景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測(cè)定

王立業(yè)，牛江秀，王真真，吳玉琦，馬紫玉，王艷艷，于志斌

（1.洛陽(yáng)師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471934；2.中國(guó)醫(yī)藥保健品進(jìn)出口商會(huì)，北京 100010）

景天三七（Sedum aizoonL.）為景天科景天屬多年生草本植物，又名菊葉三七、養(yǎng)心草、八仙草、活血丹、血山草、長(zhǎng)生景天、金不換等，素有高原人參和雪山仙草之稱，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物，全年可采集，全草或根均可入藥或食用。由于其易于栽培種植，生命力頑強(qiáng)，近年來(lái)被大量種植，廣泛分布于中國(guó)東北、西北、華北及長(zhǎng)江流域各省市［1］。景天三七性平，味甘、微酸，歸心、肝經(jīng)，具有涼血止血、消炎、散瘀止痛、解毒消腫、滋陰養(yǎng)血、安神的功效，常用于治療跌打損傷、創(chuàng)傷出血、吐血、產(chǎn)后血?dú)馔吹取，F(xiàn)代藥理研究表明，景天三七具有抗衰老、抗缺氧、抗疲勞、抗炎及改善心腦血管系統(tǒng)及免疫調(diào)節(jié)作用［2］。

近年來(lái)對(duì)景天三七的研究越來(lái)越受到重視，研究表明，景天三七所含有效成分有多糖類、黃酮類、酚酸類、生物堿類、β-谷甾醇等［3］。其中，黃酮類是景天三七的主要功效成分之一。黃酮類是具有C6-C3-C6基本骨架（圖1）化合物的總稱，是廣泛存在于植物界的一大類天然產(chǎn)物，如楊梅黃酮、山楂黃酮、大豆異黃酮等，種類繁多，常作為藥材質(zhì)量控制指標(biāo)［4］。黃酮類化合物具有明確而廣泛的藥理作用，具有抗氧化、抗胃潰瘍、神經(jīng)保護(hù)、抗心肌缺血、降血壓、改善學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知、保護(hù)生殖系統(tǒng)、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤以及降血糖等多種藥理活性［5，6］。因此，對(duì)景天三七黃酮的開發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前對(duì)景天三七的研究多集中于提取工藝、部分功效成分的含量測(cè)定和藥理活性研究［2］，尚未建立對(duì)景天三七不同部位中總黃酮含量的測(cè)定方法，制約著景天三七黃酮的開發(fā)和利用。

圖1 黃酮類化合物的基本骨架結(jié)構(gòu)

關(guān)于黃酮類物質(zhì)檢測(cè)的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法主要分3類：高效液相法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和分光光度法［7］。高效液相法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法通常需要貴重的儀器設(shè)備、操作復(fù)雜，并需要多種對(duì)照物，不能對(duì)樣品中所含有的總黃酮物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，缺乏適用性且應(yīng)用范圍有限。分光光度法結(jié)果準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單快速，并能對(duì)總黃酮含量進(jìn)行準(zhǔn)確分析，被廣泛應(yīng)用于多種植物中總黃酮的含量測(cè)定。本研究擬采用索氏提取法對(duì)河南產(chǎn)景天三七根、莖、花、葉中的總黃酮進(jìn)行提取，以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 作顯色劑，建立景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測(cè)定的分光光度方法，并對(duì)該方法的最大吸收波長(zhǎng)、檢測(cè)限、定量限、線性、準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行考核，為景天三七總黃酮的含量測(cè)定提供方法學(xué)依據(jù)，同時(shí)為了解景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的分布及有針對(duì)性的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

新鮮景天三七樣品采自河南省洛陽(yáng)市、三門峽市等地區(qū)，采集時(shí)間為2019 年7—9 月，經(jīng)鑒定為景天三七。將其不同部位進(jìn)行分類，干燥后粉碎，過80 目篩備用。

1.2 儀器

T6 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TU-1810 紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA2004 電子分析天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試劑與溶液

蘆丁對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供（100080-201907，含量測(cè)定用）。10 g/L 氫氧化鈉溶液：稱取10.0 g 氫氧化鈉，用水溶解后定容至1 L。50 g/L 亞硝酸鈉溶液：稱取5.0 g 亞硝酸鈉，用水溶解后定容至100 mL。100 g/L 硝酸鋁溶液：稱取10.0 g硝酸鋁，用水溶解后定容至100 mL。甲醇等其他試劑均為分析純，水為去離子水。

1.4 對(duì)照品及供試品溶液的制備

1）對(duì)照品溶液的制備。精密稱取在60 ℃減壓干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品50 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，置水浴上微熱使其完全溶解，冷卻至室溫，加甲醇定容至刻度，搖勻。從中精密量取10 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液（蘆丁含量為0.2 mg/mL）。

