小分子藥物T-5224 對(duì)多種小鼠銀屑病模型作用效果的研究

王麗，趙銳，張秋芳

1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255000；2.天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457

銀屑病又名牛皮癬，該疾病是一種臨床上比較常見(jiàn)的皮膚病，具有發(fā)病慢、病程久、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)［1］。臨床表現(xiàn)主要為起初患者局部皮膚上出現(xiàn)少量的紅色丘疹或斑丘疹，之后丘疹的分布范圍逐漸擴(kuò)大，甚至擴(kuò)大到包括軀干、四肢、膝蓋、頭皮等全身各處皮膚［2］。

目前T-5224（見(jiàn)圖1）正作為一種治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物在美國(guó)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。該化合物是基于X-射線晶體結(jié)構(gòu)并借助藥效團(tuán)3D 模型（見(jiàn)圖2），設(shè)計(jì)合成出的c-fos/AP-1 的體內(nèi)抑制劑［3］。該藥物通過(guò)對(duì)c-Fos/AP-1 與DNA 結(jié)合活性的抑制，從而對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性產(chǎn)生影響并可有效降低機(jī)體內(nèi)多種炎癥因子的含量［4-6］。通過(guò)探討T-5224 對(duì)膠原誘導(dǎo)的Ⅱ型關(guān)節(jié)炎小鼠模型及對(duì)體外滑膜細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的作用發(fā)現(xiàn)T-5224 可以有效降低血清、關(guān)節(jié)及細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白的含量［7］；也能夠降低急性肝損傷模型小鼠血清中腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1β、白介素6（IL-6）的含量而促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子白介素10（IL-10）的釋放［8］。有研究發(fā)現(xiàn)由于Cx31 蛋白缺失導(dǎo)致銀屑病發(fā)生的分子機(jī)制［9］，而T-5224 可以通過(guò)選擇性抑制c-Fos/c-Jun 信號(hào)通路而增加Cx31 蛋白的表達(dá)，可有效減輕銀屑病的病癥，而達(dá)到治療該病的目的。

圖1 T-5224 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 AP-1 小分子抑制劑的藥效團(tuán)3D模型

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康BALB/C 小鼠152 只，雌性，8～11 周齡，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：NO.0006548。將小鼠飼養(yǎng)在屏障環(huán)境中，給予正常小鼠飼料與滅菌水飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器

T-5224（由天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院藥物合成組提供，純度：98.9%）；麗科杰咪喹莫特乳膏（湖北科益藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：120710）；醫(yī)用白凡士林（南京特納斯生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：20180130）；陽(yáng)性對(duì)照藥物方希阿維A膠囊（重慶華邦制藥有限公司，規(guī)格：10 mg/粒，生產(chǎn)批號(hào)：2018028）；己烯雌酚（廣州市漢普醫(yī)藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：121006，純度＞99.2%）；小鼠TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒（柏卡生物有限公司，批號(hào)：20130201A）；小鼠白介素-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒（柏卡生物有限公司，批號(hào)：20130212A）。

全自動(dòng)全封閉組織脫水機(jī)（型號(hào)：Leica ASP200S）；石蠟包埋機(jī)（型號(hào)：Leica EG1150H）；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)：Leica RM2245）；半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)：Leica RM2245）；全自動(dòng)染色機(jī)（型號(hào)：Leica Autostainer XL）；全自動(dòng)玻片封片機(jī)（型號(hào)：Leica CV5030）。

1.3 咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型的建立

將去毛后的小鼠根據(jù)體質(zhì)量的不同進(jìn)行隨機(jī)分組，分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥阿維A組、陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)藥物T-5224（30 mg/kg）低劑量組、實(shí)驗(yàn)藥物T-5224（300 mg/kg）高劑量組，共6 組，每組8 只。除空白對(duì)照組外，用玻璃棒將5%咪哇莫特乳膏涂抹于其他各組小鼠背部，涂抹劑量為62.5 mg，1 次/d，連續(xù)8 d。在建模的同時(shí)對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行分別給藥，給藥的方式為灌胃?？瞻讓?duì)照組、模型組小鼠給予0.9%生理鹽水；陰性對(duì)照組給予1%聚維酮（PVP30）溶液；陽(yáng)性對(duì)照組給予阿維A 混懸液；T-5224 低、高劑量組分別給予T-5224（30 mg/kg）、T-5224（300 mg/kg）。給藥的容積均為10 mL/kg 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)給藥8 d。

