兩步酶解法制備小龍蝦副產(chǎn)物多肽及其抗氧化性研究

徐文思，楊祺福，張夢媛，李柏花，莫亞瓊，邵立業(yè)，楊品紅，韓慶

（湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點實驗室，水生生物資源保育與利用湖南省高?？萍紕?chuàng)新團隊，水產(chǎn)養(yǎng)殖與加工常德市重點創(chuàng)新團隊，湖南 常德 415000）

小龍蝦副產(chǎn)物主要指對原料蝦進行加工利用后所剩下的物質(zhì)，包括蝦頭、蝦殼、蝦足以及低值小蝦部分[1]。這些副產(chǎn)物約占原料的85%，其蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)以及活性成分蝦青素、蝦紅素和甲殼素等含量豐富，其中以蛋白質(zhì)的含量最高，約占副產(chǎn)物的36%～40%[1-3]；蝦頭殼粗蛋白中必需氨基酸占45.33%，與牛奶中必需氨基酸（46.59%）和酪蛋白中必需氨基酸（46.14%）極為接近[4-6]。蝦副產(chǎn)物蛋白作為食源性蛋白是品質(zhì)較高的動物性蛋白，其含有的功能性多肽安全性高、對人體無毒副作用、易被人體吸收、含量較高且具有較高的抗氧化活性和抑菌性能，可以用于制備功能性食品[2，5]。因此這些食源性多肽受到廣泛關注。

由于鮮食小龍蝦的龐大市場需求，同時現(xiàn)有小龍蝦加工均處于粗加工階段，大量的小龍蝦副產(chǎn)物被棄置，造成了環(huán)境污染和資源浪費，小龍蝦副產(chǎn)物資源亟需得到開發(fā)與高值化利用。從蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)物中提取的粗蛋白，再酶解制備活性多肽為解決這一問題提供了有效途徑[6]。目前關于酶解法制備小龍蝦副產(chǎn)物活性肽的研究多集中于復合酶解或超聲輔助酶解，仍存在水解度低，活性肽制備不完全的問題[6]。本研究采用兩步酶解法制備小龍蝦副產(chǎn)物多肽，對其抗氧化性進行初步評價與分析，對比二次酶解產(chǎn)物與一次酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力，本研究可作為產(chǎn)業(yè)化的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦：市售。堿性蛋白酶（內(nèi)切酶，酶比活力為500U/mg）、中性蛋白酶（內(nèi)切酶，酶比活力為150U/mg）、胰蛋白酶（內(nèi)切酶，酶比活力為250 U/mg）、木瓜蛋白酶（內(nèi)切酶，酶比活力為200 U/mg）：河南仰韶生化工程有限公司；2，2’-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]試劑盒：上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒：北京酷來搏科技有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫磁力攪拌器（EPFO-984TA7CHSEUA）：上海安譜實驗科技股份有限公司；水分快速測定儀（DSH-50-5）：上海越平科學儀器有限公司；自動凱氏定氮儀（KT8400）：福斯分析儀器有限公司；粗脂肪測定儀（SZF-06A）：上海昕瑞儀器儀表有限公司；酶標儀（Multiskan FC）：上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；超高效液相色譜儀（AcQuity H class）：美國Waters有限公司；蛋白純化系統(tǒng)（AKTA prime Plus）：GE Healthcare Life Sciences China；凝膠成像儀（伯樂BIO-RAD Gel Doc XR）：上海土森視覺科技有限公司。

1.3 原料預處理

小龍蝦除蝦肉，以蝦殼為主的副產(chǎn)物進行清洗冷凍，置于冷凍干燥機中進行冷凍干燥48 h，干燥后取出粉碎，過60目篩備用。

1.4 蝦副產(chǎn)物基本成分測定

水分含量：采用水分快速測定儀；灰分含量：采用GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》中的干法灰化法；脂肪含量：采用GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中索氏提取法；粗蛋白含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法。

1.5 酶解工藝

1.5.1 酶的篩選

針對胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶進行初步篩選，分別向小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉中加相同質(zhì)量的不同蛋白酶，以水作為反應媒介，在各自最適溫度和pH值下酶解（提取條件見表1），以蛋白得率作為檢測指標，比較各酶對粗蛋白的提取能力。

