江漢雞群體FSHβ 基因遺傳多態(tài)位點(diǎn)分析

黃 濤，潘愛鑾，申 杰，吳 艷，蒲躍進(jìn)，張 昊，孫 靜，梁振華，杜金平，朱昌友，皮勁松

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北省畜牧良種場(chǎng)，武漢 434010）

江漢雞為中國地方品種，是湖北省非常重要的地方雞遺傳資源。江漢雞是在江漢平原上進(jìn)化長(zhǎng)時(shí)間馴化而成的，具有自身明顯的特征，以黃麻羽居多，體重較輕，屬蛋肉兼用型，自然群體里有部分雞產(chǎn)綠殼蛋［1］。雖然江漢雞具有產(chǎn)品品質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)、耐粗飼等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一些不足，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)速度較慢、產(chǎn)蛋少、飼料轉(zhuǎn)化率低、生產(chǎn)成本高［2］。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗(yàn)場(chǎng)開展對(duì)江漢雞的保種與開發(fā)利用工作，基于江漢雞的配套利用［3］進(jìn)行選育，挖掘江漢雞遺傳特色是對(duì)其進(jìn)行開發(fā)利用的緊迫任務(wù)，獲取江漢雞群體遺傳變異信息，對(duì)功能位點(diǎn)的預(yù)測(cè)與篩選或許有利于今后的開發(fā)利用。

卵泡雌激素（FSH）是促卵泡素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH），由垂體前葉分泌，是一種糖蛋白激素。FSH 分子是由α 和β 2 個(gè)亞基組成的異質(zhì)二聚體，當(dāng)β 亞基與α 亞基結(jié)合時(shí)其才具有生物學(xué)活性［4］。FSHβ基因?qū)﹄u性成熟和生殖等具有調(diào)控作用，能刺激卵泡發(fā)育和成熟，產(chǎn)生雌激素和促進(jìn)排卵。李江曼［5］在不同品種雞的FSHβ基因檢測(cè)到單堿基突變位點(diǎn)與寧都黃雞的產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)；秦玉梅等［6］在雞FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著相關(guān)。本研究基于基因組重測(cè)序結(jié)果鑒定江漢雞群體FSHβ基因的遺傳變異信息，通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)功能性變異位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

江漢雞來源于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所家禽試驗(yàn)雞場(chǎng)。在18 周齡時(shí)隨機(jī)抽取30 只進(jìn)行腋下采血，于抗凝管中保存。DNA的提取采用天根DNA 提取試劑盒（TIANamp Blood DNA Kit）進(jìn)行，提取的DNA 用NanoDrop 2 000 進(jìn)行濃度測(cè)定。將各樣品稀釋到100 ng/μL，然后每個(gè)樣品取3 μL進(jìn)行混池。

1.2 重測(cè)序分析

DNA 樣品送往百易匯能公司進(jìn)行建庫測(cè)序。在獲取原始數(shù)據(jù)后，首先使用cutadapt 軟件進(jìn)行clean reads 操作。下載Galgal6 參考基因組，使用bwa 軟件建立索引。運(yùn)用SAMtools 軟件對(duì)clean reads 進(jìn)行序列比對(duì)組裝。生成Bam 文件，建立索引后導(dǎo)入IGV軟件中收集變異位點(diǎn)。使用GATK 軟件對(duì)bam 文件進(jìn)行變異位點(diǎn)整理生成vcf文件，該文件里包含基因組遺傳變異信息。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

針對(duì)FSHβ基因序列中的遺傳變異，篩選潛在的功能性變異。分析內(nèi)容包括3 個(gè)部分，分別為M6A 分析、調(diào)控元件分析和miRNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析。設(shè)定mRNA（NM_204257.1）序列第一個(gè)堿基為+1。使用RNAfold web server 進(jìn)行cds 區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；使用SRAMP（http：//www.cuilab.cn/sramp/）在線軟件對(duì)序列進(jìn)行M6A 分析；在對(duì)調(diào)控元件進(jìn)行分析時(shí)，采用JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）在線分析軟件，設(shè)置置信參數(shù)大于85。在對(duì)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析時(shí)，采用miRDB（http：//mirdb.org/）在線軟件進(jìn)行分析，保留target score為60以上的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 江漢雞群體FSHβ 基因遺傳變異