1.4 小鼠皮損PASI 評(píng)分

銀屑病樣皮損面積和疾病嚴(yán)重程度（PASI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)自提出以來(lái)一直作為評(píng)價(jià)某種藥物對(duì)銀屑病治療效果的金標(biāo)準(zhǔn)被廣泛應(yīng)用［10］。各部分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)紅斑由無(wú)到有，顏色由淺到深，斑塊由大到小，得分為0～4 分；鱗屑從無(wú)到有、從小到大、從局部覆蓋到全部覆蓋，得分為0～4 分；根據(jù)斑塊從無(wú)到有，從薄到厚，從微隆起到明顯隆起，得分為0～4 分。根據(jù)皮膚受損部位的嚴(yán)重情況相應(yīng)的打分。將以上各個(gè)指標(biāo)的得分進(jìn)行加權(quán)，得到最終的PASI 評(píng)分。寫(xiě)出PASI 總分算法。

1.5 小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的測(cè)定

通過(guò)小鼠眼眶后靜脈采血方式，每只小鼠采血0.5 mL，使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后離心分離得血清。操作步驟分別按照小鼠TNF-α、IL-10 ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的OD 值。在Excel 工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD 值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

1.6 制作組織切片、HE 染色、小鼠皮膚組織學(xué)Baker 評(píng)分及表皮厚度測(cè)量

取材及固定：采用頸椎脫位的方法將小鼠處死，分別從上、中、下三個(gè)部位取其背部皮膚，大小約為1.5 cm×0.5 cm，并將剪取的組織立即置于10%的甲醛溶液中固定處理，固定的時(shí)間約24 h。制成石蠟切片利用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片觀察。

在400 倍視野下進(jìn)行組織學(xué)觀察，并拍攝圖片。從每張組織切片中隨機(jī)選取3 個(gè)較清晰視野作為Baker 組織學(xué)評(píng)分的目標(biāo)。分別取每張切片的上、中、下三部分，每部分選擇六個(gè)點(diǎn)測(cè)量表皮層的垂直厚度。

1.7 傳統(tǒng)天然小鼠銀屑病模型的建立

1.7.1 小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂增快模型 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥阿維A 組、實(shí)驗(yàn)藥物T-5224 高劑量（30 mg/kg）組、T-5224 中劑量（10 mg/kg）組、T-5224低劑量（1 mg/kg）組，共7 組，每組8 只?？瞻捉M注射生理鹽水除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠進(jìn)行腹腔注射己烯雌酚，劑量為0.2 mg/只，給藥頻率為1 次/d，給藥時(shí)間連續(xù)3 d，使小鼠均處于動(dòng)情期，3 d 后進(jìn)行隔天注射，注射劑量不變，直到第12 天。除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠從第4 天起分別進(jìn)行灌胃給藥，分別給予生理鹽水、1%PVP 溶液、阿維A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），給藥容積10 mL/kg 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)8 d。在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的第12 天，所有小鼠均采取腹腔注射的方式，注射秋水仙堿，劑量為2 mg/kg。6 h 后采用脫椎的方式，將所有小鼠處死，立即取出小鼠陰道組織，進(jìn)行石蠟切片的制作。在光學(xué)顯微鏡下，計(jì)數(shù)有絲分裂指數(shù)。

1.7.2 計(jì)數(shù)小鼠尾鱗片表皮顆粒層 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照藥阿維A組及實(shí)驗(yàn)藥物T-5224 高劑量（30 mg/kg）組、T-5224中劑量（10 mg/kg）組、T-5224 低劑量（1 mg/kg）組，共6 組，每組8 只。除空白對(duì)照組給予生理鹽水外，其他各組小鼠采取灌胃給藥的方式，分別給予1% PVP 溶液、阿維A（10 mg/kg）、T-5224（30 mg/kg）、T-5224（10 mg/kg）、T-5224（1 mg/kg），給藥容積10 mL/kg 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)21 d。在第22天采用頸椎脫位方式將小鼠處死，取尾部皮膚，進(jìn)行石蠟切片的制作，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)各組每只小鼠尾部表皮100 個(gè)鱗片中含有顆粒層的數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間分析采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 T-5224 對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型的影響