表1 不同蛋白酶對小龍蝦副產(chǎn)物蛋白的提取條件Table 1 Extraction conditions of the protein from crayfish byproducts by different proteases

1.5.2 單因素與正交試驗

1.5.2.1 酶解時間對蛋白得率的影響

稱取小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉，以水作為反應媒介，調(diào)整pH值和溫度，加入蛋白酶后，分別酶解2、3、4、5h，測定蛋白得率。

1.5.2.2 酶用量對蛋白得率的影響

稱取小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉，以水作為反應媒介，調(diào)整pH值和溫度，分別加入1%、2%、3%、4%蛋白酶后進行酶解，測定蛋白得率。

1.5.2.3 料液比對蛋白得率的影響

稱取小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉，以水作為反應媒介，原料與水的比例為 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL），調(diào)整pH值和溫度后進行酶解，測定蛋白得率。

1.5.2.4 一次酶解正交試驗

根據(jù)單因素結(jié)果，選用L9（33）的正交試驗表（表2），以蛋白得率為檢測指標，研究較優(yōu)蛋白酶的酶用量（A）、酶解時間（B）及料液比（C）對小龍蝦副產(chǎn)物中蛋白得率的影響。

表2 小龍蝦副產(chǎn)物蛋白制備正交試驗設計Table 2 Orthogonal array design for the preparation of the protein from crayfish by-products

1.5.2.5 二次酶解正交試驗

選取L9（33）的正交試驗表（表3），以蛋白水解度為檢測指標，研究蛋白酶的酶用量（A）、酶解時間（B）及料液比（C）對小龍蝦副產(chǎn)物蛋白水解度的影響。

表3 小龍蝦副產(chǎn)物蛋白水解正交試驗設計Table 3 Orthogonal array design for the hydrolysis of the protein from crayfish by-products

1.6 分析方法

1.6.1 蛋白得率

蛋白得率按下式計算。

式中：M1為副產(chǎn)物凍干粉酶解產(chǎn)物中粗蛋白含量，g/g；M2為副產(chǎn)物凍干粉中粗蛋白含量，g/g。

1.6.2 蛋白水解度測定

酶解液和10%三氯乙酸溶液混勻，靜置30 min，離心，取全部上清液，考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。水解度按下式計算。

1.6.3 總氨基酸組成分析

取0.025 g樣品，置于5 mL安醅瓶中，加3 mL 6 mol/L鹽酸或40%氫氧化鈉溶液，酒精噴燈拉絲封口，110℃水解24 h，樣品中蛋白全部水解成氨基酸殘基后，取過膜后的上清液3 mL按照Elite－AAK氨基酸分析系統(tǒng)的衍生方法進行氨基酸衍生化，高效液相色譜法測定氨基酸含量。色譜分析條件：Elite－AAK氨基酸分析色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫27℃，進樣體積10μL，流動相流速1.2 mL/min，檢測波長360 nm。

1.6.4 總抗氧化活性

總抗氧化能力參照ABTS試劑盒說明。以Trolox作為標準品進行總抗氧化能力測定，以Trolox為標樣（0.15 mmol/L～1.2 mmol/L）繪制標準曲線。待測樣品的總抗氧化能力用Trolox當量抗氧化能力（Trolox equivalent antioxidant capacity，TEAC） 的 物 質(zhì) 的 量（mmol Trolox/L）來表示。

1.6.5 Tricine-SDS-PAGE分析

配制小龍蝦副產(chǎn)物多肽干粉溶液，按體積比1∶1與2×Tricine多肽上樣緩沖液混合，100℃煮沸3min～5min，冷卻后上樣。其他溶液的配制及具體操作參照Tricine-SDS-PAGE電泳試劑盒說明書。

1.6.6 柱層析純化分離酶解液

采用AKTA prime Plus蛋白純化系統(tǒng)分離小龍蝦副產(chǎn)物多肽抗氧化組分。根據(jù)文獻[7]方法改良，使用0.22 μm微膜過濾樣品后通過注射器注射至純化系統(tǒng)，1 mL小龍蝦副產(chǎn)物多肽樣品液進入AKTA蛋白純化系統(tǒng)，經(jīng)過含有Toyopearl HW-40S填料的INLK1660M肽柱。用H2O以0.5 mL/min的流速平衡洗脫，在4℃280 nm波長下檢查洗脫情況，洗脫液組分自動收集到10 mL試管中，每管5 mL。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，試驗結(jié)果以平均值±標準差來表示。使用Excel 2016軟件作圖。使用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），不同字母表示具有顯著差異（p<0.05），**表示具有極顯著差異（p<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 小龍蝦副產(chǎn)物基本營養(yǎng)成分分析

