清熱解毒方抗低危型人乳頭瘤病毒作用的體外實驗研究

冉雪夢，呂佳，孫選

[青島市中醫(yī)醫(yī)院（市海慈醫(yī)院），山東 青島 266033]

低危型人乳頭瘤病毒（HPV）主要引起尖銳濕疣（CA）、皮膚疣等疾病，其中CA又稱生殖器疣或性病疣，是由HPV感染引起的表皮良性增生性疾病，90%CA與HPV-6型與HPV-11型感染有關(guān)[1]，張鈺穎等[2]通過對CA患者組織中的HPV型別進行研究發(fā)現(xiàn)，感染率較高的依次為HPV-6/11、HPV-6、

HPV-11，在歐美及非洲地區(qū)HPV-6占70%以上，其次是HPV-11型。目前對于CA的治療多是去除疣體，尚缺乏預(yù)防疾病復(fù)發(fā)的有力措施。本研究所用的清熱解毒方，通過水煎外洗治療外陰CA、皮膚病毒性疣，已用于臨床10余年，療效顯著。本實驗擬對清熱解毒方在抗低危型HPV（HPV-6，HPV-11）方面的體外活性、作用方式以及作用機制等進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 清熱解毒方組成：金銀花30 g、大青葉 30 g、板藍根 30 g、紫草 30 g、虎杖 30 g、薏苡仁30 g、土茯苓 30 g、白花蛇舌草 30 g、木賊 30 g、連翹15 g、當(dāng)歸 15 g、赤芍 15 g、莪術(shù) 15 g、黃柏 15 g、苦參15 g和生甘草10 g，由青島市海慈醫(yī)療集團制劑室制備，采用密閉單體煎藥機（SJ20）煎煮2次，過濾濃縮至1 000 g/L，冷卻后放入4℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 HPV-6和HPV-11假病毒（中國海洋大學(xué)制備，批號：20190103）；Hela細胞（中科院上海細胞庫，批號：ATCCCCL-2.1）；293 FT 細胞（中科院上海細胞庫，批號：ATCC ACS-4500）；磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF5905）、磷酸化的蛋白激酶（p-Akt）（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AF6180）、β-actin（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：AA128），DMEM高糖培養(yǎng)基（Life technoligies corporation，批號：12100-038），胰酶（索萊寶，批號：T8151）；0.05%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（美國Invitrogen，批號：25300-054）；Pierce Firefly Luciferase Glow Assay Kit（Thermo scientific，批號：16177）；磷酸鹽緩沖液（PBS）、洗膜緩沖液（TBST）、杜氏磷酸緩沖液（DPBS）均為實驗室配制。

1.1.3 儀器 CO2恒溫箱（美國，Thermo Scientific，Herocell 150）；酶標(biāo)分析儀（奧地利，Rainbow，MLS-3750）；高溫滅菌鍋（日本，SANYO電機株式會社，MLS-3750）；熒光正置顯微鏡（日本，OLYMPUS，BX51）；低溫離心機（美國，Beckman，GS-15R）。

1.2 實驗方法

1.2.1 清熱解毒方對細胞的毒性測定 將50 μL含有12 000 cells/mL 293FT細胞及Hela細胞液分別鋪到96孔板中，培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)液吸出，每孔加入新鮮DMEM培養(yǎng)基90 μL；用DMEM培養(yǎng)基將中藥稀釋成100～6.25 g/L（1/10～1/160稀釋倍數(shù)）藥液，每孔加入10 μL中藥稀釋液，每個濃度重復(fù)3孔。并設(shè)置空白對照組（中藥以PBS1×代替）。24 h后每孔添加 100 μL改良 Eagle培養(yǎng)基（DMEM），繼續(xù)培養(yǎng)至 48 h，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽染料法（MTT）[3-4]檢測細胞生長情況，以相對存活率情況（中藥組/空白對照組×100%）評價清熱解毒方的細胞毒作用。

