博落回提取物對大豆孢囊線蟲抑制活性研究

李 健，劉友花，解福雙，王 丹，郭志剛

（浙江清華長三角研究院，浙江嘉興 314000）

0 引言

大豆孢囊線蟲病是由大豆孢囊線蟲Heterodera glycines Ichinohe引起的一種世界性大豆病害[1]，農(nóng)業(yè)上主要以優(yōu)化栽培模式、施用化學(xué)藥劑等方式進行防治，但收效低且易引起環(huán)境污染等問題[2]。植物中的天然代謝產(chǎn)物大多具有高效低毒、對環(huán)境友好等特性，將其開發(fā)成殺線蟲農(nóng)藥，對線蟲防治及綠色農(nóng)藥發(fā)展具有重要意義。博落回Macleaya corada（Willd）R.Br屬于罌粟科Papaveraceae博落回屬Macleaya，是一味常用中藥，已有學(xué)者對其提取物殺菌或藥理活性進行試驗[3]。但對其殺蟲活性研究較少，現(xiàn)有殺蟲研究方向主要為鱗翅目[4]、雙翅目的害蟲。

為解決化學(xué)農(nóng)藥所帶來的食品安全性問題，本文對博落回粉末分離提取，將提取物進行追蹤活性實驗，研究博落回提取物對大豆孢囊線蟲幼蟲是否具有致死活性，以求用植物源物質(zhì)對大豆孢囊線蟲進行防控，實現(xiàn)防治大豆胞囊線蟲的目標(biāo)。

1 實驗方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器：柱色譜正相硅膠（200~300目），青島海洋化工廠。HPLC儀器，LC-20A型液相色譜儀（日本島津公司）；MPLC采用Dr Flash-S分離純化系統(tǒng)（蘇州匯通有限公司），色譜柱為ODS（C18，MB100 40~75μm，F(xiàn)uji，日本）。江南NSZ-608T三目體式顯微鏡，南京市鼓樓區(qū)淘微視光學(xué)儀器銷售部。

1.1.2 材料：博落回粗粉購于長沙上禾生物有限公司，由郭志剛教授鑒定，并存放于浙江清華長三角研究院1801標(biāo)本柜。大豆孢囊線蟲（H.glycines），自浙江省嘉興市秀洲區(qū)油車港鎮(zhèn)一大豆種植地分離得到?；移咸焰呔˙otrytis cinerea），取自西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，存放于浙江清華長三角研究院1801標(biāo)本柜。6cm培養(yǎng)皿，24孔板，人工氣候箱，移液槍，PDA培養(yǎng)基，無菌水，乙醇，石油醚，乙酸乙酯，丙酮，乙醇。

1.2 提取和分離

博落回粗粉20 kg，用75%乙醇回流提取2次，得到乙醇提取液。乙醇提取液經(jīng)減壓濃縮后依次用石油醚和乙酸乙酯萃取3~4次，經(jīng)HPLC檢驗石油醚部位提取物和乙酸乙酯部位提取物成分類似，合并記為M。M經(jīng)正向硅膠柱層析，增加梯度洗脫，經(jīng)TLC檢查合并，得到M1~M8共8個部分（M2發(fā)霉，不進行試驗），根據(jù)活性追蹤結(jié)果，將有效部分經(jīng)MPLC分離，TLC板以及HPLC分析驗純，得到二次分離提取物。

1.3 大豆孢囊線蟲培養(yǎng)方法

將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱培養(yǎng)（T=26℃，RH=72%，光周期光：暗=14：10）。菌絲長滿后，取200 μ l線蟲原液加入培養(yǎng)皿中，送回人工氣候箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中的菌絲被線蟲食盡，取2 ml無菌水沖洗培養(yǎng)皿上蓋，將沖洗液吸取至1.5 ml的離心管中，得到線蟲液A，備用。

1.4 大豆孢囊線蟲實驗方法

取1 ml無菌水加入到新的2 ml離心管中，再取10 μ l線蟲液A轉(zhuǎn)移至該離心管中得到稀釋后的線蟲液B，混勻后取50 μ l線蟲液置于顯微鏡下觀察計數(shù)，重復(fù)3次，得到線蟲密度。