小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉中基本營養(yǎng)成分測定結(jié)果如表4所示。

表4 小龍蝦副產(chǎn)物一般營養(yǎng)成分Table 4 General nutrients composition in crayfish by-products%

由表4可知，小龍蝦副產(chǎn)物凍干粉的水分、灰分、脂肪、粗蛋白含量分別為（6.46±0.11）%、（60.34±0.59）%、（0.01±0.00）%、（18.70±0.65）%，可見，小龍蝦副產(chǎn)物是一種高蛋白低脂肪產(chǎn)品，較高的灰分含量可能是因其含有豐富的甲殼素、鈣等礦物質(zhì)。小龍蝦副產(chǎn)物是一種可以開發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)源。

2.2 不同蛋白酶對蛋白得率的影響

針對目前常用的幾種蛋白酶，胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及堿性蛋白酶對小龍蝦副產(chǎn)物進行水解，提取粗蛋白，不同蛋白酶對蛋白得率的影響見圖1。

圖1 不同蛋白酶對蛋白得率的影響Fig.1 Effect of trypsin，neutral protease，papain and alcalase on preparation yield of protein

根據(jù)蛋白得率的結(jié)果（圖1）可知，胰蛋白酶和堿性蛋白酶對蝦副產(chǎn)物中的粗蛋白提取率較高，提取小龍蝦副產(chǎn)物蛋白的得率分別為（44.39±0.70）%、（43.09±0.45）%。胰蛋白酶中含有多種蛋白酶，包括胰蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶、胰糜蛋白酶等，這些蛋白酶能夠共同發(fā)揮作用，酶切位點多，所以胰蛋白酶用于第二步對小龍蝦副產(chǎn)物粗蛋白進行酶解，第一步的酶解選用堿性蛋白酶，價格低廉，反應調(diào)節(jié)易控制[8-9]。洪瑤等[10]確定了堿性蛋白酶為蝦加工副產(chǎn)物的最佳水解酶，在最優(yōu)條件下蛋白提取率為68.76%；胡川等[11]也同樣用堿性蛋白酶酶解蝦殼，蛋白提取率最高可達61.9%；時麗霞[12]發(fā)現(xiàn)酶解克氏原螯蝦蝦肉制備活性肽的最適酶是堿性蛋白酶，而酶解克氏原螯蝦蝦殼的最適酶則為胰蛋白酶。本研究中選用堿性蛋白酶作為第一步水解酶提取蝦殼中粗蛋白，而胰蛋白酶作為第二步水解酶提取蝦殼蛋白中多肽。

2.3 酶解條件對蛋白得率影響

2.3.1 堿性蛋白酶用量對蛋白得率的影響

堿性蛋白酶用量對蝦副產(chǎn)物中蛋白得率的影響如圖2所示。

圖2 蛋白酶用量對蛋白得率的影響Fig.2 Effect of protease dosage on preparation yield of protein

由圖2可知，當堿性蛋白酶用量較低時，蛋白得率隨酶用量增加呈上升趨勢；當酶用量達到2%時，蛋白得率達到最大值，說明酶用量足以與底物完全結(jié)合；當酶用量超過2%時，蛋白得率呈下降趨勢，沒有更多的底物與酶結(jié)合。蛋白酶在水解蛋白質(zhì)的同時，也水解掉與蛋白質(zhì)相連的物質(zhì)，能有效提高蛋白的提取率；但若底物與酶的結(jié)合位點飽和，加入過量的酶，蛋白的提取率也不會升高。蛋白酶作為一種蛋白質(zhì)，本身也會以底物的形式與酶結(jié)合，和真正的底物進行競爭，導致蛋白得率下降[9，13]。

