涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者外周血單核細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的影響

王亞翠，賈瑞璇，王文歡，王紅梅

（1.四川省科學(xué)城醫(yī)院，四川 綿陽(yáng) 621900；2.天津市西青區(qū)中北鎮(zhèn)社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，天津 300393；3.大連市皮膚病醫(yī)院，遼寧 大連 116021；4.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性疾病，現(xiàn)代 研究發(fā)現(xiàn)與表觀遺傳因素有關(guān)，多種致病原因刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，引起局部炎性反應(yīng)和角質(zhì)形成細(xì)胞的異常分化增生而形成此病[1]。核因子（NF）-κB是一種作用廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，可以誘導(dǎo)成千上百種基因的表達(dá)，如生長(zhǎng)因子、黏附因子和細(xì)胞因子等的轉(zhuǎn)錄[2]，其在調(diào)控免疫細(xì)胞的激活、凋亡、腫瘤的形成、炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮重要的作用[3]。目前發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損中黏附分子和細(xì)胞因子異常表達(dá)，如腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-1和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）等，這些因子和分子的編碼基因都含與NF-κB相結(jié)合的位點(diǎn)[4]。許多研究表明，銀屑病患者皮損中NF-κB的表達(dá)明顯增加，證明可能NF-κB的活化是銀屑病病理形成的原因之一[5]。涼血消風(fēng)湯是邊天羽教授治療銀屑病血熱證的有效方劑，臨床應(yīng)用數(shù)十載，療效顯著。其可以降低患者血清中干擾素（IFN）-γ、IL-2、IL-8、TNF-α等炎性因子，抑制炎性反應(yīng)，還可以調(diào)節(jié)乙?；瘍?nèi)穩(wěn)態(tài)，達(dá)到治療銀屑病的作用[6-8]。本課題以涼血消風(fēng)湯治療血熱型銀屑病患者，觀察治療前后銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評(píng)分，并研究涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中NF-κB表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討涼血消風(fēng)湯治血熱型療銀屑病的可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 臨床資料 收集2016年12月—2017年12月天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院銀屑病專科門(mén)診就診的血熱型進(jìn)行期銀屑病患者，10＜PASI評(píng)分＜30。正常對(duì)照組選取來(lái)源于本院健康體檢人群。所有受試者均簽署知情同意書(shū)，由經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。銀屑病組共收集32例，脫落4例。其中2例脫落為病情加重，口服西藥治療，2例自行退出。受試患者男16例，女12例；年齡14～57歲，平均（35.57±11.91）歲；病程 0.3～17.0 年，平均（5.76±4.60）年。正常對(duì)照組收集28例健康者。其中，男14例，女14例；年齡 21～60歲，平均（36.75±11.40）歲。2組間年齡及性別比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有可比性。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 尋常型銀屑病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照趙辨主編《中國(guó)臨床皮膚病學(xué)》[1]，依據(jù)皮損形態(tài)、自覺(jué)癥狀、好發(fā)部位及病理表現(xiàn)等作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。血熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[9]，血熱證主癥：新皮疹不斷出現(xiàn)，以丘疹、斑丘疹為主，疹基底皮膚顏色鮮紅；刮去鱗屑見(jiàn)點(diǎn)狀出血，可有同形反應(yīng)。次癥：初發(fā)或復(fù)發(fā)，可有不同程度瘙癢，心煩口渴或口干，便秘尿黃，舌質(zhì)紅，苔黃脈數(shù)。具備以上主癥及次癥2項(xiàng)以上者即可診斷。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合尋常型銀屑病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，10＜PASI評(píng)分＜30，處于銀屑病進(jìn)行期；②符合血熱證診斷標(biāo)準(zhǔn)；③年齡10～70歲；④3個(gè)月內(nèi)無(wú)系統(tǒng)應(yīng)用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素或維甲酸類藥物治療；⑤近1個(gè)月內(nèi)無(wú)外用藥物史；⑥身心健康，無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎疾病，血尿便常規(guī)、肝腎功能及其他生化指標(biāo)正常；⑦患者簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠、哺乳期、孕婦或1年內(nèi)計(jì)劃妊娠者；②并有嚴(yán)重心、肝、腎疾患及惡性腫瘤患者；③有嚴(yán)重感染、水電解質(zhì)及酸堿平衡紊亂者；④既往有病毒性肝炎等傳染病病史；⑤其他證型銀屑病，如血瘀型、血燥型等；⑥近2周內(nèi)服過(guò)糖皮質(zhì)激素藥物，或1周內(nèi)服過(guò)維甲酸類藥物或外用過(guò)糖皮質(zhì)激素制劑，4周內(nèi)曾接受紫外光治療或系統(tǒng)治療者；⑦12周內(nèi)曾使用生物制劑治療者；⑧對(duì)本研究用藥過(guò)敏者；⑨正在參加其他藥物臨床試驗(yàn)者或1個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)者。剔除標(biāo)準(zhǔn)：納入后發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，或未按本治療方案規(guī)范實(shí)施的病例，需予剔除，其結(jié)果不計(jì)入最終統(tǒng)計(jì)分析。脫落標(biāo)準(zhǔn)：①不按時(shí)服用藥物、復(fù)診或自行退出；②患者病情加重需使用其他藥物應(yīng)急處理者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 銀屑病組服用涼血消風(fēng)湯（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑皮炎2號(hào)顆粒），6 g/次，2次/d，飯后 0.5 h用溫開(kāi)水口服。涼血消風(fēng)湯的藥物組成：生地30 g、白茅根30 g、玄參9 g、金銀花 15 g、生石膏 30 g、知母 9 g、白芍 12 g、荊芥9 g、防風(fēng)9 g、牛蒡子9 g、升麻3 g和甘草6 g。正常對(duì)照組為健康者，不采取任何治療措施。