利用24孔板進行實驗。每個實驗處理中，線蟲數(shù)50條左右，單個處理含藥量為1 mg/mL。實驗組：50 μ l線蟲液B，10 μ l藥液（濃度100 mg/ml）+1 ml無菌水，單個實際藥物量1 mg，6個重復(fù)（3個重復(fù)用于統(tǒng)計24h效果，6個重復(fù)用于統(tǒng)計48h效果）。對照組：50 μ l線蟲液B，10 μ l丙酮液+1 mL無菌水，3個重復(fù)。

1.5 計數(shù)方法

處理24h，48h后，用NaOH溶液刺激法判斷大豆孢囊線蟲是否死亡并計數(shù)記錄。用Excel軟件計算校正死亡率[5]。24h致死率%=（24h線蟲存活數(shù)-初始線蟲數(shù)）/初始線蟲數(shù)*100%；48h致死率%=（48h線蟲存活數(shù)-初始線蟲數(shù)）/初始線蟲數(shù)*100%。殺線蟲強弱分級[6]：校正死亡率≤10，無活性“－”；10.1%≤校正死亡率≤30%，弱活性“＋”；30.1%≤校正死亡率≤50%，中等活性“＋＋”；50.1%≤校正死亡率≤80%，較強活性“＋＋＋”；80.1%≤校正死亡率，強活性“＋＋＋＋”。

2 博落回提取物對大豆孢囊線蟲的抑制作用

2.1 博落回粗提物對大豆孢囊線蟲的致死效果

根據(jù)博落回提取物對大豆孢囊線蟲的測定結(jié)果（表1）。24h處理后，M1、M3、M5、M6部殺蟲效果較弱。M4、M7、M8部對大豆孢囊線蟲的致死能力較強強，活性強度為“＋＋＋”。48h處理后，M1、M5、M6部致死率有所提升，達50%以上，M3和M8部校正死亡率降低，M4和M7部對致死效果略微提升，活性強度為“＋＋＋”。

表1?博落回粗提物對大豆孢囊線蟲24h及48h致死效果

2.2 博落回二次提純粗提物對大豆孢囊線蟲的致死效果

依據(jù)粗提物的藥效結(jié)果，將M4進行二次提純，共分得10個段，M4-1~M4-10（配置藥劑前，M4-1發(fā)霉，故不進行試驗）。根據(jù)博落回二次純化提取物對大豆孢囊線蟲的測定結(jié)果，具體測定結(jié)果見表2。

表2?二次提純博落回粗提物對大豆孢囊線蟲致死效果

24h處理后，M4-2、M4-3、M4-5~M4-10對大豆胞囊線蟲致死活性較弱，M4-4對大豆胞囊線蟲的致死效果極強，活性強度達“＋＋＋＋”。48h處理后，M4-2、M4-5、M4-8、M4-9致死效果下降，M4-3和M4-6活性不變，M4-7，活性略微提升，活性強度“＋＋＋”，M4-4活性穩(wěn)定，活性強度“＋＋＋＋”。

3 結(jié)語

目前約有102科226屬316種植物被報道具有殺線蟲或抑制線蟲活性[7]，但大多未被開發(fā)成防治藥劑。博落回是一種常見植物，作為殺蟲藥劑來源，具有資源豐富，低毒高效的優(yōu)勢，目前已有農(nóng)藥公司利用博落回提取物開發(fā)出1%血根堿可濕性粉劑（5%博落回生物堿）用于防治菜青蟲等害蟲[8，9]。根據(jù)本研究結(jié)果，可知博落回提取物M4具有較高的殺蟲活性，其二次分離得到的M4系列的提取物中，M4-4具有極強殺蟲活性，且具有長效性。

因此，博落回主莖粉末提取物對大豆孢囊線蟲有較強致死作用，博落回粗提物中存在對大豆胞囊線蟲具有致死活性的物質(zhì)，具有開發(fā)成防治大豆孢囊線蟲的潛力。今后，隨著對博落回提取物進一步分離并對其單體化合物的殺線蟲活性的深入試驗研究，有望將其開發(fā)成一種新型防治大豆孢囊線蟲的生物農(nóng)藥。