長白山紫蘇黃酮提取及其對小鼠非特異性免疫功能研究

呂萍

（吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林 吉林 132101）

紫蘇（Perilla frutescens L.Britt.）又名桂荏、赤蘇、香蘇等，屬唇形科一年生草本植物，原產(chǎn)于東亞地區(qū)[1-4]，因其顯著的經(jīng)濟效益，現(xiàn)歐美一些國家也有大面積商業(yè)種植，中國是紫蘇栽種面積和年出口量較大的國家[5]。北方以油用為主，兼以藥用；南方以藥用為主，兼作香料和食用[6]。紫蘇葉、莖和果實均能入藥，在醫(yī)藥領域有重要價值，紫蘇是衛(wèi)生部第一批規(guī)定的既是藥品又是食品的60種作物之一[7]，其中紫蘇葉（Folium Perillae）常用入藥，始記于《名醫(yī)別錄》，稱其“主下氣，除寒中?！薄侗静輩R言》提到紫蘇“散寒氣，清肺氣，寬中氣，安胎氣，下結氣，化痰[8-12]。”紫蘇葉有多種生物活性成分，主要有黃酮類、揮發(fā)油類、酚酸類、花色苷類、多糖類、三萜類、甾體類化合物等，其中黃酮類化合物具有增強免疫力、抗癌、抗氧化、抗炎、降血糖等生理功能[13-16]。

隨著人們保健意識的增強，紫蘇葉因其既能作為食材又有生理功效逐漸成為研究熱點。目前對長白山紫蘇的研究較少，且較多集中在揮發(fā)油方面，對其黃酮及免疫活性研究較少。機體免疫功能分為特異性免疫和非特異性免疫，淋巴細胞可反映機體特異性免疫功能的狀態(tài)，而巨噬細胞的吞噬作用可反映機體非特異免疫功能的強弱。目前，國內外學者廣泛使用小鼠碳粒廓清實驗作為藥物及生理活性物質對非特異性免疫功能影響的檢測指標。因此，本文通過正交試驗優(yōu)化超聲波輔助提取長白山道地紫蘇黃酮，并采用小鼠碳粒廓清法研究長白山紫蘇黃酮的非特異性免疫活性，以期為長白山紫蘇的深加工及綜合利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長白山地區(qū)紫蘇葉：市售，經(jīng)烘干粉碎后備用；蘆丁標準品（純度＞96.6%）、乙醇、甲醇、正丁醇、濃鹽酸、鋅粉、三氯化鋁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、印度墨汁、環(huán)磷酰胺（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

實驗動物（KM 小鼠 SPF 級，18 g～20 g）：遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，動物于實驗前在動物房環(huán)境適應1周。

毛細管（100 mm，1.8 mm～2.2 mm）：國藥集團化學試劑有限公司；電子天平（BEM220.4）：上海卓精電子科技有限公司；多功能粉碎機（XS-10）：上海兆申科技有限公司；超聲波清洗機（JL-60DT）：上海杰理科技有限公司；離心機（H2050R-1）：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；紫外可見分光光度計（752N）：上海儀器分析有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9223A型）：成都瑞派斯科技有限公司；恒溫水浴鍋（HH-5）：蘇州威爾實驗儀器開發(fā)有限公司；旋轉蒸發(fā)儀（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

長白山紫蘇鮮葉→除雜→干燥→粉碎→稱重→浸泡→定性分析→超聲波輔助提取→冷卻→離心→定容→定量分析→紫蘇黃酮→非特異性免疫活性分析

1.2.2 原料預處理

長白山紫蘇經(jīng)人工除雜、80℃干燥1 h、粉碎等預處理后，加入一定量乙醇溶液，采用超聲波輔助法浸提紫蘇黃酮。

1.3 長白山紫蘇黃酮的定性分析

1.3.1 HCl-Zn粉反應

取5 mL長白山紫蘇黃酮提取液，加少許鋅粉振搖，再滴加幾滴濃鹽酸，必要時加熱顯色，HCl-Zn粉反應中顯示淡紅色，說明有黃酮的存在[17-18]。

1.3.2 三氯化鋁反應

取5 mL樣品的乙醇溶液，加l%三氯化鋁甲醇溶液，呈色。三氯化鋁反應中顯示亮黃色，說明有黃酮的存在[19-22]。

1.4 長白山紫蘇黃酮的定量分析

1.4.1 蘆丁標準曲線的繪制

取蘆丁標準液（0.3 mg/mL）1、2、5、8 mL 置于 25 mL容量瓶中，用30%乙醇溶液補充至12.5 mL，加入0.7 mL NaNO2溶液搖勻，放置5 min后加入0.7 mL A（lNO3）3溶液，6 min后再加入5 mL NaOH溶液，用30%乙醇溶液定容。10 min后于波長510 nm處進行比色測定，以試劑空白做參比。取長白山紫蘇提取液和對照品溶液各5 mL按上述方法顯色后在510 nm處測其吸光度，代入回歸方程計算得率。