1.2.2 PBMC收集 銀屑病組分別于治療前和治療后4周進(jìn)行靜脈采血，對(duì)照組只抽取1次。早晨空腹抽取靜脈血于肝素抗凝管中，約3 mL，用密度梯度離心法，人淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶）分離出PBMC，移入1.5 mL EP管，放入-80℃冰箱凍存，備用。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 臨床觀察指標(biāo) 臨床療效評(píng)價(jià)指標(biāo)：PASI評(píng)分。皮損癥狀療效判定：采用PASI評(píng)分，于治療前、治療4周后，各進(jìn)行1次評(píng)價(jià)。培訓(xùn)檢測(cè)人員，使用經(jīng)過(guò)色差矯正的數(shù)字化攝影設(shè)備對(duì)皮損面積、嚴(yán)重程度進(jìn)行記錄，并與日本引進(jìn)的比色板進(jìn)行比對(duì)，客觀測(cè)評(píng)PASI評(píng)分。療效計(jì)算公式（尼莫地平法）為：PASI積分=[（治療前積分-治療后積分）/治療前積分]×100%。愈顯率=（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)）/總病例數(shù)×100%?？傆行?（治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+好轉(zhuǎn)例數(shù)）/總病例數(shù)×100%。痊愈：PASI積分下降＞90%。顯效：PASI積分下降60%～89%。好轉(zhuǎn)：PASI積分下降25%～59%。無(wú)效：PASI積分下降＜25%。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測(cè)定PBMC 中 IKKβ、IκBα、p50、p65的基因表達(dá)水平 從冰箱中取出PBMC，按Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明書(shū)提取PBMC總RNA，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Thermo Scientific公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，請(qǐng)上海生工公司設(shè)計(jì)合成。引物序列如下：內(nèi)參基因（GAPDH） 引物序列：F：TGA GTC CTT CCA CGA TAC CA，R：ATC CCA TCA CCA TCT TCC AG；IKKβ：F：ACG ACC TAG AGG AGC AAG CA，R：AGC TCT GAA TTG CCT GAA GC；IκBα：F：CTC CAT CCT GAA GGC TAC CA，R：TCC TGA GCA TTG ACG TCA GC；p50：F：GAG GAT GGG ATC TGC ACT GT，R：TCT GTC ATT CGT GCT TCC AG；p65：F：TCA ATG GCT ACA CAG GAC CA，R：CAG CCT CAT AGA AGC CAT CC。使用Rt-PCR儀：Light Cycler 96（中國(guó)ROCHE公司）和Rt-PCR試劑SGExcel FastSYBR Mixture（BBI Life Sciences）建立 20 μL RT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：預(yù)變性 95℃10min，（95℃10s，60℃20s，72 ℃ 15 s）×40 個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.3.3 Western blot測(cè)定 PBMC 中 IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65的蛋白表達(dá)水平 從冰箱中取出PBMC，按RIPA裂解液（上海生工）說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，將蛋白質(zhì)用SDS-PAGE（北京索萊寶）電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBS（北京索萊寶）液封閉，結(jié)合一抗4℃過(guò)夜。IKBKB兔抗多克隆抗體（Cloud-CloneCorpPAJ822Hu01）1∶200；P-RELA 兔抗多克隆抗體（BBI.Co.Ltd D155097）1∶500；NF-κB1 兔抗多克隆抗體（BBI.Co.LtdD220134）1∶500；P-NFκBIA兔抗多克隆抗體（Cloud-Clone Corp A10017R）1∶500。TBS漂洗3次后滴加二抗（羊抗鼠-HRP（北京中杉金橋）1∶20000，羊抗兔-HRP（北京中杉金橋）1∶20000）孵育60 min，BIO-RAD ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)BIO-RAD公司）收集圖像，結(jié)果用測(cè)得目標(biāo)帶的密度與β-actin的密度比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件儲(chǔ)存和分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若樣本數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布及方差齊性，則組間比較獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較用配對(duì)t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布及方差齊性，則組間比較采用2個(gè)獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后PASI評(píng)分比較 治療前后PASI評(píng)分比較經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，t=13.627，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明經(jīng)涼血消風(fēng)湯治療后PASI評(píng)分下降明顯，臨床療效顯著。見(jiàn)表1。