基于基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)，獲取江漢雞群體FSHβ基因所有遺傳變異信息（圖1、圖2）。FSHβ基因包括有2 個(gè)內(nèi)含子和3 個(gè)外顯子。外顯子又可以分為5′utr、cds和3′utr。本研究在江漢雞群體中發(fā)現(xiàn)該基因共有35 個(gè)SNPs 和2 個(gè)indels。其中外顯子有31個(gè)SNPs，其分布為5′utr 區(qū)0 個(gè)，cds 區(qū)2 個(gè)，3′utr 區(qū)29 個(gè)；內(nèi)含子有4 個(gè)SNPs。此外，發(fā)現(xiàn)的2 個(gè)indels位于3′utr區(qū)。

圖1 江漢雞群體FSHβ 基因內(nèi)遺傳變異信息統(tǒng)計(jì)

圖2 江漢雞FSHβ 基因內(nèi)出現(xiàn)6 個(gè)連續(xù)堿基indel（紅框）

2.2 FSHβ 蛋白結(jié)構(gòu)分析

在江漢雞中發(fā)現(xiàn)位于FSHβ基因cds 區(qū)有2 個(gè)SNPs，位于+297 位置G 突變成A，屬于非同義突變，造成其由甘氨酸變成絲氨酸。位于+431 位置C 突變成T，屬于同義突變，未發(fā)生氨基酸變化。比較非同義突變對(duì)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，G 突變成A 自由能由-441.29 kJ/mol 變?yōu)?444.22 kJ/mol，C突變成T自由能由-441.29 kJ/mol變?yōu)?441.71 kJ/mol。+297 和+431 位點(diǎn) 突變 前后cds 區(qū)RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)變化情況見圖3。甘氨酸突變成絲氨酸，蛋白質(zhì)分子式由C643H967N161O203S17變成C644H969N161O204S17?？偲骄H水性由-0.069 變成-0.072，不穩(wěn)定指數(shù)和理論等電點(diǎn)未發(fā)生變化。

圖3 突變對(duì)FSHβ 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.3 FSHβ 基因M6A 分析

使用SRAMP 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)M6A 修飾位點(diǎn)。結(jié)果顯示該轉(zhuǎn)錄本內(nèi)有10 個(gè)潛在的M6A 修飾位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的位置分別在+110、+152、+376、+392、+518、+1398、+1408、+1684、+1691、+1874。其中，1 個(gè)位點(diǎn)具有極高置信度（very high confidence），5 個(gè)位點(diǎn)具有高置信度（high confidence），3 個(gè)位點(diǎn)具有中置信度（moderate confidence），1 個(gè)位點(diǎn)具有低置信度（low confidence），這10 個(gè)位點(diǎn)在江漢雞群體中沒有發(fā)生遺傳變異。

2.4 FSHβ 基因調(diào)控元件預(yù)測(cè)分析

使用JASPAR 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在設(shè)置置信參數(shù)為85%后，獲取70 個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件，主要涉及5 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（圖4），分別包括TFAP2A、RUNX1、AG、AGL3 和arnt。在江漢雞群體中，發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SNPs 位于調(diào)控元件的序列中（表1）。值得注意的是，TFAP2A 靶向的調(diào)控元件序列中分別包含2 個(gè)SNPs，且都位于正鏈上。

表1 FSHβ 基因轉(zhuǎn)錄本內(nèi)有江漢雞遺傳變異位點(diǎn)的調(diào)控作用元件

圖4 轉(zhuǎn)錄因子種類與數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.5 FSHβ 基因靶向miRNA 預(yù)測(cè)分析

使用miRDB 在線軟件對(duì)FSHβ的mRNA（NM_204257.1）序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)miRNA 結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)置分?jǐn)?shù)在60 以上后獲取51 個(gè)miRNAs，這些miRNAs具有靶向轉(zhuǎn)錄本調(diào)控基因表達(dá)的潛力。通過對(duì)這51個(gè)miRNAs的種子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分miRNA的種子序列中包含有江漢雞SNPs。其中g(shù)ga-miR-6605-5p的種子序列中包含多達(dá)3 個(gè)SNPs。將種子序列有SNPs的miRNAs 列出（表2），可用于江漢雞繁殖性狀中的調(diào)控作用研究。

