PDLIM7?NEDD4?1信號(hào)通路參與骨骼肌萎縮修復(fù)的分子機(jī)制及腎衰營養(yǎng)膠囊干預(yù)作用

曾濰賢 魏連波 劉勇*

營養(yǎng)不良是慢性腎功能衰竭（CRF）的重要并發(fā)癥，可導(dǎo)致遠(yuǎn)期死亡率的增加，是CRF 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。骨骼肌萎縮是CRF 營養(yǎng)不良主要的病理表現(xiàn)和評(píng)估指標(biāo)［1］。但CRF 營養(yǎng)不良骨骼肌萎縮的具體分子機(jī)制尚不清楚。泛素化酶尤其是Nedd4?1 在骨骼肌中的作用機(jī)制如能被闡明，對(duì)解釋多種代謝類疾病發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)有重要意義［2］。PDLIM7 和Nedd4?1 在骨骼肌萎縮中表達(dá)密切相關(guān)，PDLIM7 可能是Nedd4?1 一個(gè)新的特異性底物［3，4］，PDLIM7? Nedd4?1 信號(hào)通路極有可能參與多條與骨骼肌分化密切相關(guān)的信號(hào)通路，進(jìn)而影響骨骼肌分化及增殖［5］。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用相關(guān)分子生物技術(shù)調(diào)節(jié)目標(biāo)基因沉默或過表達(dá)，研究PDLIM7?Nedd4?1 通路在蛋白質(zhì)代謝及骨骼肌損傷?修復(fù)過程的作用，探討CRF 營養(yǎng)不良蛋白分解骨骼肌萎縮的機(jī)制和中藥腎衰營養(yǎng)膠囊治療CRF 營養(yǎng)不良骨骼肌萎縮的療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料（1）動(dòng)物：SPF 級(jí)SD 雄性大鼠20 只（南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物合格證號(hào)：NO.OO48741，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào)：SCXK 2006?0015）。（2）藥物制備：中藥腎衰養(yǎng)真膠囊由黃芪、當(dāng)歸、大黃等藥物組成，廣東省藥材公司提供，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中藥制劑室鑒定，并由南方醫(yī)科大學(xué)中藥新藥實(shí)驗(yàn)室按處方比例提取制成膠囊，每克成藥含生藥5.67 g，成人用量每日成藥15 g。（3）主要試劑：酪蛋白，購自廣東環(huán)凱微生物科技公司；肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、白蛋白（Alb）、血紅蛋白（Hb），購自北京中生生物工程高技術(shù)公司；TUNEL apoptosis assay kit，購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所；PDLIM7 和Nedd4?1 蛋白、兔抗一抗、PVDF 膜、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒，購自美國Cell Signaling Technology 公司；GAPDH 鼠抗一抗，抗鼠二抗、抗兔二抗，購自美國Santa Cruz 公司。