2.1.1 T-5224 有效抑制小鼠銀屑病樣炎癥反應(yīng) 與空白對(duì)照組相比，其他各組在涂抹咪喹莫特2 d 左右，小鼠皮膚均開(kāi)始表現(xiàn)出鱗屑、紅斑及增厚浸潤(rùn)。但陽(yáng)性藥物在給藥的前3 d，均可有效控制皮損程度，將PASI 評(píng)分控制在較低的水平。但隨著涂抹咪喹莫特建模時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性藥物對(duì)皮損的抑制程度減弱。在建模的5～7 d 除空白對(duì)照組外的各組小鼠皮損表現(xiàn)最為嚴(yán)重，紅斑面積增大、鱗屑增多、浸潤(rùn)程度嚴(yán)重，皮膚受損情況類似于銀屑病病癥。但是受試藥物T-5224 低劑量組、高劑量組均可將PASI 皮損評(píng)分控制在較低的水平。與陰性對(duì)照組、溶劑組、甚至陽(yáng)性藥物組相比皮損癥狀較輕，皮膚相對(duì)較光滑、鱗屑較少、紅斑及浸潤(rùn)程度也相對(duì)較輕，且T-5224 低劑量組皮損的治療情況較高劑量組明顯，見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 各組小鼠在建模并給藥8 d后背部皮膚情況

圖4 各組小鼠紅斑、鱗片、皮損厚度及PASI評(píng)分情況

2.1.2 T-5224 對(duì)模型小鼠背部皮膚病理組織學(xué)影響 從病理學(xué)切片圖可以看出，模型組與空白對(duì)照組相比表皮層增厚，透明細(xì)胞層與顆粒細(xì)胞比例增大，真皮炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以淋巴細(xì)胞為主，汗腺萎縮，汗毛孔增大，局部可見(jiàn)炎性滲出，皮下毛細(xì)血管充血，脂肪細(xì)胞萎縮，表皮纖維?；?。陰性對(duì)照組小鼠背部皮膚組織切片情況類似模型組；陽(yáng)性藥物組有炎性滲出物，角化程度略有減輕，透明細(xì)胞比例減少，顆粒細(xì)胞、基底細(xì)胞增多、增大且胞核變淺，表皮外層偶可見(jiàn)分裂相，汗毛孔基質(zhì)細(xì)胞增生旺盛，汗腺異常，脂肪細(xì)胞萎縮同模型組，毛細(xì)血管充血情況有所改善，淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)程度較模型組要低。T-5224 低劑量組表皮層變薄，角化程度稍見(jiàn)好轉(zhuǎn)，透明細(xì)胞數(shù)減少，基底細(xì)胞增殖程度下降，汗腺可見(jiàn)較明顯的再生，脂肪層有所增厚，毛細(xì)血管浸潤(rùn)程度也明顯減弱，仍存在少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；T-5224 高劑量組，表皮略呈現(xiàn)剝落壞死，脂肪層嚴(yán)重萎縮，皮下纖維組織可見(jiàn)壞死癥，未見(jiàn)基底細(xì)胞增殖，也可見(jiàn)毛細(xì)血管充血，見(jiàn)圖5。通過(guò)小鼠皮膚組織學(xué)Baker 評(píng)分統(tǒng)計(jì)30 mg/kg T-5224 組小鼠模型組小鼠相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。病理切片結(jié)果可部分反應(yīng)，低劑量的T-5224 具有抑制上皮細(xì)胞角化、抗炎、促使表皮及真皮層組織結(jié)構(gòu)正常化等特點(diǎn)，但藥物過(guò)量可能會(huì)引起全身系統(tǒng)反應(yīng)。