2.3.2 酶解時間對蛋白得率的影響

酶解時間對蛋白得率的影響如圖3所示。

由圖3可知，酶解時間越長，蛋白得率越低，這可能是由于長時間的酶解，蛋白酶逐漸失活，也可能是由于酶解產(chǎn)物具有對酶的抑制作用，使水解反應終止，蛋白得率下降[13-14]。

圖3 酶解時間對蛋白得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on preparation yield of protein

2.3.3 料液比對蛋白得率的影響

酶解過程中料液比對蛋白得率的影響如圖4所示。

圖4 料液比對蛋白得率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on preparation yield of protein

由圖4可知，蛋白得率隨水解溶劑的增加逐漸升高并趨于平緩。這可能是由于溶劑的增多，溶解的蛋白質(zhì)亦增加；繼續(xù)增加溶劑，會稀釋酶的濃度，降低酶解速率，使提取率有下降趨勢[13-14]。

2.4 一次酶解蝦副產(chǎn)物正交試驗

基于單因素試驗結(jié)果，以蛋白得率為指標，通過L9（33）正交試驗對蝦副產(chǎn)物中蛋白的提取進行優(yōu)化。正交試驗結(jié)果如表5所示。

表5 一次酶解蝦副產(chǎn)物蛋白得率正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal array results for the preparation yield of protein in primary enzymatic hydrolysis

由表5可知，各因素影響堿性蛋白酶水解蝦副產(chǎn)物的蛋白得率主次關系為A＞B＞C，即酶用量＞酶解時間＞料液比。正交試驗的最優(yōu)組合為A2B1C3，即酶用量為 2%，酶解時間為 2 h，料液比為 1∶20（g/mL），此條件下測得蝦副產(chǎn)物蛋白得率為64.32%，高于表5中9組試驗的蛋白得率，與正交試驗結(jié)果相吻合。

2.5 二次酶解蝦副產(chǎn)物蛋白正交試驗

根據(jù)前期試驗基礎，用胰蛋白酶對蝦副產(chǎn)物蛋白進行二次酶解。以蛋白水解度為指標，通過L9（33）正交試驗對蝦副產(chǎn)物蛋白進行二次酶解工藝優(yōu)化。正交試驗結(jié)果見表6。

表6 二次酶解蝦副產(chǎn)物蛋白水解度正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal array results for the hydrolysis degree of protein in secondary enzymatic hydrolysis

由表6可知，各因素影響胰蛋白酶酶解蝦副產(chǎn)物蛋白水解度的主次關系為C＞B＞A，即料液比＞酶解時間＞酶用量。正交試驗的最優(yōu)組合為A2B3C3，即酶用量為 2%，酶解時間為 4 h，料液比為 1∶15（g/mL），在此條件下的蝦副產(chǎn)物蛋白水解度為45.2%，高于表6中9組試驗的水解度。

2.6 酶解多肽總抗氧化性評價

酶解多肽總抗氧化能力如圖5所示。

由圖5可知，在試驗濃度范圍內(nèi)，蝦副產(chǎn)物酶解物的抗氧化能力與其濃度呈線性關系。隨著酶解程度的加深，其總抗氧化能力隨之增強，低分子量的酶解產(chǎn)物抗氧化性能強于高分子量的酶解產(chǎn)物；經(jīng)二次酶解后的產(chǎn)物明顯比一次酶解產(chǎn)物的總抗氧化性強?？寡趸囊环矫婵梢灾苯忧宄杂苫蛘咭种谱杂苫漠a(chǎn)生，其抗氧化活性與多肽分子的大小及氨基酸分子的組成、排列順序有關，大多數(shù)抗氧化活性強的肽分子量小于3 000 Da；另一方面利用間接途徑，通過作用于抗氧化酶，加強抗氧化酶對自由基的清除能力或抑制氧化酶的活性?？寡趸目梢酝ㄟ^清除自由基，減少自由基對抗氧化酶的損傷、加強抗氧化酶的表達，促進抗氧化酶的產(chǎn)生、修復受損的抗氧化酶、抑制氧化酶的表達等方式來提高抗氧化酶活性[15-18]。

圖5 酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity of enzymatic hydrolysates

2.7 酶解多肽蛋白層析

酶解多肽液層析分離圖譜見圖6。

圖6 酶解多肽液層析分離圖譜Fig.6 Elution diagram of enzymolysis polypeptide

在含有Toyopearl HW-40S填料的INLK1660M肽柱的洗脫液中（280 nm）共收獲10份多肽液，收集各組分后調(diào)整濃度（100μg/mL）相同。各組分總抗氧化性結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解多肽液各組分總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity of elution fractions from enzymolysis polypeptide

