脫氫樅酸縮水甘油酯接枝羥丙基殼聚糖制備及性能研究

楊欣欣，郭 偉，蔡照勝，黃旭娟，王 婷，丁正青

(1.鹽城工學院 化學化工學院，江蘇 鹽城 224051；2.中國林業(yè)科學研究院 林產(chǎn)化學工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042；3.江蘇大學 化學化工學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000)

殼聚糖(CS)是一種天然的堿性多糖，具有優(yōu)良的生物相容性和可降解性[1-2]。CS結(jié)構(gòu)中引入羥丙基后得到的羥丙基殼聚糖(HPCS)，不但比殼聚糖有更好的水溶性，而且有更好的成膜和吸濕保濕性能，已作為助劑廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領域[3-5]。利用水溶性殼聚糖的親水性還可以制備以其糖鏈為親水基的高分子表面活性劑，如將含松香結(jié)構(gòu)的活性季銨鹽引入到水溶性羧烷基殼聚糖結(jié)構(gòu)中，得到了對綠膿桿菌(P.aeruginosa)和產(chǎn)氣大腸桿菌(E.aerogenes)有良好抑制效果的季銨鹽型高分子表面活性劑[6]。松香是以樹脂酸為主要成分的天然產(chǎn)物[7]，其經(jīng)歧化反應后可轉(zhuǎn)化為以脫氫樅酸為主成分的歧化松香，而通過脫氫樅酸與環(huán)氧氯丙烷反應可得到脫氫樅酸縮水甘油酯(GDHA)[8]。GDHA作為含有親油性菲環(huán)和環(huán)氧結(jié)構(gòu)的松香衍生物，可與含活潑氫的水溶性高分子化合物進行親核加成反應，生成以松香結(jié)構(gòu)為親油基的高分子表面活性劑[9]。徐志剛等[10]通過低相對分子質(zhì)量的CS與GDHA反應，合成了(2-羥基-3-脫氫樅酰氧基)丙基殼低聚糖，而表面活性的研究結(jié)果表明取代度為18%左右的產(chǎn)物在水溶液中的臨界膠束濃度可低至1.50 g/L，能實現(xiàn)的最小表面張力接近52 mN/mm。王婷等[11]以CS經(jīng)羥乙基化改性生成的水溶性羥乙基殼聚糖為基礎原料之一，以脫氫樅基縮水甘油醚為改性劑，制備得到了非離子表面活性劑(2-羥基-3-脫氫樅氧基)丙基羥乙基殼聚糖，其對苯-水乳液的穩(wěn)定性優(yōu)于Tween-60。本研究探討了通過接枝以制備具有親油親水性的GDHA接枝HPCS(GDHA-g-HPCS)的可行性，并考察產(chǎn)物的表面活性、乳化性能及其隨GDHA在HPCS上接枝度改變呈現(xiàn)的變化規(guī)律，同時探索了GDHA-g-HPCS在甘油磷酸鈉(GP)存在下的凝膠化行為，以期為其在乳液穩(wěn)定和藥物負載與控制釋放等領域的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(CS)，脫乙酰度(DD)87.95%，黏均相對分子質(zhì)量(MV)為6.81×105，國藥集團化學試劑有限公司；甘油磷酸鈉(GP，純度≥97%)，生化試劑，蘇州天可貿(mào)易有限公司；脫氫樅酸縮水甘油酯(GDHA，純度≥65.0%)，按文獻[8]自制；蔗糖酯，酸值≤5.0 mg/g，游離糖≤10%，上海龍尼精細化工有限公司；單甘酯，化學純，南京化學試劑有限公司；脂肪醇聚氧乙烯醚，AEO-9，國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑都為分析純。

Nicolet 670型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀，美國Nicolet公司；Bruker AVIII-500型核磁共振(NMR)儀，德國Bruker公司；UV-5500PC型紫外-可見分光光度(UV-Vis)計，上海元析儀器有限公司；FLASH 2000型元素分析儀，美國THERMO公司；JYW-200D型自動表面張力儀，承德市世鵬檢測設備有限公司；Scientz-10N型冷凍干燥機。

1.2 合成路線

在反應過程中，首先是CS糖單元中的羥基或氨基在堿存在下對環(huán)氧丙烷進行親核加成，將羥丙基引入CS糖單元中得到羥丙基殼聚糖(HPCS)；然后HPCS再與GDHA進行親核加成，得到HPCS中引進了疏水性松香結(jié)構(gòu)的脫氫樅酸縮水甘油酯接枝羥丙基殼聚糖(GDHA-g-HPCS)，具體路線見下圖：