表1 治療前與治療后PASI評(píng)分比較 （分，±s）

表1 治療前與治療后PASI評(píng)分比較 （分，±s）

組別 n PASI評(píng)分銀屑病組治療前PASI 28 19.3±5.34銀屑病組治療后PASI 28 9.7±2.77治療前-治療后 9.6±3.73

臨床療效判定：給予涼血消風(fēng)湯治療后評(píng)定PASI：痊愈0例，顯效5例，好轉(zhuǎn)23例，無(wú)效0例，愈顯率17.2%，總有效率100.0%。說(shuō)明涼血消風(fēng)湯能夠有效改善血熱型銀屑病患者的臨床癥狀。

2.2 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者PBMC中IKKβ、IκBα、p50、p65 mRNA 表達(dá)的影響 PCR 結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，銀屑病組治療前PBMC中IKKβ、p50、p65的mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01或P＜0.05）；銀屑病組治療后與治療前比較，IKKβ、p50、p65 mRNA 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01或 P＜0.05）；IκBαmRNA 溶解曲線呈雙峰，可能基因擴(kuò)增的特異性不強(qiáng)，存在非特異性產(chǎn)物。見(jiàn)表2。

表2 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑患者PBMC中IKKβ、p50、p65 mRNA表達(dá)水平的影響 （±s）

表2 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑患者PBMC中IKKβ、p50、p65 mRNA表達(dá)水平的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01；與銀屑病組治療前比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n IKKβ p50 p65正常對(duì)照組 16 0.730±0.188 0.707±0.196 0.665±0.174銀屑病組治療前 16 1.078±0.312**0.913±0.261*1.010±0.271**銀屑病組治療后 16 0.709±0.293## 0.718±0.162#0.679±0.179##F 1.441 1.060 4.713 P 0.000 0.017 0.001

2.3 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表達(dá)水平的影響 Western Blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，銀屑病組治療前PBMC 中 IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.01或 P＜0.05），銀屑病組治療后與治療前比較，IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01 或 P＜0.05）。見(jiàn)表 3、圖 1。

表3 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

表3 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65蛋白表達(dá)水平的影響 （±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05**P＜0.01；與銀屑病組治療前比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n IKKβ p-IκBα p50 p-p65正常對(duì)照組 16 0.254±0.111 0.183±0.091 0.167±0.093 0.151±0.120銀屑病組治療前 16 0.554±0.095** 0.561±0.261** 0.464±0.098** 0.436±0.108**銀屑病組治療后 16 0.411±0.073## 0.363±0.199# 0.316±0.141## 0.273±0.116##F 0.180 4.016 0.048 0.154 P 0.000 0.000 0.001 0.001

圖1 涼血消風(fēng)湯對(duì)血熱型銀屑病患者PBMC中IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

尋常型銀屑病是在遺傳背景下，多基因多環(huán)境因素相關(guān)的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，免疫炎性反應(yīng)被認(rèn)為是其發(fā)病機(jī)制之一[10]。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞中的有多向調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，可參與機(jī)體多種免疫和炎性反應(yīng)。NF-κB被視為銀屑病炎癥和免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)的“調(diào)控閥門(mén)”[11]。