1.4.2 長白山紫蘇黃酮得率的計算

長白山紫蘇黃酮得率的計算公式如下。

式中：C為提取液中的黃酮濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為上清液稀釋倍數(shù)；M為原料的質量，g。

1.5 長白山紫蘇總黃酮提取的單因素試驗

1.5.1 乙醇濃度對紫蘇黃酮得率的影響

分別準確稱取紫蘇的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為 400 W，料液比為 1∶20（g/mL），提取溫度為50℃，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%下提取30 min。之后在4 000 r/min轉速下離心10 min，取上清液按1.4.1的方法測定吸光度，計算出黃酮的得率，試驗做3次重復，計算平均值，研究不同乙醇濃度對紫蘇中黃酮得率的影響[23]。

1.5.2 料液比對紫蘇黃酮得率的影響

取紫蘇葉的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，提取溫度為50 ℃，料液比 1∶10、1∶20、1∶30，1∶40、1∶50（g/mL）下提取30 min。之后在4 000 r/min轉速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測定吸光度，計算出黃酮的得率，試驗做3次重復，計算平均值，研究不同料液比對紫蘇中黃酮得率的影響。

1.5.3 提取溫度對紫蘇黃酮得率的影響

分別準確稱取紫蘇葉的烘干樣5 g各5份于錐形瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，料液比 1∶20（g/mL），提取溫度分別為 30、40、50、60、70 ℃下提取30 min。提取后冷卻至室溫（20℃），在4 000 r/min轉速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測定吸光度，計算出黃酮的得率，試驗做3次重復，計算平均值，研究不同提取溫度對紫蘇中黃酮得率的影響。

1.5.4 超聲時間對紫蘇黃酮得率的影響

分別準確稱取紫蘇的烘干樣5 g各5份于平底燒瓶中，在超聲功率為400 W，選取乙醇濃度為70%，料液比 1∶20（g/mL），分別于 50 ℃水浴超聲提取 15、20、25、30、35 min，之后在4 000 r/min轉速下離心10 min，取其上清液按1.4.1的方法測定吸光度，計算出黃酮的得率，試驗做3次重復，計算平均值，研究不同料液比對紫蘇中黃酮得率的影響。

1.6 長白山紫蘇黃酮提取的正交試驗優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結果，針對影響長白山紫蘇黃酮提取的4個因素，即乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時間作為考察因子，以長白山紫蘇黃酮得率為考察指標，進行L9（34）正交試驗，正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors level of orthogonal test

1.7 長白山紫蘇黃酮非特異性免疫活性研究

通過碳粒廓清實驗測定長白山紫蘇黃酮的免疫活性，將75只KM小鼠，6周齡～8周齡，體重18 g～22 g，隨機分為5組，每組15只。分別為空白組、環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）模型對照組、低劑量黃酮組（100 mg/kg）、中劑量黃酮組（200 mg/kg）、高劑量黃酮組（300 mg/kg）。除空白組外，其他各組小鼠根據(jù)體重每天腹腔注射環(huán)磷酰胺（50 mg/kg）連續(xù)4 d，建立小鼠免疫抑制模型。建模后，使用相應劑量紫蘇黃酮對各組小鼠進行灌胃，空白組和模型組給予等體積的生理鹽水（0.2 mL/10 g），每天稱重、灌胃1次，于第14天給藥1 h后，對每只小鼠尾靜脈注射經(jīng)稀釋的印度墨汁（0.1 mL/10 g），待墨汁注入，立即計時。2 min（t1）和10 min（t2）后，分別從每只小鼠眼眶靜脈叢取血 40 μL于4mL0.1%的NaHCO3溶液中，用752N紫外分光光度計在600 nm處測其吸光度OD值，以0.1%的NaHCO3溶液空白調零，以計算碳粒廓清指數(shù)K。然后將小鼠處死，取肝臟、脾臟，用濾紙吸干表面的血液，稱其重量，同時稱體重、胸腺重和肝脾重，按下列公式計算胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α[24-25]。