1.2.2 清熱解毒方抗HPV感染的藥效學(xué)評價 將50 μL含有12 000 cells/mL 293FT細胞的細胞液鋪到96孔板中，培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)液吸出，每孔加入新鮮DMEM培養(yǎng)基40 μL；同時，用DMEM培養(yǎng)基稀釋假病毒液，每孔加入50 μL HPV-6及HPV-11假病毒稀釋液（2.16 TU/mL）；用DMEM培養(yǎng)基將中藥稀釋成100～6.25 g/L（1/10～1/160稀釋倍數(shù)）藥液，每孔加入10 μL中藥稀釋液，每個濃度重復(fù)3孔。并設(shè)置空白對照組（病毒以DMEM培養(yǎng)基代替，中藥以PBS 1×代替）和病毒對照組（中藥以PBS 1×代替）。24 h后每孔添加100 μL DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，檢測熒光素酶的表達情況，以相對熒光表達情況（中藥組/病毒對照組×100%）評價清熱解毒方的抗HPV效果。

1.2.3 清熱解毒方作用方式的探討 按照1.2.2中的實驗步驟，配置25 g/L中藥液以及2.16 TU/mL HPV-6假病毒稀釋液，探討清熱解毒方抗病毒的4種作用方式，每種作用方式重復(fù)3孔，分別為①藥物預(yù)處理病毒：將10 μL中藥液加入到50 μL稀釋病毒液中孵育30 min，然后加入細胞中，再加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基40 μL；②藥物預(yù)處理細胞：將10 μL中藥液加入到細胞中孵育30 min，然后加入50 μL稀釋病毒液，再加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基40 μL；③病毒吸附同時加入藥物：將50 μL稀釋病毒液、40 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基以及10 μL中藥液同時加入到細胞中，再加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基40 μL；④病毒處理后加入藥物：加入 50 μL稀釋病毒液以及40 μL新鮮的DMEM培養(yǎng)基，再加入中藥液10 μL。并設(shè)置空白對照組和病毒對照組。37℃、CO2恒溫箱培養(yǎng)；24 h后每孔添加100 mL DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，檢測熒光素酶的表達情況，以相對熒光表達情況（中藥組/病毒對照組×100%）評價清熱解毒方的抗HPV作用方式。

1.2.4 清熱解毒方作用機制的探討 將100 μL含有5 000 cells/mL Hela細胞的細胞液鋪到6孔板中，培養(yǎng)過夜。次日，將培養(yǎng)液吸出，將清熱解毒方母液用DMEM培養(yǎng)基稀釋成不同的濃度（100、50、25、12.5 g/L），并設(shè)立病毒對照組（以 PBS 1×代替）。培養(yǎng)至48 h后，分別提取各個孔中的總蛋白，測定p-PI3K及p-Akt的表達情況。分別將提取的蛋白與一抗（p-PI3K 一抗稀釋比例為1∶1 000；p-Akt一抗稀釋比例為 1∶1 000；β-actin 一抗稀釋比例為 1∶1 500）及二抗孵育，最后采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒顯色，以p-PI3K及p-Akt為目的蛋白，βactin為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠定量分析軟件Gel-Pro 32 analyzer對蛋白顯色結(jié)果進行圖像分析，并計算得到各組的灰度值，以β-actin內(nèi)參的灰度值作為對照，計算各個給藥濃度的PI3K及Akt蛋白的相對灰度值，并以對照孔比較計算抑制率。

1.2.5 檢測指標(biāo) 委托中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院對熒光素酶的熒光值指標(biāo)進行檢測，按照說明書具體操作方法為：吸取細胞培養(yǎng)液后，加入適量的細胞裂解液，充分裂解后，10 000 r/min，離心半徑為5 cm，離心3 min，去上清用于測定。溶解熒光素酶檢測試劑，并達到室溫，取樣品20 μL于96孔板中，并加入50 μL/孔細胞裂解液，酶標(biāo)儀檢測612 nm的熒光素酶數(shù)值，以報告基因細胞裂解液為空白對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用t檢驗進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 清熱解毒方對細胞的毒性測定 采用293FT細胞及Hela細胞評價清熱解毒方對細胞存活率的影響，結(jié)果顯示清熱解毒方對細胞安全無毒，可應(yīng)用于進一步的實驗研究。見表1。

表1 清熱解毒方對細胞的毒性作用 （±s）

表1 清熱解毒方對細胞的毒性作用 （±s）

H e l a相對存活率（%）空白對照組 0 1 0 0 1 0 0 1/1 0 稀釋組 1 0 0 9 3.2±0.8 9 5.3±1.2 1/2 0 稀釋組 5 0 9 4.6±1.0 9 6.4±2.6 1/4 0 稀釋組 2 5 9 4.1±0.4 9 8.5±1.0 1/8 0 稀釋組 1 2.5 9 8.6±1.5 9 7.1±3.1 1/1 6 0 稀釋組 6.2 5 9 7.3±0.5 9 8.7±1.3組別 用藥劑量（g/L）2 9 3 F T相對存活率（%）