NF-κB廣泛存在于多種細(xì)胞中，NF-κB在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中最常見(jiàn)的是p65與p50結(jié)合形成p65/p50二聚體[3]。靜息狀態(tài)下NF-κB與其抑制蛋白I-κB結(jié)合形成三聚體存在于細(xì)胞核外，當(dāng)細(xì)胞受到外源信號(hào)觸發(fā)（如細(xì)胞因子、應(yīng)激反應(yīng)等）后，體內(nèi)的免疫和炎性機(jī)制激活，蛋白酶的磷酸化使IKK活化，IKK能引起IκB磷酸化泛素化降解，NF-κB信號(hào)被激活形成游離狀態(tài)的NF-κB p65，與DNA鏈上特異部位結(jié)合，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。炎性信號(hào)再次正反饋?zhàn)饔糜诎屑?xì)胞進(jìn)一步激活NF-κB信號(hào)通路，如此形成炎性反應(yīng)持續(xù)放大的環(huán)形回路[12-13]。p65、IκBα的磷酸化水平是證實(shí)NF-κB通路活化的重要檢測(cè)指標(biāo)[14]。

有研究對(duì)銀屑病患者的皮膚活體組織進(jìn)行NF-κB的染色，發(fā)現(xiàn)NF-κB染色的表皮細(xì)胞與表皮增生的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，NF-κB染色的基底細(xì)胞與炎性浸潤(rùn)之間有顯著的相關(guān)性，淋巴細(xì)胞染色與NF-κB染色的表皮和基底細(xì)胞有很強(qiáng)的相關(guān)性[15]。還有研究表明銀屑病患者皮損區(qū)免疫組化發(fā)現(xiàn)NF-κBp65表達(dá)高于正常人表皮[16]，銀屑病患者外周血NF-κB表達(dá)水平明顯高于正常人，表明NF-κB可能參與了銀屑病的發(fā)病。本項(xiàng)研究檢測(cè)到銀屑病患者 PBMC 中 NF-κB 信號(hào)通路中 IKKβ、p50、p65 mRNA表達(dá)水平顯著高于正常人，同樣發(fā)現(xiàn)IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65的蛋白表達(dá)水平顯著高于正常人，說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路活化是銀屑病發(fā)病的重要原因之一。

著名中西醫(yī)結(jié)合皮膚病專家邊天羽根據(jù)大量臨床病例的積累，創(chuàng)造性地提出了皮膚病氣血風(fēng)熱證，指出治法為涼血清熱祛風(fēng)，選用涼血消風(fēng)湯[17]，方中3組藥物，一是涼血之品，為白茅根、玄參、生地，配以解毒之金銀花；二是清氣之品，為生石膏、知母；三是祛風(fēng)之品，為荊芥、防風(fēng)、牛蒡子。本方組成體現(xiàn)了衛(wèi)氣血同治，給病邪以重創(chuàng)的思路。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，清熱解毒類如水牛角、玄參、雙花有殺菌，抑菌，抗感染，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬能力的作用，能清除真皮乳頭水腫，控制感染灶和抑制表皮細(xì)胞過(guò)度增殖。石膏可以使鼠T淋巴細(xì)胞數(shù)增加使巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)。涼血活血類如生地、白茅根等能調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞因子的水平，降低血漿內(nèi)皮素從而抑制血管新生，同時(shí)對(duì)抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與分化，改善微循環(huán)也有一定作用。活血藥與祛風(fēng)藥同用，還有增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能和消炎的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，涼血消風(fēng)湯可以明顯降低血熱型銀屑病患者的PASI評(píng)分，證明其臨床治療效果明顯。與銀屑病患者治療前比較，經(jīng)涼血消風(fēng)湯治療后患者PBMC中NF-κB信號(hào)通路蛋白IKKβ、p50、p65 mRNA表達(dá)水平顯著降低，同樣發(fā)現(xiàn)IKKβ、p-IκBα、p50、p-p65 蛋白表達(dá)水平顯著降低。涼血消風(fēng)湯能夠降低血熱型銀屑病患者PBMC中IKKβ的mRNA及蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制了p-IκBα的表達(dá)水平，使 IκBα 的降解減少，p50、p65、p-p65 的表達(dá)降低，提示NF-κB通路活性降低，IκBα進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA競(jìng)爭(zhēng)p50、p65，又重新結(jié)合為三聚體形式以靜息狀態(tài)回到細(xì)胞質(zhì)中，從而NF-κB通路得到抑制。提示涼血消風(fēng)湯能夠抑制NF-κB通路的活性是其發(fā)揮治療銀屑病作用的機(jī)制之一。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究證實(shí)涼血消風(fēng)湯能夠使銀屑病患者PBMC中NF-κB通路活性降低，從而發(fā)揮其治療銀屑病的機(jī)制。本研究也有不足之處，實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)了NF-κB的核心蛋白。今后筆者將重點(diǎn)研究NF-κB通路的上游蛋白是如何變化的，或者NF-κB通路與哪些信號(hào)通路有相互作用等方面，為銀屑病的治療提供更多的支持。