析小鼠肝臟的病理學變化。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗

參考姚笑睿等[5]的方法，從小鼠肝組織中提取總蛋白，以免疫印跡法檢測SREBP-1c、TLR4、p-IκB、IκBα的表達情況。

1.2.6 NAFLD體外造模及給藥

參考Fang等[6]的方法，用棕櫚酸(PA)建立體外NAFLD模型。本研究選用PA的最大無毒濃度(0.258 mmol/L)的培養(yǎng)液孵育HepG2細胞24 h。BBR給藥組中PA與PA+BBR同時給藥處理24 h。

1.2.7 細胞油紅O染色

油紅O染色測定HepG2細胞脂質含量。細胞用預冷的磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌2次，在體積分數(shù)為4%多聚甲醛中固定30 min，再用油紅O工作液室溫孵育30 min，然后用體積分數(shù)為60%異丙醇脫色。用PBS洗滌3次后，蘇木精再反染30 s，后置于光學顯微鏡下拍照。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用 GraphPad Prism 7.0程序進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，不同分組間采用單因素方差分析統(tǒng)計，并用LSD檢驗或t檢驗作兩兩比較。其中P<0.05為差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與討論

2.1 BBR對小鼠肝臟指數(shù)的影響

為了驗證BBR對肝臟指數(shù)的影響，設計3組不同處理方式的實驗對小鼠進行檢測，結果見圖1。由圖1可以看出：與對照組相比，HFD組小鼠的肝臟指數(shù)相對較高，經(jīng)BBR處理后則顯著降低。其中，HFD誘導的小鼠的肝臟指數(shù)P小于0. 000 1。該結果還表明：HFD誘導的NAFLD小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的腫脹現(xiàn)象，BBR則可以緩解NAFLD小鼠的肝臟腫脹程度。

圖2 經(jīng)BBR處理NAFLD小鼠肝損傷的抑制作用(HE×100)Fig.2 Liver injury of mice during NAFLD alleviated by BBR treatment(HE×100)

2.2 BBR對小鼠肝組織形態(tài)及病理變化的影響

肝組織形態(tài)及病理表征對BBR的藥理學研究具有重要的參考價值。為了觀察經(jīng)BBR處理后是否會緩解高脂飲食脂肪肝和炎癥反應，對肝組織進行了切片染色(圖2)。

由圖2可知：對照組肝小葉結構清晰分明，肝細胞緊密相連整齊排列，幾乎沒有脂肪細胞，匯管區(qū)也幾乎沒有炎癥細胞；其中，HFD組肝細胞膨脹，排列稀疏，細胞胞質內(nèi)有許多脂滴空泡，細胞核移至邊緣，匯管區(qū)有炎癥細胞浸潤；HFD+BBR組較HFD組脂肪變性顯著減輕，炎癥細胞減少。該結果提示：HFD組小鼠肝臟發(fā)生明顯的脂肪化以及炎癥反應，經(jīng)BBR處理后，則可以緩解HFD誘導的NAFLD小鼠的肝臟脂肪化以及炎癥反應。

**表示 P<0.01，****表示 P<0.000 1圖1 BBR降低NAFLD小鼠肝臟指數(shù)Fig.1 Liver index of mice during NAFLD decreased by BBR(n=8)

2.3 BBR對小鼠肝臟生化指標的影響

肝組織中ALT的高低通常可反映肝細胞的損傷程度，患有NAFLD時，ALT水平通常會增高[7]。隨著肝細胞損傷程度的不同，AST升高的程度依次出現(xiàn)的病癥分別是慢性肝炎、肝癌、肝硬化、急性肝炎、重癥肝炎[8]。通過檢測肝臟中ALT、AST的水平發(fā)現(xiàn)：圖3與對照組相比，HFD組肝臟中ALT、AST的水平顯著升高；與HFD組相比，HFD+BBR組肝臟中ALT、AST的水平顯著下降。該結果提示：HFD誘導的NAFLD小鼠肝臟功能受損，經(jīng)BBR處理后可以緩解小鼠肝功能的損傷(圖3)。