2.2 清熱解毒方抗HPV活性評價 采用HPV體外假病毒模型，研究清熱解毒方抗低危型HPV感染的作用，結(jié)果顯示病毒對照組與空白對照組相比，HPV病毒熒光表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明HPV感染模型表達成功。與病毒對照組相比，中藥在6.25～100.00 g/L的給藥劑量下，各個HPV組別均能顯著降低感染細胞內(nèi)HPV病毒熒光素酶的表達，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系。其中中藥濃度為25～100 g/L時，中藥能顯著抑制HPV-6的熒光表達（P＜0.01）；中藥濃度為 50～100 g/L 時，中藥能顯著抑制HPV-11的熒光表達（P＜0.01）。以上實驗結(jié)果表明清熱解毒方有抗低危型HPV感染的作用。見表2。

表2 清熱解毒方抗HPV感染作用 （±s）

表2 清熱解毒方抗HPV感染作用 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與病毒對照組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

H P V-1 1相對熒光值（%）空白對照組 0 0 0病毒對照組 0 1 0 0.0±1.2* 1 0 0.0±1.2*1/1 0 稀釋組 1 0 0 1 3.5±0.8** 1 9.4±1.2**1/2 0 稀釋組 5 0 2 1.6±1.0** 3 5.2±2.6**1/4 0 稀釋組 2 5 3 5.0±0.4** 4 1.0±1.0#1/8 0 稀釋組 1 2.5 5 8.0±1.5# 5 0.7±3.1#1/1 6 0稀釋組 6.2 5 6 4.5±0.5# 6 1.8±1.3#組別 用藥劑量（g/L）H P V-6相對熒光值（%）

2.3 清熱解毒方抗HPV作用方式研究 采用HPV體外假病毒模型，研究清熱解毒方抗HPV-6的作用方式，用25 g/L中藥稀釋液預(yù)處理病毒（Pre-virus）、中藥液在病毒感染之前預(yù)處理細胞（Pre-cell）、病毒吸附同時加入藥液以及病毒吸附之后加入藥液。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒對照組與空白對照組相比，熒光表達量升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明模型表達成功。與病毒對照組相比，在4種不同的作用方式下，清熱解毒方都能顯著降低HPV病毒的表達（P＜0.05），其中藥物預(yù)處理病毒及病毒吸附時加藥的效果更加顯著（P＜0.01），說明清熱解毒方可用于HPV感染的防治。見表3。

表3 清熱解毒方抗HPV作用方式 （±s）

表3 清熱解毒方抗HPV作用方式 （±s）

注：與空白組比較，*P＜0.01；與病毒對照組比較，**P＜0.01，#P＜0.05。

組別 用藥劑量（g/L） 相對熒光值（%）空白對照組 0 0病毒對照組 0 100.0±4.1*藥物預(yù)處理病毒組 25 26.3±1.3**藥物預(yù)處理細胞組 25 61.0±1.2#病毒吸附時加藥組 25 29.6±1.0**病毒吸附后加藥組 25 72.4±1.4#

2.4 清熱解毒方抗低危型HPV作用機制研究 PI3K、Akt是HPV病毒感染過程中的重要蛋白，本實驗探討清熱解毒方對Hela細胞中p-PI3K及p-Akt的影響，結(jié)果顯示與病毒組比較，清熱解毒方濃度為12.5～100.0 g/L時，能夠抑制PI3K及Akt蛋白的表達。與病毒組比較，清熱解毒方濃度為50～100 g/L之間均能顯著抑制PI3K的磷酸化（P＜0.05），其中100 g/L濃度時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與病毒組比較，清熱解毒方濃度在25～100 g/L范圍內(nèi)，細胞中的Akt蛋白表達含量下降（P＜0.05），其中在50～100g/L 范圍內(nèi)，Akt蛋白表達顯著性下降（P＜0.01）。以上實驗說明清熱解毒方是通過抑制PI3K-Akt磷酸化促進細胞的凋亡。見圖1、2。

