西瓜籽油脂肪酸成分分析及抗氧化活性研究

盤鵬慧 羅偉強 莫 丹 龐 曉

(廣西民族大學(xué)，廣西 南寧 530006)

西瓜籽中含有維生素、微量元素、蛋白質(zhì)、脂肪等多種營養(yǎng)成分[1-2]，其中脂肪中不飽和脂肪酸含量較豐富[3-4]。研究[5]表明，西瓜籽油有輔助降血脂功能。

目前有關(guān)各種植物油脂的提取、成分及其含量、抗氧化活性的研究時有報道[6-12]，而有關(guān)西瓜籽油的研究多集中在提取工藝方面[13-14]。研究擬采用索氏法對西瓜籽進行提油，用GC-MS對西瓜籽油的脂肪酸組成、含量進行分析，并研究西瓜籽油的體外抗氧化能力，以期為西瓜籽油在天然抗氧化劑、醫(yī)療、保健等方面的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

西瓜籽：市售；

石油醚(沸程60～90 ℃)、硫酸、甲醇、硫酸亞鐵、無水乙醇、三氯化鐵、抗壞血酸(維生素C)、硫酸亞鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器和設(shè)備

電子天平：AB204-S型，上海帥寧儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：GZX-GF101-3BS型，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；

高速多功能粉碎機：CS700型，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB-ⅢA型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

紫外可見分光光度計：752N型，北京合悅達科技有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Clarus500型，美國鉑金埃爾默公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 西瓜籽油的提取 根據(jù)文獻[15]，將西瓜籽置于潔凈的搪瓷盤上，70 ℃干燥6 h。取出，室溫冷卻后取適量西瓜籽于高速粉碎機中攪拌1 min，得西瓜籽細粉。準確稱取40.511 3 g西瓜籽細粉，用濾紙包好放在盛有適量石油醚的燒杯中浸泡6 h。將其取出置于500 mL的索氏提取器中，用石油醚為溶劑回流5 h左右，至溶劑用濾紙檢測無油跡后，停止回流。提取液經(jīng)濾紙過濾后，先用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去大部分溶劑，再通過沸水浴除去殘余溶劑，即得淺黃色的西瓜籽油15.469 g，提取率為38.18%。

1.2.2 西瓜籽油中脂肪酸的GC-MS分析

(1)酯化處理：根據(jù)文獻[16]，略有改動。稱取0.1 g西瓜籽油，加入體積分數(shù)5%的硫酸—甲醇溶液2 mL，60 ℃ 水浴超聲30 min后，再加入正己烷2 mL，充分振蕩后靜置。取上層清液加入無水硫酸鈉，取上層清液進行GC-MS分析。

(2)氣相色譜條件：色譜柱為PE-5彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，以高純氦氣為載氣，流速1.00 mL/min，程序升溫：起始溫度80 ℃，以14 ℃/min升溫至195 ℃，195 ℃保持9 min，然后以6.0 ℃/min升溫至280 ℃，280 ℃保持3 min。進樣口溫度260 ℃，進樣量1.0 μL，分流比40∶1。

(3)質(zhì)譜條件：EI源，電離電壓70 eV，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，掃描范圍33～500 amu。

1.2.3 還原Fe3+能力測定 根據(jù)文獻[17]，將西瓜籽油配置成系列濃度梯度溶液，分別取1 mL各濃度的西瓜籽油溶液，依次加入2.5 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L)、2.5 mL的鐵氰化鉀(10 mg/mL)，50 ℃水浴鍋中恒溫加熱20 min。再加入2.5 mL三氯乙酸(0.1 g/mL)，搖勻后，3 000 r/min離心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL去離子水及0.5 mL的三氯化鐵(1 mg/mL)。室溫下反應(yīng)5 min，在700 nm處測定該樣品吸光度，用去離子水做空白對照，VC作為陽性對照。做3次平行試驗，取平均值。

1.2.4 清除DPPH自由基能力測定 分別量取3 mL各濃度的西瓜籽油溶液與2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L)混合，搖勻后避光靜置30 min，于517 nm處測定其吸光度[18-19]。用去離子水做空白對照，VC作為陽性對照。做3次平行試驗，取平均值，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

E=[1-(A1-A2)/A3]×100%，

(1)

式中：

E——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品溶液和DPPH溶液的吸光值；

A2——樣品溶液和無水乙醇的吸光值；

A3——去離子水和DPPH溶液的吸光值。

1.2.5 清除超氧陰離子自由基能力測定 根據(jù)文獻[20]，修改如下：在具塞試管中分別加入1 mL各濃度的西瓜籽油溶液、4.5 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L)、0.1 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L)，混勻，于25 ℃下反應(yīng)5 min，然后加入1 mL HCl溶液(8 mmol/L)以終止反應(yīng)，于299 nm處測定其吸光度。用去離子水為空白對照，VC作為陽性對照。做3次平行試驗，取平均值，按式(2)計算超氧陰離子自由基清除率。

D=[1-(A1-A2)/A3]×100%，

(2)

式中：

D——超氧陰離子自由基清除率，%；

A1——樣品溶液、Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚溶液、HCl溶液的吸光值；

A2——樣品溶液、Tris-HCl緩沖液、無水乙醇、HCl溶液的吸光值；

A3——去離子水、Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚溶液、HCl溶液的吸光值。

1.2.6 清除羥基自由基能力測定 根據(jù)文獻[21]，修改如下：在試管中分別加入1 mL各濃度的西瓜籽油溶液，然后依次加入6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L的水楊酸—乙醇溶液和8 mmol/L H2O2溶液各1 mL，混勻，在37 ℃恒溫水浴加熱30 min，于510 nm處測定樣品吸光度。用去離子水為空白對照，VC作為陽性對照。做3次平行試驗，取平均值，按式(3)計算羥基自由基清除率。