1.2 方法（1）CRF 營養(yǎng)不良大鼠模型及標(biāo)本制備。適應(yīng)性飼養(yǎng)雄性SD 大鼠1 周，以5/6 腎切除的方法制作CRF 模型，參照文獻(xiàn)［6］再用含4%的酪氨酸的飼料喂養(yǎng)，與健康對(duì)照組大鼠相比體重減少20%判斷為CRF 營養(yǎng)不良，將判斷為CRF 營養(yǎng)不良的大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10 只，分別給予腎衰營養(yǎng)膠囊灌胃12 周+低蛋白飼料喂養(yǎng)和以水灌胃+正常飼料喂養(yǎng)。腹腔注射烏拉坦麻醉后，斷頭處死，取血分離血清，取脛骨前肌、腓腸肌和腎組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，分別常規(guī)行HE 病理組織切片和提取骨骼肌組織mRNA、總蛋白備用。（2）骨骼肌組織病理變化分析。取動(dòng)物模型的脛骨前?。═A）組織，在生理位置固定，OCT 包埋，冰凍切片5 μm，以預(yù)冷的丙酮固定；用蛋白終止液（Dako）封閉1 h 后，加入一抗laminin（1∶200），4℃過夜，加入熒光二抗，室溫下避光30 min，洗滌，封片；熒光顯微鏡下觀察，取600 個(gè)以上肌纖維，測量其橫截面積，并計(jì)算面積百分位圖，Image Prosoftware（Silver Spring，MD）分析骨骼肌組織萎縮的程度。（3）PDLIM7 基因的真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。參照PUBMED 文獻(xiàn)及美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取PDLIM7 基因mRNA 的序列全長（NM_005451.4），運(yùn)用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)PDLIM7 基因的特異性引物，合成引物后通過PCR 合成目的基因，分離出帶有目的基因的DNA 片段，通過酶切和連接形成重組DNA 分子，然后將PDLIM7 基因克隆至人慢病毒載體LV5 中，利用第三代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝LV5?PDLIM7 慢病毒顆粒；對(duì)照組為大鼠骨骼肌LV5?PDLIM7空載包裝的慢病毒顆粒。（4）骨骼肌MSC 培養(yǎng)與分化。SD大鼠斷頭處死，浸泡在75%乙醇中消毒15 min，無菌條件下分離大鼠雙后肢腓腸肌，用手術(shù)剪將肌肉剪碎至1 mm3，轉(zhuǎn)移至離心管中，再用Hank's 液洗3 次，靜置1 min 后棄去上層液體及漂浮組織。向離心管中加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴鍋中消化20 min，加入生長培養(yǎng)基終止消化。再次離心后細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，反復(fù)吹打后收集濾液，1000 r/min 離心10 min，接種至多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，培養(yǎng)至第5-6 d 貼壁的細(xì)胞即為MSC，倒置顯微鏡下觀察。細(xì)胞生長到70%融合后，用胰酶進(jìn)行消化，以1∶2 的比例進(jìn)行傳代，每日換液1 次。上述細(xì)胞培養(yǎng)液在37℃、5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)。待其密度達(dá)到80%時(shí)，再替換為2%馬血清誘導(dǎo)，4-5 d 可分化成肌管。（5）Western Blotting 檢測PDLIM7?Nedd4?1 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。包括PDLIM7?Nedd4?1通路關(guān)鍵蛋白PDLIM7；取對(duì)數(shù)期的兩組MSC 和C2C12 重組穩(wěn)定株細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)后，取等量細(xì)胞（10×105個(gè)細(xì)胞/孔）加入等量冰預(yù)冷的組織總蛋白裂解緩沖液（細(xì)胞總蛋白的制備為消化離心收集細(xì)胞后加入蛋白裂解緩沖液）?？偟鞍缀繙y定采用Bradford 法，以保證各組樣品上樣量相同。待測蛋白進(jìn)行變性（100℃，5 min）后，行SDS?PAGE 分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，4℃孵育過夜，按一定稀釋比例加入通路關(guān)鍵蛋白Nedd4?1、PDLIM7 等抗體，室溫孵育2 h，TBST 緩沖液漂洗后，再與相同來源的二抗室溫下孵育1 h，每次孵育之間均應(yīng)用TBST 緩沖液漂洗3 次，每次5 min。然后再與化學(xué)發(fā)光劑ECLA 液和B 液1ml 混合反應(yīng)1 min，Image Station 2000R 圖像工作站取像。（6）CCK?8 法檢測細(xì)胞增殖。取對(duì)數(shù)生長期的MSC 和C2C12 兩組重組穩(wěn)定株細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果按5×104/ml 作傳代培養(yǎng)接種細(xì)胞于96 孔板中，共接種21 個(gè)孔。24 h 后開始計(jì)測3 個(gè)孔的細(xì)胞的CCK?8 值（每個(gè)孔加入含有10%的CCK?8 的培養(yǎng)基），根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的不同，2-4 h 后在酶標(biāo)儀上讀取OD 值。以后每隔24 h 計(jì)數(shù)一次，每次取3 個(gè)孔，分別進(jìn)行測試。計(jì)算平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)7 d，根據(jù)OD值作圖。（7）流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布。取對(duì)數(shù)期的兩組MSC 和C2C12 重組穩(wěn)定株細(xì)胞，常規(guī)消化計(jì)數(shù)后，取等量細(xì)胞（4×105個(gè)細(xì)胞/孔）接種于六孔板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約為80%-90%時(shí)，常規(guī)消化各組細(xì)胞，用PBS 洗滌細(xì)胞一次（離心2000 rpm，5 min），收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為106/ml，制備的單細(xì)胞懸液，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定，4℃保存，染色前用PBS 洗去固定液；細(xì)胞懸液用200 目篩網(wǎng)過濾一次；加100 μl RNase A 37℃水浴30 min；再加入400 μl PI 染色混勻，4℃避光30 min；上機(jī)檢測記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，取各期細(xì)胞所占比例平均數(shù)，繪制細(xì)胞周期圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用Shapiro?Wilk 檢驗(yàn)正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的兩樣本均數(shù)間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠脛前肌橫截面積比較實(shí)驗(yàn)組脛骨前肌的橫截面積明顯多于對(duì)照組［（485.8±20.9）vs（749.7±23.6），P＜0.01）］，提示腎衰營養(yǎng)膠囊能增加脛前肌橫截面積，具有改善CRF 肌萎縮的作用。