圖1 清熱解毒方對Hela細胞中PI3K、Akt表達的影響

圖2 清熱解毒方對Hela細胞中PI3K、Akt表達的影響

3 討論

本研究中的清熱解毒方為經(jīng)驗方，臨床應(yīng)用10余年，水煎外洗局部治療CA，療效顯著。方中金銀花為“瘡瘍圣藥”，最善清熱解毒療瘡；大青葉、板藍根清熱解毒、涼血消腫，紫草、虎杖涼血活血并利濕，薏苡仁、土茯苓、白花蛇舌草利濕消腫；連翹、木賊疏風(fēng)清熱，連翹亦解毒消腫散結(jié)，當(dāng)歸、赤芍、莪術(shù)活血化瘀、消腫散結(jié)，黃柏、苦參清熱燥濕；生甘草清熱解毒、調(diào)和諸藥。全方共奏清熱解毒，活血祛濕，消腫散結(jié)之功效?，F(xiàn)代藥理研究亦表明[5]，金銀花、連翹、大青葉、板藍根、紫草、虎杖、土茯苓、白花蛇舌草等有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，清熱解毒方可抑制高危型HPV病毒的表達，局部用藥對于宮頸HPV轉(zhuǎn)陰的臨床療效確切，明顯優(yōu)于辛復(fù)寧[6]，臨床使用安全可靠；另外通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，清熱解毒方能抑制Hela細胞中E6、E7致癌蛋白及腫瘤相關(guān)因子ERK、NF-κB的表達[7]。E6和E7是HPV致癌蛋白，分別與細胞內(nèi)抑癌蛋白P53、磷酸化的視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白（PRb）結(jié)合，誘導(dǎo)細胞癌變[8]；細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）以及細胞核因子（NF）-κB 在腫瘤中高度表達，能抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9-10]。以上研究均為清熱解毒方抗HPV作用研究提供了理論基礎(chǔ)。前期通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)清熱解毒方水煎濃縮藥液局部外洗治療復(fù)發(fā)性CA療效顯著，對于低危型HPV轉(zhuǎn)陰效果確切，安全性高，為清熱解毒方防治CA的新藥開發(fā)提供了臨床依據(jù)。本研究對藥物體外抗低危型HPV作用進行探討，但HPV傳染性強，致病率高，并對組織分化有嚴格要求[11]，在體外難以進行組織培養(yǎng)，給科研工作帶來極大的困難，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，采用病毒衣殼蛋白制備而成的假病毒安全性較高[12]，假病毒有天然病毒的類似大小及結(jié)構(gòu)，且有非宿主細胞依賴、非周期依賴、安全性高、體外易于培養(yǎng)等優(yōu)點，作為一種安全的研究手段，其在HPV病毒研究中發(fā)揮著重要的作用[13-15]。

本研究采用HPV熒光素酶體外假病毒模型，評價清熱解毒方抗低危型HPV活性，并探討其抗HPV作用方式（藥物預(yù)處理病毒、藥物預(yù)處理細胞、病毒吸附時加藥、病毒吸附后給藥），為清熱解毒方在CA等疾病的治療中提供理論基礎(chǔ)。實驗結(jié)果表明，清熱解毒方在細胞水平安全無毒，并可以顯著抑制HPV假病毒的感染，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴關(guān)系；進一步實驗結(jié)果表明，清熱解毒方可通過多種方式來抑制HPV感染，其中藥物預(yù)處理病毒及病毒吸附同時加藥的效果顯著（P＜0.01），說明清熱解毒方能夠防治HPV感染，并抑制病毒進入細胞過程。PI3K家族參與多種信號通路，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、存活和遷移等[16]。PI3K活化而產(chǎn)生的類脂產(chǎn)物3，4-二磷酸磷脂酰肌醇和3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇作為第二信使激活多種細胞內(nèi)的AktB和3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（PDK）1，促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308導(dǎo)致Akt的活化。PI3K及處于其下游的Akt的信號通路在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展演變過程中發(fā)揮重要作用，該信號通路調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖和存活，調(diào)節(jié)細胞惡性轉(zhuǎn)化等，并通過多方面機制，使宿主細胞發(fā)生轉(zhuǎn)變，甚至是癌變[17]。本研究發(fā)現(xiàn)清熱解毒方可顯著抑制PI3K及Akt的磷酸化抑制其表達，為HPV導(dǎo)致的CA等疾病的治療提供新的途徑和創(chuàng)新性的理論依據(jù)。