圖5 各組小鼠背部皮膚組織切片（HE×400）

2.1.3 T-5224 對(duì)模型小鼠血清中TNF-α、IL-10 含量的影響 研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)涂抹咪喹莫特誘導(dǎo)建模后，模型組小鼠血清中TNF-α 的含量明顯較空白對(duì)照組升高，低劑量（30 mg/kg）、高劑量（300 mg/kg）及陽(yáng)性藥物阿維A 均可有效降低銀屑病模型小鼠血清中TNF-α 的含量，同時(shí)均可有效升高銀屑病模型小鼠血清中IL-10 的含量（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 Baker 評(píng)分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的濃度（）

表1 Baker 評(píng)分及小鼠血清中TNF-α和IL-10的濃度（）

注：與模型組比較，aP＜0.05。

2.2 T-5224 對(duì)傳統(tǒng)小鼠銀屑病模型的影響

2.2.1 T-5224 對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的影響通過(guò)不同濃度的T-5224 對(duì)雌激素刺激下的小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂抑制情況的研究發(fā)現(xiàn)，低劑量（1 mg/kg）的T-5224 對(duì)小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂的抑制情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)T-5224 濃度達(dá)到10 mg/kg 時(shí)，則對(duì)有絲分裂指數(shù)產(chǎn)生較明顯影響，當(dāng)T-5224 濃度達(dá)到30 mg/kg 時(shí)，對(duì)有絲分裂指數(shù)的影響最明顯，且與中劑量組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與陽(yáng)性藥物組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明T-5224 的給藥濃度達(dá)到30 mg/kg 時(shí)，對(duì)細(xì)胞的過(guò)度增殖抑制作用最強(qiáng)，可有效針對(duì)銀屑病角質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增殖這一特點(diǎn)，見(jiàn)圖6，表2。2.2.2 T-5224 對(duì)小鼠尾鱗片顆粒層細(xì)胞形成數(shù)的影響 給予不同藥物21 d 后，通過(guò)對(duì)各組小鼠尾鱗片顆粒層細(xì)胞形成數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組小鼠尾鱗片顆粒層細(xì)胞數(shù)均較少，且兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。陽(yáng)性對(duì)照藥物組，T-5224 低、中、高劑量組顆粒層細(xì)胞數(shù)均呈現(xiàn)不同程度的增加，且與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明陽(yáng)性藥物組顆粒層細(xì)胞數(shù)目最多（圖7，表2）。隨著T-5224 濃度的升高促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)；當(dāng)T-5224 達(dá)到較高劑量（30 mg/kg）時(shí)，其促進(jìn)作用與陽(yáng)性藥物相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 各組小鼠陰道組織切片（HE×1000）

圖7 各組小鼠尾部皮膚組織切片（HE×1000）

表2 各組小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)及尾鱗片顆粒層形成數(shù)（）

表2 各組小鼠陰道上皮細(xì)胞有絲分裂指數(shù)及尾鱗片顆粒層形成數(shù)（）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與空白對(duì)照組比較，bP＜0.05。

3 討論

由于銀屑病只可在人類與靈長(zhǎng)類動(dòng)物中自發(fā)形成，所以缺少銀屑病相關(guān)模型，從而阻礙了對(duì)該病發(fā)病機(jī)制與治療的研究進(jìn)展［11］。在選擇合適的受試動(dòng)物的基礎(chǔ)上，成功建立銀屑病模型，是研究銀屑病機(jī)制與治療的關(guān)鍵。雖然小鼠皮膚與人的皮膚存在一定的差異，如小鼠表皮厚度較薄、皮膚毛囊數(shù)量較多、真皮較薄，不利于瘢痕的形成等［12］。但是，近些年研究發(fā)現(xiàn)，利用小鼠作為受試動(dòng)物建立的銀屑病模型可以較準(zhǔn)確而全面地反映銀屑病的發(fā)病特征。本研究選用了咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型與傳統(tǒng)天然模型相結(jié)合的方式探討了T-5224 對(duì)銀屑病的治療作用和量效關(guān)系，為T(mén)-5224用于銀屑病的治療提供了理論基礎(chǔ)。將來(lái)可以運(yùn)用免疫組化、細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)并結(jié)合部分生化指標(biāo)及多種銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)［13-15］，使該研究進(jìn)一步深化。