2.2 PDLIM7 基因的真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建大鼠骨骼肌C2C12 細(xì)胞熒光免疫（×200），對(duì)照組GFP 熒光蛋白表達(dá)提示慢病毒顆粒包裝成功（圖1），LV5?PDLIM7 的GFP 熒光表達(dá)良好提示慢病毒顆粒包裝成功（圖2）。

圖1、2 PDLIM7 基因的真核表達(dá)

2.3 兩組骨骼肌PDLIM7 和NEDD4-1 蛋白表達(dá)見表1。

表1 兩組骨骼肌PDLIM7 和NEDD4?1 蛋白的表達(dá)量比較（n=10，±s）

表1 兩組骨骼肌PDLIM7 和NEDD4?1 蛋白的表達(dá)量比較（n=10，±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01。

組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組PDLIM7 0.241±0.031 0.439±0.024*NEDD4?1 0.591±0.021 0.352±0.008*

2.4 兩組C2C12 細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期分布比較實(shí)驗(yàn)組的OD 明高于對(duì)照組（1.09±0.03vs1.01±0.02，P＜0.05），提示腎衰營養(yǎng)粉膠囊顯著促進(jìn)C2C12 細(xì)胞的增殖。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期中G0/G1 期明顯少于對(duì)照組（47.72±3.90%vs51.72±4.10%，P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期中S 期明顯多于對(duì)照組（26.94±3.48%vs12.50±1.66%，P＜0.05）；兩組G2+M 占細(xì)胞周期比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（18.2±2.2%vs20.3± 2.5%，P＞0.05）。

3 討 論

CRF 營養(yǎng)不良的機(jī)制還不太清楚。過去研究認(rèn)為與酸中毒和微炎癥狀態(tài)導(dǎo)致蛋白質(zhì)高分解有關(guān)，已知UPS通路在蛋白質(zhì)分解中起重要作用，但確切機(jī)制還不太清楚。在骨骼肌萎縮的過程中，PDLIM7 可能作為Nedd4?1的底物被降解，以致其表達(dá)量明顯下調(diào)，骨骼肌分化受阻，導(dǎo)致骨骼肌萎縮的發(fā)生，但確切的機(jī)制尚不清楚。CRF 營養(yǎng)不良骨骼肌萎縮涉及多條信號(hào)通路，不同信號(hào)通路間的相互作用錯(cuò)綜復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中核糖體蛋白表達(dá)量明顯增強(qiáng)，PDLIM7 蛋白表達(dá)量增高，NEDD4?1 表達(dá)量下調(diào)，利用LV5 慢病毒包裝系統(tǒng)進(jìn)行對(duì)照組和高表達(dá)PDLIM7 慢病毒顆粒的包裝，GFP 熒光蛋白表達(dá)良好；實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)PDLIM7 后MSC 和C2C12 的增殖速度增快；實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)PDLIM7 基因后MSC 和C2C12細(xì)胞S 期細(xì)胞所占比例明顯增多。因此，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌萎縮程度明顯減輕［7］。分離其骨骼肌并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)測序結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組大鼠骨骼肌中PDLIM7 蛋白表達(dá)量明顯上調(diào)，而Nedd4?1 蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)，而蛋白互作網(wǎng)絡(luò)提示，Nedd4?1 與PDLIM7 蛋白可能存在密切的相互作用關(guān)系。鑒于PDLIM7 在骨骼肌分化過程中的重要作用及Nedd4?1 作為一種重要的E3 泛素連接酶，推測在骨骼肌萎縮的過程中，PDLIM7 可能作為Nedd4?1 的底物被降解，在CRF 營養(yǎng)不良狀態(tài)下，某些病理因素激活UPS，使Nedd4?1 表達(dá)水平上調(diào)，其特異性底物PDLIM7 降解增加，表達(dá)量明顯下調(diào)，骨骼肌分化受阻，從而導(dǎo)致骨骼肌萎縮的發(fā)生。

基于PDLIM7?Nedd4?1 信號(hào)通路研究腎衰營養(yǎng)膠囊對(duì)CRF 營養(yǎng)不良骨骼肌萎縮的作用分子機(jī)制。我國尚無自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)治療CRF 營養(yǎng)不良的特異性藥物，中醫(yī)藥在臨床上治療CRF 營養(yǎng)不良療效顯著，但其機(jī)理不明，也無治療CRF 營養(yǎng)不良的中藥新藥問世。如腎衰營養(yǎng)膠囊治療作用機(jī)制能被闡明，對(duì)于中醫(yī)藥贏得社會(huì)及國際認(rèn)可意義重大。