F=[1-(A1-A2)/A3] ×100%，

(3)

式中：

F——羥基自由基清除率，%；

A1——樣品溶液、硫酸亞鐵溶液、水楊酸乙醇溶液、H2O2溶液的吸光值；

A2——樣品溶液、硫酸亞鐵溶液、無水乙醇的吸光值；

A3——去離子水、硫酸亞鐵溶液、水楊酸乙醇溶液、H2O2溶液的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜籽油GC-MS分析

對西瓜籽油中脂肪酸的成分用GC-MS法進行分析，總離子流圖見圖1。通過計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫和人工譜圖解析相結(jié)合的手段進行檢索，分析判定各成分，共鑒定出8種化合物，其中6種為脂肪酸。運用面積歸一化法對化合物進行相對定量，結(jié)果見表1。

圖1 西瓜籽油甲脂化后總離子流色譜圖Figure 1 Total ion flow chromatogram of watermelon seed oil after methylated

表1 西瓜籽油脂肪酸組成的分析結(jié)果Table 1 The identification results of fatty acids in watermelon seed oil

由表1可看出，西瓜籽油中的脂肪酸含量較高，其中亞油酸甲脂、反油酸甲酯、油酸甲酯均為不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸達53.21%。不飽和脂肪酸中，尤以(Z,Z)-9,12-十八碳二烯酸(俗稱亞油酸)含量較高，達34.70%。亞油酸是人體必需的脂肪酸之一，其可降低血液中膽固醇含量，如人體缺乏亞油酸，膽固醇就會與一些飽和脂肪酸結(jié)合，導(dǎo)致代謝障礙，從而引發(fā)心腦血管方面的疾病。因此，西瓜籽油可作為功能性油脂進行開發(fā)。

2.2 西瓜籽油的抗氧化能力

2.2.1 Fe3+還原力 樣品在700 nm處的吸光值越大，其還原Fe3+能力則越強[22-23]。由圖2可知，西瓜籽油和VC都有還原能力，濃度增加二者還原能力亦隨之增強，西瓜籽油的還原能力低于VC的還原能力。

圖2 西瓜籽油對Fe3+的還原能力Figure 2 Effect of watermelon seed oil on reducing Fe3+

2.2.2 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，VC對DPPH自由基的清除能力很好，對DPPH自由基的清除率在2～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均在97%左右，且濃度變化對清除率的影響不大。而在2～10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，西瓜籽油清除DPPH自由基的能力呈劑量依賴性增強，當西瓜籽油質(zhì)量濃度<6 mg/mL時，西瓜籽油對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加明顯增大，當質(zhì)量濃度超過6 mg/mL時，西瓜籽油對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增加的增幅減慢。當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，西瓜籽油對DPPH自由基的清除率為27.48%，當質(zhì)量濃度增加到10 mg/mL時，西瓜籽油對DPPH自由基的清除率達到90.73%，接近同質(zhì)量濃度VC的清除能力。根據(jù)回歸方程，得出西瓜籽油清除DPPH自由基的IC50值為3.7 mg/mL。

2.2.3 超氧陰離子自由基清除能力 由圖4可知，西瓜籽油和VC對超氧陰離子自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增加而有所增大，在0.02～0.10 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，VC對超氧陰離子自由基的清除率從18.80%增大到40.17%，西瓜籽油對超氧陰離子自由基的清除率僅從48.72%增大到58.12%，西瓜籽油對超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度增大而增強的幅度相對較小。當質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時，VC對超氧陰離子自由基的清除率為18.80%，而西瓜籽油對超氧陰離子自由基的清除率達到了48.72%，可見西瓜籽油對超氧陰離子自由基的清除能力比VC的大得多。根據(jù)回歸方程，得出西瓜籽油清除超氧陰離子自由基的IC50值為0.031 mg/mL。

圖3 西瓜籽油對DPPH自由基的清除能力Figure 3 The DPPH scavenging activity of watermelon seed oil

圖4 西瓜籽油對超氧陰離子自由基的清除能力Figure 4 The superoxide anion free radicals activity of watermelon seed oil

2.2.4 羥基自由基清除能力 由圖5可知，西瓜籽油和VC對羥基自由基的清除能力均隨質(zhì)量濃度的增加而增大，但西瓜籽油對羥基自由基的清除率增加較緩慢。質(zhì)量濃度從0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL時，VC對羥基自由基的清除率從72.93%增加到98.92%，而西瓜籽油對羥基自由基的清除率僅從4.68%增加到11.87%。由此可見，西瓜籽油對羥基自由基的清除能力不僅隨質(zhì)量濃度增大而增加的幅度較小，且對羥基自由基的清除能力較弱。根據(jù)回歸方程，得出西瓜籽油清除羥基自由基的IC50值為12.04 mg/mL。

圖5 西瓜籽油對羥基自由基的清除能力Figure 5 The hydroxyl free radicals activity of watermelon seed oil

3 結(jié)論

試驗采用索氏回流法對西瓜籽進行提油，經(jīng)GC-MS檢測分析其含有6種脂肪酸，其中不飽和脂肪酸相對含量達到50%以上，亞油酸含量達到34.70%，具有較高的營養(yǎng)價值。通過抗氧化試驗研究表明，西瓜籽油對DPPH自由基的IC50值為3.7 mg/mL，對超氧陰離子自由基的IC50值為0.031 mg/mL，對羥基自由基的IC50值為12.04 mg/mL，對3種自由基清除能力的排序為超氧陰離子自由基>DPPH自由基>羥基自由基。西瓜籽油有良好的抗氧化能力，在醫(yī)療、保健等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。后期將針對各不飽和脂肪酸對其抗氧化性的貢獻作用進行深入分析。