1.3 實驗方法

1.3.1HPCS的制備 按類似文獻[12]方法制備羥丙基殼聚糖。取5 g的CS分散于質(zhì)量分數(shù)為30% 的NaOH水溶液中，并在-18 ℃下堿化6 h；將堿化后的CS轉(zhuǎn)入三口反應瓶中，加入150 mL 異丙醇并攪拌分散；由滴液漏斗緩慢滴加23.62 g環(huán)氧丙烷，并在50 ℃水浴加熱下攪拌，反應36 h后，冷卻反應物料至室溫再抽濾；得到的固體用300 mL蒸餾水攪拌分散后，再轉(zhuǎn)移入透析袋于蒸餾水環(huán)境中透析至中性(每6 h換水一次)。透析后的物料經(jīng)減壓蒸發(fā)濃縮除去大部分水后，再用丙酮進行脫水除雜，最后經(jīng)抽濾和冷凍干燥，得到HPCS。

1.3.2GDHA接枝HPCS的制備 按類似文獻[12]方法進行接枝改性。攪拌下將4 g HPCS分散于150 mL二甲基亞砜中，攪拌至其完全溶解后，再加入計量的GDHA和四丁基溴化銨，并在60 ℃下反應8 h；冷卻反應物料至室溫，再加入乙酸乙酯以使接枝產(chǎn)物沉淀析出；對物料進行抽濾，并在攪拌下將得到的固體分散于300 mL蒸餾水中；將分散液轉(zhuǎn)移入透析袋，并于蒸餾水環(huán)境中透析直至其pH值接近7(每6 h換水一次)；對透析后的物料進行減壓濃縮，待大部分水被除去后，再將濃縮液分散于丙酮中以實現(xiàn)脫水除雜，最后經(jīng)抽濾和冷凍干燥，即得到GDHA-g-HPCS。

1.4 表征分析

1.4.1HPCS取代度及GDHA-g-HPCS接枝度的計算 分別測定HPCS和GDHA-g-HPCS的C及N質(zhì)量分數(shù)，再根據(jù)式(1)和式(2)確定HPCS的取代度(DS)和GDHA-g-HPCS的接枝度(DG)。

(1)

(2)

式中：DS—HPCS的取代度，%；DG—GDHA-g-HPCS的接枝度，%；DD—CS的脫乙酰度，%；wC—被分析樣品中C元素的質(zhì)量分數(shù)，%；wN—被分析樣品中N元素的質(zhì)量分數(shù)，%。

1.4.2HPCS及GDHA-g-HPCS的結(jié)構(gòu)表征 用KBr壓片法進行CS、HPCS和GDHA-g-HPCS的FT-IR分析，UV-Vis法研究HPCS和GDHA-g-HPCS的紫外吸收行為，以D2O或D2O/HCl分別為溶劑進行樣品的1H NMR分析。

1.4.3表面活性評價 以初始質(zhì)量濃度(C0)為2.0 g/L的溶液為母液，分別測定經(jīng)雙倍稀釋法形成的系列溶液的表面張力(γ)值，并作出GDHA-g-HPCS溶液γ值與其濃度(C)間的關系曲線，根據(jù)γ-lgC曲線確定GDHA-g-HPCS在水溶液中的臨界膠束濃度(Ccmc)、Ccmc對應的表面張力(γcmc)及最小表面張力(γmin)。

1.4.4乳化能力測定 測定以GDHA-g-HPCS為乳化劑形成的苯-水乳液的穩(wěn)定時間，并根據(jù)得到的乳液穩(wěn)定時間評價GDHA-g-HPCS的乳化能力。

1.4.5GDHA-g-HPCS交聯(lián)物的凝膠形成時間測定 測定由30 g/L的GDHA-g-HPCS(DG為2.81%)溶液和1 000 g/L的甘油磷酸鈉(GP)溶液按不同體積比形成的混合液的凝膠化時間，及形成的凝膠在4 ℃ 環(huán)境中再完全轉(zhuǎn)變?yōu)槿苣z時所需的時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 GDHA-g-HPCS的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1DS和DG值 HPCS及GDHA與HPCS糖單元的物質(zhì)的量比值分別為1、2、4、6和8時所對應的接枝改性產(chǎn)物的DS和DG值見表1。

由表1中結(jié)果可知，隨著GDHA與HPCS物料比的增加，GDHA-g-HPCS的DG呈逐漸增加的趨勢。其原因是GDHA量的增加，使得HPCS結(jié)構(gòu)中的氨基和羥基上的活潑H獲得更多與GDHA結(jié)構(gòu)中環(huán)氧基團反應的機會，從而有效地增加了GDHA對HPCS的接枝率。

表1 不同GDHA與HPCS糖單元物質(zhì)的量比(物料比)接枝產(chǎn)物的DS和DG值Table 1 DS and DG of GDHA-g-HPCSs with different molar ratio of GDHA and sugar unit of HPCS(material rate)