表2 種子序列中包含有江漢雞遺傳變異位點(diǎn)的miRNAs

3 小結(jié)與討論

隨著基因組重測(cè)序技術(shù)的普及，獲取地方雞基因組遺傳變異信息變得越來越容易。但是，如何在海量的遺傳變異位點(diǎn)中篩選出功能性變異依然具有很大的挑戰(zhàn)性。地方遺傳資源的開發(fā)與利用，歸根結(jié)底要利用功能性的遺傳變異進(jìn)行遺傳改良，而這也是應(yīng)用性研究的主要內(nèi)容。本研究關(guān)注繁殖激素FSH的β 亞基基因序列，利用基因組重測(cè)序技術(shù)，獲取該基因序列在江漢雞群體中所有的遺傳變異位點(diǎn)。通過M6A 預(yù)測(cè)分析、調(diào)控元件預(yù)測(cè)分析和miRNA 結(jié)合序列分析，篩選出具有潛在功能性的遺傳變異位點(diǎn)，用于今后的進(jìn)一步研究。

FSHβ基因內(nèi)有豐富的遺傳變異位點(diǎn)，且存在品種特性。王鵬等［7］在儋州雞FSHβ基因鑒定出25 個(gè)SNP 位點(diǎn)，其中21 個(gè)SNPs 也存在于江漢雞群體中。通過比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)品種之間有部分SNPs 屬于品種特有，這些遺傳變異位點(diǎn)具有較高的研究?jī)r(jià)值。

FSHβ基因富含遺傳多態(tài)位點(diǎn)，有報(bào)道與產(chǎn)蛋性狀有關(guān)。在江漢雞+931 位置SNP，洪坤月等［8］發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與綠殼蛋雞開產(chǎn)日齡相關(guān)。在江漢雞+1024位置有SNP，田艷苓等［9］發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與濟(jì)寧百日雞開產(chǎn)日齡有關(guān)。李江曼［5］在+868 位置發(fā)現(xiàn)SNP 與寧都黃雞產(chǎn)蛋性能顯著相關(guān)，但是江漢雞群體中沒有該變異。在江漢雞轉(zhuǎn)錄本3′utr 區(qū)+1299 位置為純合型，但在玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞中，秦玉梅等［6］發(fā)現(xiàn)該位置的堿基突變，且與300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)有關(guān)，該結(jié)果與孫杰等［10］的研究結(jié)果基本一致。王亞男［11］在FSHβ基因中發(fā)現(xiàn)了3 處SNPs 與京海黃雞體增重有關(guān)，3 處變異位點(diǎn)對(duì)應(yīng)在轉(zhuǎn)錄本+606、+607 和+898位置，該位置與江漢雞變異情況一致，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示+606、+607 位置位于TFAP2A 調(diào)控元件內(nèi)，推測(cè)在體增重過程中其參與一定調(diào)控作用。韓厚明［12］在文昌雞FSHβ基因外顯子中發(fā)現(xiàn)3 處SNPs，其對(duì)應(yīng)在轉(zhuǎn)錄本+898、+931 和+1024 位置，與江漢雞變異情況一致。不過，文昌雞中上述3 個(gè)位點(diǎn)未見與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)。

總之，對(duì)江漢雞FSHβ基因進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)35 個(gè)SNPs 和2 個(gè)indels。值得注意的是，在這些變異位點(diǎn)之中，1 個(gè)SNP 位于cds 區(qū)造成甘氨酸變成絲氨酸。此外還發(fā)現(xiàn)7 個(gè)SNPs 位于潛在的調(diào)控元件序列中，7 個(gè)SNPs 和1 個(gè)indel 位于潛在的miRNA 結(jié)合序列中。所篩選的上述遺傳變異位點(diǎn)，可能參與了FSHβ基因的表達(dá)調(diào)控，在江漢雞遺傳特性中扮演一定的角色。