2）供試品溶液的制備。分別精密稱取景天三七根、莖、花、葉樣品1.0 g 于濾紙包中，置索氏提取器抽提瓶?jī)?nèi)，加甲醇90 mL，加熱回流至提取液無(wú)色，將提取液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，用少量甲醇洗滌容器，洗液一同并入同一容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得。從中精密量取3 mL 用于測(cè)定。

1.5 測(cè)定

精密量取一定量的對(duì)照品溶液和供試品溶液，置于25 mL 容量瓶中，加水至10.0 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min，最后加入氫氧化鈉溶液4 mL，加水定容至刻度，搖勻后放置15 min。以相應(yīng)的試劑為空白，用紫外分光光度法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

精密量取供試品溶液3 mL 置于25 mL 容量瓶中，制備樣品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，于紫外分光光度計(jì)上，在190～800 nm 內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖2。由圖2 可以看出，樣品顯色液在365 nm 處有最大吸收，因此選擇365 nm 作為景天三七總黃酮測(cè)定的最佳吸收波長(zhǎng)。

圖2 樣品顯色液在190～800 nm的紫外掃描

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，制備樣品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，在365 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），最小二乘法直線回歸，得蘆丁回歸方程為：y=0.017 5x+0.04，R2=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，蘆丁濃度在8～40 μg/mL 線性關(guān)系良好。

圖3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 檢測(cè)限與定量限 取干凈的25 mL 容量瓶20個(gè)，分別準(zhǔn)確加入10 mL 去離子水，加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min，最后加入氫氧化鈉溶液10 mL，加水定容至刻度，搖勻后放置15 min。以去離子水為空白，按紫外分光光度法在365 nm 處測(cè)定吸光度。檢測(cè)限和定量限分別按如下公式進(jìn)行計(jì)算。

式中，σ 為空白響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

結(jié)果表明，20次空白測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.006 0，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為0.017 5，由此可計(jì)算得到方法的檢測(cè)限為1.13 μg/mL，定量限為3.43 μg/mL。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取景天三七根、莖、花、葉粉末樣品1.0 g，制備樣品溶液。精密量取3.0 mL 測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定6 次，結(jié)果見表1。由表1可知，根、莖、花、葉中總黃酮含量的平均值分別為2.94%、2.80%、0.98%和1.62%，RSD分別為0.14%、0.09%、0.04%和0.05%，變異系數(shù)均≤2%，表明該方法的精密度良好。

表1 景天三七根莖花葉中總黃酮含量測(cè)定精密度考察結(jié)果

2.2.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 方法的準(zhǔn)確度以樣品添加回收試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（濃度為0.2 mg/mL）0.5、1.0、2.0 mL 各3 份，置于25 mL 容量瓶中，分別加入已知含量的景天三七根、莖、花、葉供試品溶液樣品溶液3.0 mL，測(cè)定吸光度。回收率計(jì)算公式如下。

式中，P為蘆丁添加回收率，%；A為樣品添加后的吸光度；A0為樣品添加前的吸光度；m為蘆丁的加入量，mg。

景天三七根、莖、花、葉中不同添加水平的回收率結(jié)果見表2。由表2 可知，景天三七根、莖、花、葉中低、中、高3 個(gè)添加濃度蘆丁的平均回收率分別為93.87%、92.85%、94.58%和93.00%，RSD分別為4.31%、3.42%、2.39%和2.69%，RSD均≤5%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好，滿足定量方法學(xué)的要求。

表2 景天三七根、莖、花、葉總黃酮含量測(cè)定準(zhǔn)確度考察結(jié)果

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備的根、莖、花、葉供試品顯色后，分別在0、30、60、90、120、180 min 測(cè)定其吸光度，考察供試品顯色后的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖4。由圖4 可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的吸光度逐漸增大，在顯色后第90 min，吸光度變化值小于5%，表明所有樣品顯色后在90 min 內(nèi)穩(wěn)定，測(cè)定應(yīng)在顯色后90 min 內(nèi)完成。

圖4 景天三七根、莖、花、葉樣品顯色后穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 景天三七根、莖、花、葉中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

按照所建立的方法，對(duì)景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算得出河南產(chǎn)景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的含量見表3。由表3 可知，所采集河南產(chǎn)景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的平均含量分別為（29.44±1.37）、（27.96±0.87）、（9.79±0.36）、（16.16±0.50）mg/g（以蘆丁量/干材料表示，n=6）。