2.1.2FT-IR、UV-vis和1H NMR分析 CS、HPCS和GDHA-g-HPCS Ⅱ的FT-IR譜圖見圖1，HPCS和GDHA-g-HPCSⅡ的紫外-可見吸收光譜及1H NMR圖見圖2和圖3。

a.CS;b.HPCS;c.GDHA-g-HPCSⅡ圖1 FT-IR圖Fig.1 FT-IR spectra

與CS相比，在HPCS的FT-IR圖中，2883 cm-1處有與亞甲基中νC—H相關的吸收峰，1380 cm-1處有與甲基中δC—H相關的吸收峰，說明羥丙基已被成功引入CS結(jié)構(gòu)中；與HPCS相比，GDHA-g-HPCSⅡ的FT-IR圖中，反映甲基和亞甲基存在的νC—H吸收峰強度明顯增加，1253 cm-1處為仲醇或醚結(jié)構(gòu)中C—O伸縮振動吸收峰，1728 cm-1處為酯羰基的伸縮振動吸收峰，說明GDHA被成功接枝到HPCS上。

圖2中，HPCS水溶液在193 nm處有一窄而強的吸收峰，GDHA-g-HPCSⅡ水溶液在206 nm處出現(xiàn)類似峰；此外，GDHA-g-HPCSⅡ水溶液在255 nm處還有與芳環(huán)共軛結(jié)構(gòu)相關的吸收峰。其原因為HPCS通過接枝反應轉(zhuǎn)化為GDHA-g-HPCSⅡ時，有部分氨基與GDHA發(fā)生反應，導致HPCS中N—H的吸收峰部分發(fā)生紅移；而GDHA接枝進入HPCS糖鏈中，其分子結(jié)構(gòu)中脫氫樅基具有的芳環(huán)結(jié)構(gòu)使GDHA-g-HPCSⅡ水溶液在近紫外區(qū)產(chǎn)生吸收。

在HPCS的1H NMR譜圖中，δ4.42處有反映氨基葡萄糖(Glc N)或N-乙酰氨基葡萄糖(Glc NAc)單元C-1上的質(zhì)子峰；δ4.10～3.85處有反映羥基氧取代糖單元(O取代Glc N和Glc NAc單元)C-5上的質(zhì)子峰；δ3.69、3.57和3.45處有反映Glc NAc單元C-3、C-6及糖單元羥基上氧取代羥丙基(O取代羥丙基)中亞甲基、N取代羥丙基中次甲基和Glc NAc單元C-2上的質(zhì)子峰；δ2.71處有反映C-6 上O取代羥丙基中次甲基和Glc N單元C-2上的質(zhì)子峰，δ2.14的峰為羥基質(zhì)子峰，δ1.97處有反映Glc NAc單元乙?；屑谆馁|(zhì)子峰，δ1.08的峰為羥丙基中甲基的質(zhì)子峰。

在GDHA-g-HPCSⅡ的1H NMR圖中，除了有與HPCS結(jié)構(gòu)中質(zhì)子相關的基本峰外，在δ7.22、7.05和6.94處還出現(xiàn)了與脫氫樅基中芳環(huán)上質(zhì)子相關的峰；同時，在δ1.15和1.05處的峰強度明顯增強，δ2.14 處反映羥丙基中羥基質(zhì)子存在的峰強度明顯下降，說明在接枝改性產(chǎn)物中有更多的CH2和CH3，且部分羥丙基中的羥基參與了接枝反應。

2.2 GDHA-g-HPCS的表面活性

GDHA-g-HPCS水溶液的表面張力(γ)與其質(zhì)量濃度(C)的關系曲線見圖4。通過對圖4進行分析，可以得到具有不同接枝度的GDHA-g-HPCS在水溶液中所對應的Ccmc、γcmc和γmin值，結(jié)果見表2。由表2中結(jié)果可知,隨DG的增加，GDHA-g-HPCS在水溶液中形成膠束的能力逐漸增強，但其所能實現(xiàn)的γmin基本在45 mN/m左右。其原因應與GDHA的引入對接枝改性產(chǎn)物的親油性的影響有關:DG值越大，說明有更多GDHA接枝進入HPCS，從而使接枝改性產(chǎn)物有更強的疏水性，并使水溶液中的GDHA-g-HPCS有更強的向溶液表面遷移或在溶液內(nèi)部自組裝形成膠束的推動力；而GDHA-g-HPCS在水溶液中所能實現(xiàn)的γmin與其在溶液表面吸附所能產(chǎn)生的非極性最大值有關。脫氫樅基的剛性及接枝產(chǎn)物的DG最大值僅為10.54%，使得不同DG的GDHA-g-HPCS在水溶液表面達到飽和吸附時所產(chǎn)生的非極性大小幾乎相同，因而γmin相差不大。

