UPLC 法測(cè)定黃黑小斑蝥中的斑蝥素

雷欣宇，陳 松，劉昌華，仲伶俐，李 曦

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，a.農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所；b.植物保護(hù)研究所，成都 610066）

斑蝥又名芫菁、斑貓、地膽，為鞘翅目芫菁科昆蟲(chóng)，蟲(chóng)體具有特殊臭氣，在全國(guó)大部分地區(qū)均有分布。據(jù)藥典記載，斑蝥性味辛、熱，有大毒，歸肝、胃、腎經(jīng)，具有破血逐瘀、散結(jié)消瘸、攻毒蝕瘡的功效［1］。斑蝥有效成分為斑蝥素，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)斑蝥素藥用功能研究發(fā)現(xiàn)，斑蝥素及其衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞活性具有明顯抑制作用［2］，在臨床上對(duì)肝癌、胃癌、卵巢癌等均具有一定療效。收錄于《中華人民共和國(guó)藥典》的藥用斑蝥有南方大斑蝥（Mylabris phalerataPallas）和黃黑小斑蝥（Mylabris cichoriiLinnaeus）2 種，其斑蝥素含量要求不得少于0.35%。近年有關(guān)斑蝥素含量的研究主要集中在不同種類(lèi)、不同發(fā)育階段、不同部位以及不同飼養(yǎng)方式［3-6］，針對(duì)同種斑蝥在野生與飼養(yǎng)條件下的斑蝥素研究卻鮮有報(bào)道。目前斑蝥素的測(cè)定大部分采用氣相色譜和普通液相色譜法，UPLC 具有比普通液相色譜分離度好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，其用于斑蝥素測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究建立UPLC 法測(cè)定斑蝥素，可為斑蝥的質(zhì)量控制提供一個(gè)科學(xué)高效的評(píng)價(jià)方法，通過(guò)對(duì)野生與人工飼養(yǎng)黃黑小斑蝥中斑蝥素含量進(jìn)行比較，以期為飼養(yǎng)斑蝥的藥用開(kāi)發(fā)可能性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1290Ⅱ超高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器），美國(guó)Agilent 公司；IKA-RV10 渦旋蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；AUY220型分析天平，日本島津公司；QIlinbeier渦旋混勻器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ5200DE超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與供試樣品

乙腈（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；丙酮（分析純），西隴化工；濃鹽酸（分析純），西隴化工；斑蝥素對(duì)照品（CAS 號(hào)：56-25-7，純度＞98%），北京索萊寶科技有限公司。黃黑小斑蝥，野生樣品與飼養(yǎng)樣品均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm×100.0 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相乙腈+水（40+60）；流速0.2 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量2 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。此條件下色譜見(jiàn)圖1，色譜峰理論板數(shù)按斑蝥素計(jì)大于3 600，斑蝥素保留時(shí)間為3.61 min，比普通液相法提早近60%［7］。斑蝥樣品色譜圖中目標(biāo)峰與干擾峰之間分離度大于1.5，滿足分離要求。

圖1 斑蝥素對(duì)照品（A）與供試品（B）UPLC 色譜

1.3.2 溶液制備

1）對(duì)照品溶液制備。精密稱(chēng)取斑蝥素對(duì)照品10 mg，乙腈溶解并定容至10 mL 容量瓶中，配成濃度為1 mg/mL的斑蝥素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2）供試品溶液制備。精密稱(chēng)取經(jīng)60 ℃烘干、粉碎后的斑蝥樣品粉末0.5 g 于錐形瓶中，加入1.0%鹽酸/丙酮30 mL，超聲處理30 min。提取液過(guò)濾，用少量丙酮分次洗滌錐形瓶，洗液并入濾液中。濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至近干，準(zhǔn)確加入2 mL 乙腈，過(guò)0.22 μm 濾膜，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系與靈敏度 精密吸取對(duì)照品溶液，準(zhǔn)確配制成濃度為0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL 系列對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，由低到高依次進(jìn)樣檢測(cè)。以峰面積為縱坐標(biāo)（y），對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=464.156x-0.878 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，表明斑蝥素在0.02～1.00 mg/mL 線性關(guān)系良好。將斑蝥素對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋進(jìn)樣檢測(cè)，以信噪比（S/N）＞3 時(shí)的質(zhì)量濃度為檢出限，信噪比（S/N）＞10 時(shí)的質(zhì)量濃度為定量限，再根據(jù)方法的稀釋倍數(shù)換算，計(jì)算得方法檢出限為40 mg/kg，定量限為80 mg/kg。

2.1.2 精密度試驗(yàn) 取低、中、高3 個(gè)濃度的斑蝥素對(duì)照品溶液，按照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，其保留時(shí)間與峰面積RSD見(jiàn)表1，表明儀器精密度良好。

表1 斑蝥素精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批對(duì)照品溶液放置于4 ℃冰箱和儀器自動(dòng)進(jìn)樣室內(nèi)，分別于0、2、8、16、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，其峰面積RSD見(jiàn)表2，表明斑蝥素在4 ℃冰箱和儀器自動(dòng)進(jìn)樣室內(nèi)放置24 h 均可保持穩(wěn)定。