表3 景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的測(cè)定結(jié)果（n=6）

3 討論

黃酮類化合物因具有多種生物活性、藥理作用和復(fù)雜的藥效作用機(jī)制，一直是藥物研發(fā)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)。根據(jù)C6-C3-C6基本骨架上中央三碳的氧化程度、是否成環(huán)、B 環(huán)的聯(lián)接位點(diǎn)等特點(diǎn)，可將該類化合物分為多種結(jié)構(gòu)類型，如黃酮、黃酮醇、二氫黃酮、二氫黃酮醇、異黃酮；異黃烷酮、查耳酮、二氫查耳酮、橙酮、黃烷和黃烷醇、花色素類、雙黃酮類［8］。盡管黃酮類單體多種多樣，但黃酮類化合物中常帶有可與鋁鹽、鉛鹽、鋯鹽、鎂鹽、鍶鹽、鐵鹽等試劑發(fā)生反應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元，生成有色絡(luò)合物。因此金屬鹽類試劑絡(luò)合顯色-分光光度法被作為測(cè)定總黃酮含量的常用方法［7］。因顯色劑NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 顯色穩(wěn)定、價(jià)格低廉、環(huán)境污染小等因素，被廣泛應(yīng)用于中草藥中總黃酮的含量測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)為510 nm［9］?？紤]到不同植物中黃酮的種類差異，本研究對(duì)景天三七黃酮經(jīng)NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色后的最大吸收波長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)定，在波長(zhǎng)190～800 nm的紫外分光光度掃描結(jié)果表明，景天三七黃酮與鋁鹽在365 nm 有最大吸收，而在510 nm 附近的吸收峰不明顯，為使分析具有更好的靈敏度和特異性，因此選擇365 nm 作為測(cè)定波長(zhǎng)，在該波長(zhǎng)下，對(duì)照品蘆丁濃度在8～40 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，表明在選擇的測(cè)定波長(zhǎng)下，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，滿足定量方法學(xué)的要求。

黃酮類化合物是一類廣泛存在于蔬菜、水果和中草藥中的化合物，是植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物。由于結(jié)構(gòu)中多含有苷元，一般難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑和稀堿液。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［10］，黃酮的提取方法有溶液提取法、超聲提取法、復(fù)合酶輔助高壓提取法、減壓內(nèi)部沸騰法和超聲輔助雙水相萃取法等。溶液提取法中，甲醇和乙醇普遍應(yīng)用于苷和苷元，熱水提取法普遍應(yīng)用于黃酮苷。考慮到甲醇和乙醇性質(zhì)的相似性，本研究比較了甲醇和熱水作為溶劑對(duì)景天三七總黃酮的提取效率，結(jié)果顯示，甲醇作提取劑時(shí)黃酮的測(cè)得量顯著高于熱水，表明景天三七所含黃酮以含苷或苷元為主的黃酮類物質(zhì)。由于索氏提取法具有操作簡(jiǎn)單、試劑可以反復(fù)循環(huán)、提取效率高，同時(shí)能避免其他方法多次提取造成的操作誤差等優(yōu)勢(shì)，本研究建立以甲醇為溶劑，索氏提取法對(duì)景天三七黃酮測(cè)定的樣品前處理方法，方法學(xué)考察顯示，根、莖、花、葉中低、中、高3 個(gè)水平蘆丁的平均回收率均≥92%，變異系數(shù)≤5%，表明所建立的樣品前處理方法對(duì)景天三七黃酮具有較好的提取效率和穩(wěn)定性。

按照所建立的方法，對(duì)河南產(chǎn)景天三七根、莖、花、葉中總黃酮的測(cè)定結(jié)果表明，景天三七根、莖、花、葉普遍存在黃酮類化合物，但各個(gè)部位樣品中總黃酮含量存在差異?？傸S酮含量最高的為根，含量可達(dá)29.44 mg/g，其次是莖，其總黃酮含量為27.96 mg/g，葉中總黃酮含量為16.16 mg/g；花中總黃酮含量最少，僅為9.79 mg/g。這與紫萁（根狀莖＞葉）［11］、青錢柳（根＞莖＞葉）［12］、藜蒿（根＞莖＞嫩芽）［13］等植株中的總黃酮分布趨于一致，但與沙棘（根＜莖＜葉）［14］、蕎麥（莖＜根＜果＜葉＜花）［15］等植株中的總黃酮分布呈相反趨勢(shì)，表明黃酮類化合物在不同植物器官中的分布與植物器官所承擔(dān)的功能有關(guān)，同時(shí)也呈現(xiàn)一定的種屬差異。因此，對(duì)不同植株中黃酮類物質(zhì)的開發(fā)利用應(yīng)具體問題具體分析。就景天三七而言，莖葉部分通常作蔬菜等食用，根食用的普遍性受到限制，但根部黃酮含量最高，如果能將其作為原料進(jìn)行化工或功能食品開發(fā)，將進(jìn)一步提高景天三七應(yīng)用的市場(chǎng)價(jià)值。對(duì)比其他地區(qū)景天三七黃酮的含量，本研究所測(cè)定的河南產(chǎn)景天三七黃酮含量 低于 陜西 產(chǎn)（39.57±0.59）mg/g［16］，高 于河 北產(chǎn)（18.39.57±0.40）mg/g，與黔產(chǎn)28.32 mg/g 相當(dāng)［17］，除了可能的采收時(shí)期影響外，表明不同產(chǎn)地的景天三七中黃酮含量存在一定的差異。