不同種植模式對佛手山藥土壤養(yǎng)分和微生物群落的影響

劉東海，喬 艷，李雙來，張 智，李 菲，徐 為，胡 誠

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064；2.湖北美天生物科技股份有限公司，湖北 武穴 435400）

武穴市是全國最大的佛手山藥生產(chǎn)基地［1］，播種面積2 000 hm2。佛手山藥因其品種獨特，品質(zhì)優(yōu)良，風(fēng)味獨特，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，2012 年被湖北省農(nóng)業(yè)廳授予“首屆湖北名優(yōu)蔬菜”［2］。長期連續(xù)種植山藥會導(dǎo)致土壤中微生物組成和數(shù)量發(fā)生變化［3，4］，破壞土壤耕層微生物種群結(jié)構(gòu)［5］，并抑制土壤酶活性，加重根結(jié)線蟲的危害［6］，甚至誘發(fā)嚴(yán)重的土傳病害［7］，從而影響山藥生長發(fā)育和產(chǎn)量［8］。宋佳承［9］指出馬鈴薯-玉米輪作明顯提高了馬鈴薯根際土壤中細(xì)菌和真菌多樣性，改變了細(xì)菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)，對調(diào)控馬鈴薯連作障礙效果較好。蘇燕等［10］指出水旱輪作模式可提高馬鈴薯根際土壤的細(xì)菌群落多樣性，重點預(yù)防馬鈴薯發(fā)生細(xì)菌性病害。范琳娟等［11］增加山藥種植間隔期，可改變土壤線蟲群落結(jié)構(gòu)，大幅降低植物寄生線蟲豐度，增加土壤生態(tài)系統(tǒng)健康程度。

研究者采用微生物培養(yǎng)技術(shù)開展了山藥連作對土壤主要微生物類群的影響，僅限于對土壤中極少數(shù)部分（0.1%～1.0%）可培養(yǎng)的微生物類群的研究。高通量測序技術(shù)可全面、準(zhǔn)確獲得微生物群落結(jié)構(gòu)信息的特點，在細(xì)菌和真菌方面應(yīng)用較多，但是線蟲研究停留在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法。本研究采用高通量測序（細(xì)菌16S rDNA、真菌18S rDNA 和線蟲NF1-F/18Sr2b-R）技術(shù)對經(jīng)過3 年連作和水稻山藥輪作的山藥土壤中的細(xì)菌、真菌和線蟲多樣性展開研究，結(jié)合土壤理化性質(zhì)以及產(chǎn)量數(shù)據(jù)，分析不同種植模式下土壤微生物的變化情況，為減輕山藥連作障礙，采用更好的輪作模式提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗地點位于湖北省武穴市余川鎮(zhèn)大祝村，土壤類型為沙質(zhì)壤土，品種均為本地佛手山藥品種，試驗地設(shè)置為2 個處理。處理1的種植模式是3 年水稻山藥輪作（SY），處理2 是3 年山藥連作（LZ）。土壤耕層（0～30 cm）進行多點取樣，每個處理按“S”形選取5 個樣點，土樣充分混合均勻，裝入已消毒的自封袋中，放入冰盒中帶回。每個混合土樣分為兩部分，一部分用于化學(xué)指標(biāo)測試，另一部分放置于-80 ℃冰箱保存，用于DNA 提取和高通量測序。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 土壤理化性狀測定 堿解氮用堿解擴散法，速效磷用紫外可見分光光度法，速效鉀用火焰光度法，有機質(zhì)用重鉻酸鉀法，土壤pH 采用1.0∶2.5的水土比、復(fù)合電極測定；植株樣品測定全氮、全磷、全鉀含量。樣品用H2SO4-H2O2消煮，全氮用凱氏定氮法，全磷用鉬銻抗比色法，全鉀用火焰光度法進行測定。粗蛋白質(zhì)的測定采用凱式定氮法，將所測得值乘以系數(shù)6.25 即為其粗蛋白質(zhì)含量。以上測定方法均參考文獻［12］。

1.2.2 細(xì)菌和真菌擴增測序 采用EZNA Soil NDA Kit（Omega Bio-tek 公司）提取土壤總DNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。對16S rDNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增，引物序 列為338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。對18S rDNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進行PCR 擴增引物序列為SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和81196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）。擴增條件為95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。每個樣本3 個重復(fù)，將同一樣本的PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN Biosciences 公司）切膠回收PCR 產(chǎn)物，Tris_HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR 產(chǎn)物用QuantiFluor-ST 藍色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）進行檢測定量，按照每個樣本的測序量要求，進行相應(yīng)比例的混合。在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司的Illumina Miseq PE300、PE 250平臺分別進行細(xì)菌和真菌的測序。