表2 斑蝥素穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 回收率與重復(fù)性 將經(jīng)過(guò)多次提取后的斑蝥樣品回收作為陰性樣，分別添加不同濃度的斑蝥素對(duì)照品溶液，每個(gè)水平做5 份，制備供試品溶液，按色譜條件測(cè)定。由表3 可知，不同添加水平的斑蝥素回收率為97.9%～100.9%，RSD為1.7%～3.8%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確、可靠，可應(yīng)用于斑蝥中斑蝥素的測(cè)定。

表3 斑蝥素加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 酸提試驗(yàn)

分別以丙酮和1%鹽酸/丙酮作為提取液，測(cè)定經(jīng)超聲提取后野生和人工飼養(yǎng)斑蝥中斑蝥素含量。結(jié)果表明（表4），酸提液能顯著提高斑蝥素得率，其中人工飼養(yǎng)斑蝥素得率提高了近1 倍，野生得率提高了近2 倍。

表4 提取液對(duì)斑蝥素得率的影響（單位：%）

2.3 樣品含量測(cè)定

2 種方法測(cè)得野生和人工飼養(yǎng)斑蝥中斑蝥素的含量結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 野生與人工飼養(yǎng)斑蝥中斑蝥素測(cè)定結(jié)果（單位：%）

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

分別比較了甲醇/水、甲醇/甲酸水、乙腈/水和乙腈/甲酸水4 種流動(dòng)相的分離效果，其中含有甲酸的流動(dòng)相出峰雜亂，無(wú)法分離目標(biāo)物；與甲醇/水體系相比，乙腈/水流動(dòng)相分離度更好，干擾峰少且峰形尖銳對(duì)稱(chēng)。隨著乙腈比例增加，目標(biāo)物保留時(shí)間明顯提前，但考慮樣品基質(zhì)復(fù)雜，出峰過(guò)早容易受雜質(zhì)峰干擾，為保證分離效果，選擇乙腈/水以40∶60 比例進(jìn)行等梯度洗脫。

3.2 提取方式的選擇

斑蝥素提取常用有索氏提取、冷浸提取、超聲提取等方法［8，9］。試驗(yàn)采用操作簡(jiǎn)便的超聲提取法，分別考察了溶劑提取量（15、30、60、90、120 mL）、提取時(shí)間（10、20、30、40、60 min）和提取溶劑（丙酮、乙醇、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、甲醇）對(duì)斑蝥素提取效果的影響，結(jié)果表明采用30 mL 丙酮超聲提取30 min的效果最好。

3.3 酸提試驗(yàn)效果

斑蝥素是一種酸酐，能與鈉、鈣、鎂、鉀等金屬元素結(jié)合，形成斑蝥素鈉鹽、鈣鹽或鎂鹽等結(jié)合性斑蝥素。斑蝥體內(nèi)的斑蝥素通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)形式同時(shí)存在，結(jié)合態(tài)斑蝥素在酸性條件下能夠水解出游離斑蝥素，因此經(jīng)水解后檢測(cè)的斑蝥素更能反映出總體水平。在參考相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上［10，11］，試驗(yàn)考察了鹽酸、甲酸、醋酸對(duì)斑蝥素提取效果的影響，結(jié)果以1%鹽酸提取效果最佳。酸提試驗(yàn)結(jié)果表明，野生斑蝥和人工飼養(yǎng)斑蝥經(jīng)1%鹽酸/丙酮提取后測(cè)得斑蝥素含量相比丙酮提取法有1～2 倍的提升，提取效果顯著。表明野生斑蝥與飼養(yǎng)斑蝥均存在結(jié)合態(tài)斑蝥素，經(jīng)酸水解成游離態(tài)后被一同檢測(cè)出來(lái)，因此測(cè)得值為斑蝥素總量值。同時(shí)，從加酸與不加酸處理的結(jié)果差值大小來(lái)看，野生斑蝥中斑蝥素以結(jié)合形態(tài)為主，人工飼養(yǎng)斑蝥中斑蝥素游離態(tài)和結(jié)合態(tài)占比基本持平。

3.4 樣品含量分析

本研究方法測(cè)得野生和人工飼養(yǎng)斑蝥中斑蝥素含量分別為3.080%和1.630%，約為藥典法測(cè)得值的3～4 倍。藥典法采用二氯甲烷提取，測(cè)定結(jié)果僅反映斑蝥體內(nèi)游離斑蝥素含量，本研究方法檢測(cè)出的斑蝥素總量更能準(zhǔn)確反映出斑蝥素真實(shí)水平，這對(duì)于斑蝥的用藥安全具有一定的參考價(jià)值。野生斑蝥游離和總量斑蝥素均高于人工飼養(yǎng)斑蝥，顯現(xiàn)出了品種優(yōu)勢(shì)，但人工飼養(yǎng)斑蝥的斑蝥素含量符合藥典對(duì)斑蝥藥材來(lái)源中斑蝥素含量的規(guī)定，表明人工飼養(yǎng)斑蝥亦可作為提取斑蝥素的來(lái)源藥材，這對(duì)于緩解因野生斑蝥資源緊缺造成的市場(chǎng)供求矛盾有積極作用。目前斑蝥人工飼養(yǎng)的研究已有相關(guān)報(bào)道［12，13］，可知飼養(yǎng)的光溫土壤環(huán)境、喂養(yǎng)食物種類(lèi)等均會(huì)對(duì)斑蝥素的累積產(chǎn)生影響。如何優(yōu)化斑蝥養(yǎng)殖技術(shù)，獲取高質(zhì)量斑蝥素尚待繼續(xù)研究。