圖4 GDHA-g-HPCS水溶液的γ-lgC曲線Fig.4 γ-lgC plots of GDHA-g-HPCS aqueous solution

表2 不同接枝度GDHA-g-HPCS的表面活性參數(shù)Table 2 Surface activity parameters of GDHA-g-HPCS with different DG

2.3 GDHA-g-HPCS的乳化能力

GDHA-g-HPCS(Ⅰ～Ⅴ)、AEO-9、蔗糖酯及單甘酯分別作為乳化劑時形成的苯-水乳液的穩(wěn)定時間分別為2 864、18 063、4 541、3 914、2 612、327、63和155 s。從乳液穩(wěn)定時間可看出，不同接枝度的GDHA-g-HPCS對苯-水乳液的穩(wěn)定性能均優(yōu)于蔗糖酯、單甘脂和AEO-9；GDHA-g-HPCS對苯-水乳液的穩(wěn)定時間隨DG的增大呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，并以DG為2.81%的GDHA-g-HPCSⅡ穩(wěn)定時間最長(18 063 s)。這可能與DG對GDHA-g-HPCS在苯-水界面上形成的吸附層的穩(wěn)定性的影響有關：DG的增大會導致GDHA-g-HPCS具有更強的親油性，有利于其在苯-水界面吸附并有效地降低苯-水界面能；但當DG超過一定值后，接枝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中親水基團與親油基團的分布比例失衡，不利于其按定向楔形理論在苯-水界面形成符合苯乳化所需的規(guī)整吸附層[13]，導致苯-水界面膜強度減弱，從而使乳液的穩(wěn)定性下降。

2.4 GDHA-g-HPCS交聯(lián)物的凝膠形成時間

以殼聚糖為基礎原料的水凝膠已經(jīng)在組織工程、藥物負載等眾多領域獲得應用，尤其是具有溫敏特性的水凝膠[14-15]。本研究按文獻[16～17]的類似方法，用倒瓶法研究了GDHA-g-HPCSⅡ以GP為交聯(lián)劑形成的產(chǎn)物水溶液的凝膠形成過程。實驗結(jié)果表明：由GP和GDHA-g-HPCSⅡ組成的混合水溶液，在低溫時為具有良好流動性的微黃色澄清透明液體，但在37 ℃下恒溫8 min后轉(zhuǎn)化為流動性明顯下降的黏稠的澄清透明物料，37 ℃下恒溫20 min后轉(zhuǎn)化為具有一定掛壁能力且在重力作用下可產(chǎn)生一定形變的半透明凝膠，37 ℃下恒溫26 min后轉(zhuǎn)化為掛壁和形態(tài)保持性能優(yōu)良的不透明凝膠。將已經(jīng)凝膠化的物料再置于4 ℃的環(huán)境中，42 min后，其又重新轉(zhuǎn)化為具有流動性的微黃色澄清透明溶液。這些現(xiàn)象說明，GP在37 ℃下能通過離子交聯(lián)使GDHA-g-HPCSⅡ水溶液形成凝膠[13]，且該凝膠具有溫敏特性。

3 結(jié) 論

3.1通過GDHA對水溶性HPCS的接枝改性，可以得到具有高分子表面活性劑特征的高分子化合物GDHA-g-HPCS,在GDHA對DS為110.60%的HPCS糖單元物質(zhì)的量比值為8時，GDHA在HPCS上的接枝度(DG)為10.54%。

3.2隨著DG從0.72%增加到10.54%，GDHA-g-HPCS在水溶液中的Ccmc值從761.9 mg/L降到189.4 mg/L，而γmin基本維持在45 mN/m左右；GDHA-g-HPCS穩(wěn)定苯-水乳液的時間也隨DG的增大呈先增后減的趨勢，DG為2.81%的GDHA-g-HPCS穩(wěn)定苯-水乳液的時間為18 063 s,優(yōu)于蔗糖酯、單甘脂和AEO-9作為乳化劑時對苯-水乳液的穩(wěn)定時間。

3.3由GP和GDHA-g-HPCS構(gòu)成的混合物水溶液，在37 ℃下經(jīng)26 min后可因GP對GDHA-g-HPCS的離子交聯(lián)作用而完全凝膠化，且形成的凝膠在4 ℃的環(huán)境中保存42 min后又能重新轉(zhuǎn)化為具有流動性的透明溶液，表明由GP和GDHA-g-HPC構(gòu)成的混合水溶液具有可逆溫敏特性的凝膠化行為。