1.2.3 線蟲群落的擴增測序

1）使用引物NF1-F/18Sr2b-R［13］對線蟲18S rDNA V4區(qū)進行擴增。PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反應(yīng)體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer（5 μmol/L）0.8 μL，Reverse Primer（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，滅菌PCR 水補足至20 μL。

2）線蟲（NF1FF/18Sr2bR）PCR 擴增條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 次循；72 ℃延伸10 min。擴增之后，PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳，使用AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒進行純化，并使用QuantiFluor-ST（Promega 公司）對回收產(chǎn)物進行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺（Illumina 公司）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴增片段構(gòu)建PE 300 文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300 平臺進行雙端測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

生物信息分析使用Trimmomatic 軟件對原始測序序列進行質(zhì)控，使用FLASH 軟件進行拼接。使用UPARSE 軟件，根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU聚類。數(shù)據(jù)整理采用Microsoft Excel 2007。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤基礎(chǔ)化學(xué)性質(zhì)和產(chǎn)量

與輪作比較，連作導(dǎo)致佛手山藥的產(chǎn)量降低了41.88%；連作對山藥塊莖的粗蛋白、全氮、全磷和全鉀養(yǎng)分含量影響不顯著（表1）。

表1 山藥塊莖氮磷鉀含量及產(chǎn)量

與輪作比較，連作導(dǎo)致土壤中堿解氮、有效磷、速效鉀和全氮分別提高了36.06%、10.41%、80.41%和12.77%。但是土壤中全磷、全鉀和pH 變化不顯著（表2）。

表2 土壤養(yǎng)分和pH 情況

2.2 土壤細(xì)菌、真菌和線蟲群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 土壤微生物α 多樣性 與輪作比較，連作導(dǎo)致土壤中細(xì)菌、真菌和線蟲的序列數(shù)分別降低了6.96%、12.78%和36.74%。連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌、真菌和和線蟲豐富度指數(shù)（ChaoI）分別降低了18.64%、6.26%和16.22%，多樣性指數(shù)（ShannonI）則分別降低了13.46%、10.38%和10.55%。連作降低了土壤微生物群落的多樣性（表3）。

表3 土壤細(xì)菌、真菌和線蟲多樣性

2.2.2 土壤細(xì)菌群落組成綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門是土壤優(yōu)勢菌群（相對豐度＞5%），共占到群落組成的86.08%～92.63%。輪作處理中細(xì)菌豐度排序是放線菌門（26.37%）＞變形菌門（20.20%）＞綠彎菌門（18.34%）＞厚壁菌門（13.01%）＞酸桿菌門（8.16%）＞芽單胞菌門＞擬桿菌門＞腐霉菌門。連作處理中細(xì)菌豐度排序是綠彎菌門（35.41%）＞放線菌門（25.48%）＞變形菌門（10.64%）＞厚壁菌門（10.44%）＞酸桿菌門（10.26%）＞芽單胞菌門＞腐霉菌門＞擬桿菌門。與輪作比較，連作導(dǎo)致綠彎菌門和酸桿菌門分別提高了93.08%和25.74%，但變形菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門和擬桿菌分別降低了47.33%、19.75%、41.35% 和67.19%（圖1A）。

細(xì)菌屬水平上，連作處理綠彎菌門中的norank_f__JG30-KF-AS9 屬占比最高（25.88%）。與輪作比較，連作顯著提高了綠彎菌門中norank_f__JG30-KF-AS9（3.13 倍）的豐度。連作導(dǎo)致變形菌門中的Chujaibacter 和鞘脂單胞菌屬、放線菌門中的節(jié)桿菌屬和地桿菌屬、厚壁菌門的芽孢桿菌屬和子囊菌門中的假絲酵母菌屬，分別降低了63.47%、65.86%、73.42%、70.57%、29.69% 和23.25%。輪作處理中other（＜0.01的細(xì)菌種群），所占的比例54.39%，而連作導(dǎo)致other（＜0.01的細(xì)菌種群）降低了32.08%，說明連作減少了細(xì)菌中稀有物種的多樣性（圖1B）。

圖1 細(xì)菌群落組成

2.2.3 土壤真菌群落組成 從門水平看出，不同處理下真菌群落的優(yōu)勢種群依次都是子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉菌門，三者占群落豐度的95%以上，在土壤真菌群落結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位。與輪作比較，連作導(dǎo)致子囊菌門降低了6.89%，擔(dān)子菌門和毛霉菌門分別提高了40.15%和100.28%（圖2A）。