由圖7可知，與空白對照相比，組分3表現(xiàn)出最強的總抗氧化性。經(jīng)過兩次酶解，逐步將小龍蝦副產(chǎn)物中的蛋白提取并水解成多肽，并且測定出其具有一定的生物活性，若進一步分離純化出活性最強的組分，并分析多肽結(jié)構(gòu)及活性機理，可以為水產(chǎn)品精深加工產(chǎn)業(yè)鏈的延伸提供一定科學參考。有研究表明，貽貝與合浦珠母貝的肌肉被堿性蛋白酶水解并使用超濾膜及柱層析純化分離獲得小于5 kDa的活性肽，具有一定的抗氧化性及成骨性[19-20]?？梢?，對水產(chǎn)品中活性肽的提取純化，有一定的研究價值。

2.8 酶解產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE分析

對小龍蝦副產(chǎn)物兩次酶解產(chǎn)物進行Tricine-SDSPAGE分析，蛋白圖譜如圖8所示。

圖8 酶解產(chǎn)物Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig.8 Tricine-SDS-PAGE diagram of enzymatic hydrolysates

由圖8可知，小龍蝦副產(chǎn)物堿性蛋白酶一次酶解后仍有大分子蛋白存在，多集中于14 kDa；經(jīng)胰蛋白酶二次酶解之后得到的多肽相對分子質(zhì)量主要集中在3.3 kDa以下，說明用兩步酶解作用之后小龍蝦副產(chǎn)物中的大分子質(zhì)量蛋白被降解成為小分子肽。唐志紅等[9]利用胰酶（其中胰蛋白酶，4×103U/g）直接水解小龍蝦副產(chǎn)物分離蛋白制備抗氧化肽，酶解多肽的分子質(zhì)量主要集中在3.3 ku以下，且紫外-可見光譜分析表明酶解產(chǎn)物210 nm附近有特征吸收峰，說明用胰酶作用之后小龍蝦副產(chǎn)物中的大分子質(zhì)量蛋白質(zhì)被降解成為小分子肽。

2.9 酶解多肽氨基酸組成分析

小龍蝦副產(chǎn)物多肽中氨基酸組成如表7所示。

表7 小龍蝦副產(chǎn)物多肽氨基酸組成Table 7 Types and contents of amino acids in crayfish byproducts polypeptides

由表7可知，小龍蝦副產(chǎn)物經(jīng)二次酶解后檢測出18種氨基酸。氨基酸總含量為（298.23±53.49）mg/g，其中必需氨基酸為（191.90±34.12）mg/g，占氨基酸總量的（64.36±0.15）%，呈味氨基酸含量占總氨基酸的（22.94±0.01）%。趙利等[13]用堿性蛋白酶一次水解克氏原螯蝦副產(chǎn)物蛋白肽，其中必需氨基酸比例為47.4%，但呈味氨基酸含量相對較高，占總氨基酸的40.9%，可以用來開發(fā)海鮮調(diào)味品。

3 結(jié)論

兩步酶解法制備小龍蝦副產(chǎn)物多肽，即先用2%堿性蛋白酶，酶解 2 h，料液比 1∶20（g/mL），酶解溫度55℃、pH8.5，獲得蝦副產(chǎn)物蛋白；再用胰蛋白酶二次酶解蝦副產(chǎn)物蛋白，胰蛋白酶用量2%、酶解4 h、料液比 1∶15（g/mL），酶解溫度 37 ℃、pH8.0 的條件下，蝦副產(chǎn)物蛋白水解度為45.2%。二次酶解產(chǎn)物比一次酶解產(chǎn)物的總抗氧化性強；二次酶解多肽的分子質(zhì)量主要集中在3.3 kDa以下；多肽中含有18種氨基酸，必需氨基酸占總氨基酸的（64.36±0.15）%。本研究在豐富小龍蝦副產(chǎn)物多肽制備方法的同時，為蝦副產(chǎn)物制備多肽的產(chǎn)業(yè)化提供了一定的理論指導和科學依據(jù)。