2.4 BBR對小鼠肝臟SREBP-1c和TLR4/IκBα的影響

SREBP-1c是脂肪合成酶(FAS)等成脂蛋白的主要調(diào)節(jié)因子[9]。BBR對小鼠肝臟SREBP-1c和TLR4/IκBα的影響見圖4。由圖4可知：與對照組相比，HFD組中脂肪合成酶主要調(diào)節(jié)因子 SREBP-1c蛋白水平升高，BBR則通過干預，降低了小鼠肝臟中SREBP-1c蛋白的表達水平。該結果提示了HFD誘導小鼠肝臟的脂肪合成，經(jīng)BBR處理后，則可以抑制HFD誘導的脂肪合成。細胞外抗原可以被TLR4特異性識別，并將被識別的細胞外信號轉導入細胞內(nèi)NF-κB。NF-κB是多種細胞因子產(chǎn)生的重要調(diào)控者，可調(diào)節(jié)炎癥基因的表達[10]，從而使炎癥基因在脂肪性肝炎中被激活[11]。與對照組相比，HFD組中介導炎癥反應的蛋白TLR4蛋白水平升高，經(jīng)BBR干預后，可降低小鼠肝臟中TLR4蛋白的表達水平，并且與對照組相比，HFD組中NF-κB信號通路的關鍵蛋白IκBα水平降低，磷酸化水平升高；與HFD組相比，HFD+BBR組IκBα蛋白水平升高，并且可以抑制小鼠肝臟中IκBα蛋白的磷酸化表達。該結果提示了由HFD誘導的小鼠肝臟炎癥反應，可以經(jīng)BBR抑制其誘導的炎癥反應(圖4)。

圖4 BBR調(diào)節(jié)HFD誘導的小鼠肝臟組織中TLR4、p-IκB、IκBα、SREBP-1c 的表達Fig.4 Expression of TLR4，p-IκB，IκBα and SREBP-1c in liver of mice with HFD adjusted by BBR treatment

2.5 BBR對小鼠體外PA誘導的細胞內(nèi)脂質堆積的影響

油紅O染色檢測脂質在HepG2細胞中的積聚情況見圖5。由圖5可知：與對照組相比，PA處理組細胞內(nèi)脂質堆積、脂滴增多；BBR組細胞染色變淺，脂滴明顯減少。該結果說明：經(jīng)BBR處理可以降低PA誘導的HepG2細胞的脂質含量。

圖5 BBR改善PA誘導的HepG2細胞脂質堆積Fig.5 BBR improves the lipid accumulation of HepG2 cells induced by PA

3 結論

由于NAFLD的發(fā)病率和流行性不斷增加，篩選出治療NAFLD的藥物已經(jīng)變得刻不容緩。本研究通過對小鼠體內(nèi)與體外相結合的方式，探討B(tài)BR對高脂誘導的脂肪肝的保護機制。經(jīng)小鼠體內(nèi)實驗結果表明：高脂飲食可誘發(fā)小鼠脂肪肝以及炎癥細胞的增多，BBR能顯著減少肝細胞內(nèi)脂肪沉積以及炎癥細胞數(shù)量。與對照組相比，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠的組織病理學改變會導致肝臟中ALT、AST的含量增加，BBR藥物在減輕高脂飲食對肝功能指標的影響方面具有顯著的治療效果。研究還證實：經(jīng)BBR顯著下調(diào)TLR4的表達量，可以抑制IκBα的磷酸化激活，并且能抑制SREBP-1c的表達。體外實驗油紅O染色檢測結果表明：BBR顯著降低了經(jīng)PA誘導的肝細胞脂質含量。

綜上可知：BBR可以通過抑制SREBP-1c的活性，從而抑制脂肪的合成，同時抑制TLR4/NF-κB通路的觸發(fā)，進而減輕肝臟炎癥?；贐BR的抗炎和抗脂雙重調(diào)節(jié)作用，有望成為治療NAFLD的藥物，但其分子機制仍有待進一步地深入探究。