胸腺指數(shù)=胸腺重（mg）/體重（g）；脾指數(shù)=脾臟重（mg）/體重（g）。

式中：K 為碳粒廓清指數(shù)；OD1、OD2分別為 2、10min時采血的吸光度；t2-t1為兩次采血的時間差，min。

α=體重（g）/[肝重（g）+脾重（g）]×K1/3

1.8 數(shù)據(jù)分析

文中采用Excel作圖，利用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學描述和分析，采用單因素方差分析進行多組間均值比較，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 長白山紫蘇黃酮的定性分析

長白山紫蘇黃酮的定性結果見圖1。

圖1 長白山紫蘇黃酮的定性結果Fig.1 Qualitative results of flavonoids from Changbai Mountain Perilla

如圖1所示，1號試管為空白對照，2號試管為鹽酸-鋅粉法的比色結果，HCl-Zn粉反應顯示淡紅色，說明有黃酮的存在，3號試管為三氯化鋁法的顯色結果，三氯化鋁反應顯示亮黃色，均證明有黃酮存在。

2.2 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Rutin standard curve

由標準曲線得到回歸方程：y=0.009 0x+0.013 7，R2=0.999 1。

2.3 長白山紫蘇黃酮提取的單因素試驗

2.3.1 乙醇濃度對紫蘇黃酮得率的影響

乙醇濃度對紫蘇黃酮得率的影響見圖3。

圖3 乙醇濃度對長白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ethanol solution concentration on flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖3可知，長白山紫蘇黃酮的得率在乙醇濃度為70%～90%時較高。當乙醇濃度為70%時，黃酮得率最高，為4.7%，可能是增加乙醇濃度可以提高溶液對紫蘇物料的滲透性，進而提高紫蘇中黃酮得率。乙醇濃度增到90%，黃酮得率略微下降，可能是高濃度乙醇會使紫蘇細胞內的蛋白質發(fā)生變性凝固，進而影響黃酮溶出。故選用濃度為70%～90%的乙醇進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.3.2 料液比對紫蘇黃酮得率的影響

料液比對長白山紫蘇黃酮得率的影響見圖4。

圖4 料液比對長白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖4可知，長白山紫蘇黃酮得率隨著溶劑用量的增加呈現(xiàn)先增長后緩慢降低的趨勢。料液比1∶20（g/mL）時黃酮得率最高，為4.9%，料液比達到1∶50（g/mL）時，黃酮得率變化較小，可能是隨著溶劑用量的持續(xù)增加，黃酮物質的浸出也趨于穩(wěn)定狀態(tài)，考慮到溶劑的增加會造成資源浪費，因此選取料液比1∶20（g/mL）進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.3.3 提取溫度對紫蘇黃酮得率的影響

提取溫度對長白山紫蘇黃酮得率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對長白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on flavonoids yield of Changbai Mountain Perilla

由圖5可知，長白山紫蘇葉中黃酮得率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)先增長后緩慢上升的趨勢。隨著溫度的增加，黃酮的得率會增加，這說明溫度越高，黃酮的溶解率越高，但在50℃～70℃范圍內變化并不大?？紤]到節(jié)省成本，故選提取溫度50℃左右為宜。

2.3.4 超聲時間對紫蘇黃酮得率的影響

超聲時間對紫蘇黃酮得率的影響見圖6。

圖6 超聲時間對長白山紫蘇黃酮得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on flavonoids yield in Changbai Mountain Perilla

由圖6可知，長白山紫蘇葉黃酮在提取時間為15 min～30 min時，黃酮的得率隨著超聲時間的延長逐漸上升?？赡苁请S著超聲時間的增加，黃酮類物質不斷地從物料中溶出，在30 min時溶出較多，此時黃酮得率最大。超聲時間在30 min之后，黃酮得率趨于穩(wěn)定，這可能是紫蘇黃酮已基本被溶出，所以繼續(xù)延長超聲時間也不能使得率產(chǎn)生明顯的提高。此外由于長時間的超聲波輻射，也會使一些熱不穩(wěn)定的黃酮變性損失，或者導致溶劑揮發(fā)，從而影響黃酮提取效果，使黃酮得率下降。因此選用30 min左右的超聲時間進行后續(xù)的優(yōu)化試驗。