從屬水平上看出，輪作處理中子囊菌門Plectosphaerella 豐度最高（34.63%），而連作處理中子囊菌門unclassified_o_Eurotiales 豐度最高（46.45%）。鐮孢屬Fusarium 在輪作和連作豐度分別是12.39%和11.76%，差異不大。與輪作比較，連作中unclassified_o__Eurotiales、Heterocephalacria 和纓霉屬Thysanophora 分別顯著提高了368.89%、269.16%和93.69%，然而Plectosphaerella 和孢霉屬Arthrinium 分別降低了95.16%和64.60%（圖2B）。

圖2 真菌群落組成

2.2.4 土壤線蟲群落組成 輪作和連作處理中線蟲門水平的豐度分別是0.05%和1.88%。綱水平下，線蟲色矛綱豐度分別是0.05%和1.33%。與輪作比較，連作土壤中線蟲類群的豐度顯著提高（圖3）。

圖3 線蟲群落組成

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

連作降低了佛手山藥的產(chǎn)量（41.88%）和土壤微生物群落多樣性，富集了土壤速效養(yǎng)分。在山藥連作和輪作下，土壤細(xì)菌、真菌群落和線蟲群落組成結(jié)構(gòu)出現(xiàn)較大差異。連作顯著提高綠彎菌門豐度，使其成為主要的優(yōu)勢類群，同時降低了變形菌門、厚壁菌門、芽單胞菌門和擬桿菌門豐度。連作和輪作處理中真菌優(yōu)勢種群都是子囊菌門和擔(dān)子菌門。連作降低了子囊菌門豐度，提高了擔(dān)子菌門和毛霉菌門豐度。連作土壤中線蟲類群的豐度顯著提高。

3.2 討論

3.2.1 理化性質(zhì)和產(chǎn)量 山藥連作導(dǎo)致土壤速效養(yǎng)分的富集尤其是有效磷和速效鉀，其中有效磷含量超過閾值106.2 mg/kg［14］，速效鉀最高達到644.48 mg/kg，極大地增加了養(yǎng)分淋失的風(fēng)險，這與農(nóng)戶習(xí)慣施肥有關(guān)。有研究指出有機肥、無機肥與微生物肥料的質(zhì)量比例為250～300∶10∶1，有利于山藥的生長，改善山藥品質(zhì)［15］。輪作顯著提高了山藥的產(chǎn)量，與宋佳承［9］指出輪作提高馬鈴薯產(chǎn)量的結(jié)論一致。

3.2.2 微生物多樣性 輪作提高了土壤細(xì)菌和真菌多樣性，與馬鈴薯-玉米輪作明顯提高了馬鈴薯根際土壤中細(xì)菌和真菌多樣性的結(jié)論一致［9］。連作降低土壤線蟲多樣性指數(shù)，與棉花連作10～15 年會發(fā)生土壤養(yǎng)分失衡，土壤線蟲多樣性降低的結(jié)論一致［16］。輪作的微生物多樣性高于連作，可能是水旱輪作模式下，土壤環(huán)境厭氧及好氧條件交替，土壤中的碳、氮循環(huán)加速所導(dǎo)致［17，18］。

3.2.3 微生物群落組成 佛手山藥土壤綠彎菌門、放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和酸桿菌門是優(yōu)勢菌群，與淮山藥根際土壤細(xì)菌在門水平上的主要優(yōu)勢菌群類似［19］。連作顯著提高了綠彎菌門豐度，卻降低了變形菌門的豐度；綠彎菌門可降解土壤纖維素等物質(zhì)，參與土壤碳循環(huán)［20］。變形菌參與了必需礦物質(zhì)營養(yǎng)的生物循環(huán)［21］，高比例的變形菌可能有助于改善土壤肥力，有助于植物生長［22］。連作改變細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，進而可能間接影響土壤肥力。連作導(dǎo)致細(xì)菌屬水平下豐度＜0.01的種群降低了32.08%，說明連作降低了細(xì)菌中稀有物種的多樣性。

輪作和連作處理真菌群落的優(yōu)勢種群依次是子囊菌門、擔(dān)子菌門和毛霉菌門，在土壤真菌群落結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位。屬水平上看出，輪作處理中Plectosphaerella 豐度最高（34.63%）；Plectosphaerella 種類存在不同的棲息地，地理分布廣泛［23，24］，大多數(shù)物種是病原體，在生產(chǎn)中可造成巨大損失［25］。連作處理中unclassified_o_Eurotiales 豐度最高（46.45%），Eurotiales 跟蘋果病害有關(guān)［26］。

土壤線蟲是一種豐富而普遍存在的生物，在營養(yǎng)循環(huán)、分解、害蟲和病原體種群調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著重要作用［27，28］。耕作和施肥等土壤管理能夠影響線蟲群落多樣性［29］。本研究表明，輪作提升了土壤線蟲群落的多樣性，降低了線蟲的物種豐度。