2.4 正交優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗結果，針對影響長白山紫蘇黃酮提取的4個因素，即乙醇濃度、料液比、提取溫度和超聲時間作為考察因子，以長白山紫蘇黃酮得率為考察指標，進行L9（34）正交試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3，Duncan檢驗分析結果見表4。

表2 正交試驗結果分析Table 2 Analysis of orthogonal test results

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 Duncan檢驗分析結果Table 4 The results of Duncan tests

由表3和表4可知，乙醇濃度、料液比、提取溫度、超聲時間4個因素均對長白山紫蘇黃酮得率有顯著影響，4個因素對長白山紫蘇黃酮得率的影響主次順序：提取溫度＞乙醇濃度＞超聲時間＞料液比。最優(yōu)的浸提工藝條件是A1B2C2D3，即提取的最佳條件：乙醇濃度70%、料液比 1∶20（g/mL）、提取溫度 50 ℃、超聲時間35 min，在此條件下長白山紫蘇黃酮的得率為5.01%。

2.5 長白山紫蘇黃酮非特異性免疫活性的研究

碳粒廓清實驗是通過測定血液中碳粒的消失速度來反映單核巨噬細胞系統(tǒng)吞噬異物的能力，碳粒廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)α越大，表明其體內免疫作用越強[25]。長白山紫蘇黃酮對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響結果見表5，對Cy誘導免疫低下模型小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響見表6。

表5 長白山紫蘇黃酮對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響Table 5 Effect of flavonoids from Changbai Mountain Perilla phagocytic function of macrophages in mice

表6 長白山紫蘇總黃酮對Cy誘導免疫低下模型小鼠胸腺及脾指數(shù)的影響Table 6 Effect of total flavonoids from Changbai Mountain Perilla on thymus and spleen index of Cy induced immunosuppression mice

由表5可知，模型組動物碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α明顯低于空白組，表明用此劑量的環(huán)磷酰胺能造成小鼠免疫低下模型，相對于對照組，實驗組的K值和α值都有提高，并且中、高劑量組呈現(xiàn)了顯著（p＜0.05）或極顯著性差異（p＜0.01），表明中、高劑量的長白山紫蘇黃酮均能不同程度地提高Cy模型小鼠碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α；提示提高長白山紫蘇黃酮劑量可增強免疫低下小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬功能，具有促進小鼠免疫功能的作用。由表6可知，長白山紫蘇黃酮對Cy誘導免疫低下小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的影響，與空白組相比，模型組及各劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均極顯著降低（p＜0.01）。與模型組相比，長白山紫蘇黃酮高劑量組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均顯著增加（p＜0.05）。模型組小鼠的免疫器官指數(shù)顯著低于空白對照組，可初步推斷免疫抑制組小鼠在灌服Cy后，胸腺、脾臟生長發(fā)育受到抑制，因此免疫器官指數(shù)下降，而導致小鼠免疫能力降低。而長白山紫蘇黃酮高劑量組胸腺及脾臟指數(shù)與模型組相比顯著增加，表明高劑量組可促進小鼠胸腺及脾臟生長發(fā)育，使免疫器官指數(shù)升高，小鼠免疫能力增強。

3 結論

通過正交試驗優(yōu)化得到超聲波輔助乙醇溶液提取長白山紫蘇黃酮的最佳工藝條件：乙醇濃度70%、料液比 1∶20（g/mL）、提取溫度 50 ℃、超聲時間 35 min，在此條件下，長白山紫蘇黃酮的得率為5.01%。且提取溫度對得率的影響最大，其次為乙醇濃度、超聲時間，料液比對其影響較小。此外，通過小鼠碳粒廓清實驗表明長白山紫蘇黃酮在適當劑量下能不同程度地提高Cy誘導免疫低下小鼠的巨噬細胞碳粒廓清指數(shù)K及吞噬指數(shù)α，且高劑量組可促進小鼠胸腺及脾臟生長發(fā)育，使免疫器官指數(shù)升高，小鼠免疫能力增強，可增強小鼠的非特異性免疫，對小鼠體質有一定的改善作用，為長白山紫蘇的進一步研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)，綜上，長白山紫蘇黃酮可以作為一種免疫促進劑，增強機體的非特異性免疫，有效地發(fā)揮免疫調節(jié)作用，具有一定的研究價值和開發(fā)前景。今后有必要對長白山紫蘇黃酮的具體成分，以及與免疫活性相關的成分及其免疫活性機制進行深入研究。