• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小麥miRNA啟動子的基因組分析

    2022-01-08 07:06:10任治鵬王多佳婁貴成王政委
    麥類作物學報 2021年12期
    關鍵詞:基序元件染色體

    任治鵬,王多佳,田 宇,婁貴成,李 暢,王政委,張 達,蒼 晶

    (東北農業(yè)大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

    MicroRNA(miRNA)是一類長度為21~24 nt的非編碼RNA,廣泛存在于植物中,通過負調控其靶基因,參與調控植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應[1-2]。miRNA的生物合成過程主要包括miRNA基因的轉錄、初始轉錄本加工為成熟miRNA以及成熟miRNA裝載形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)[3-7]。RISC通過酶切降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯,從而對靶基因進行轉錄后水平上的調控[8]。

    在植物中,能夠轉錄形成miRNA的miRNA基因大部分位于基因間隔區(qū),作為獨立的轉錄單位,只有部分miRNA基因位于蛋白質編碼基因內,能與宿主基因共同轉錄[9]。研究表明,miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,Pol Ⅱ)轉錄[10]。Pol Ⅱ型啟動子包括核心啟動子區(qū)和上游作用元件,核心啟動子區(qū)主要由TATA-box、轉錄起始位點(transcription start site,TSS)等構成[11]。了解miRNA基因的位置、啟動子的TSS、特定順式作用元件等上游序列特征,對于研究miRNA的表達模式及miRNA介導的調控網絡具有重要意義[12]。近年來,通過生物信息學分析結合高通量測序,對植物miRNA基因的啟動子開展了一定的研究。如在擬南芥中,Megraw等[13]和Xie等[14]通過5′-RACE的方法,發(fā)現大部分擬南芥miRNA啟動子包含TATA-box。Zhou等[15]通過CoVote的方法,在擬南芥、水稻等植物中鑒定了基因間miRNA基因的啟動子,結果表明,miRNA基因與蛋白質編碼基因均由Pol Ⅱ型啟動子啟動,并具有特定的上游元件。Zhao等[16]利用cDNA數據對水稻和擬南芥兩種植物miRNA啟動子元件進行比較,同時通過ChIP方法對擬南芥miRNA基因的TSS進行了預測[17]。隨著植物基因組研究的發(fā)展,促進了miRNA啟動子的鑒定和研究。如Cui等[18]通過基因組數據,定位了水稻miRNA前體(miRNA precursor,pre-miRNA)在染色體上的位置,并通過TSSP軟件預測了miRNA基因的TSS、TATA-box等核心啟動子區(qū)。Liu等[19]和Han等[20]利用大豆基因組數據對miRNA基因的啟動子特征進行了相關分析。Kanjanawattanawong[21]等發(fā)現,橡膠樹中對乙烯響應的miRNA啟動子具有多種植物激素相關作用元件。Zhou等[22]利用TSSP-TCM軟件對擬南芥、毛果楊、水稻、高粱4種植物的miRNA啟動子進行生物信息學分析,發(fā)現基因間和基因內以及保守和非保守miRNA的啟動子具有不同的基因組分布特征及特異性作用元件。此外,研究者在擬南芥[23]、水稻[24]miRNA啟動子中也發(fā)現具有與脅迫相關的特異性轉錄因子結合元件。

    六倍體(2n=6x=42,AABBDD)普通小麥(TriticumaestivumL.)是全球種植最廣泛的農作物之一,為人類提供了20%的消耗能量[25]。目前,對小麥miRNA的研究主要集中于克隆鑒定、表達特征分析以及通過預測靶基因進行功能研究等方面[25-26],然而關于小麥miRNA啟動子的研究報道較少。近年來,國際小麥基因組測序聯盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium,IWGSC)對中國春小麥基因組的組裝工作已經完成,其公布的小麥全基因組序列信息對于小麥miRNA啟動子的分析研究具有極大的促進作用。本研究通過生物信息學方法對miRNA基因組位置分布、miRNA啟動子預測以及順式作用元件的富集和特異性進行研究,以期在基因組水平對小麥miRNA啟動子有一個較為全面的了解,為小麥miRNA的轉錄調控探究以及新miRNA的預測提供依據。

    1 材料與方法

    1.1 小麥miRNA基因位置的預測

    所有的小麥miRNA序列來源于miRBase數據庫(Release 22.1,http://www.mirbase.org/)[27]。從Ensembl Plants(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-48/fasta/triticum_aestivum/dna/)下載中國春小麥基因組序列信息。使用URGI BLAST(https://urgi.versailles.inrae.fr/blast/?dbgroup=wheat_iwgsc_refseq_v2_chromosomes&program=blastn)[28]進行小麥pre-miRNA的基因組定位,選擇identities=100%的blast結果作為miRNA基因的位置,對于identities≠100%的miRNA則將identities≥97%且mismatches≤2的結果作為miRNA基因的位置[19]。預測的miRNA基因通過Mapchart 2.30[29]軟件進行小麥染色體圖譜的繪制。所有能夠定位于小麥基因組上的miRNA基因根據兩種方法進行分類,第一種分類方法是根據miRNA保守性分為保守和非保守miRNA基因,鑒定方法如下:首先利用miRBase提供的所有物種pre-miRNA序列建立本地blast庫,然后將所有小麥pre-miRNA進行本地blast比對。如果其他植物中存在identities>85%且alignment length>90%的相似序列[22],則該基因為小麥保守miRNA基因,否則為非保守性miRNA基因。第二種分類方法則根據miRNA基因在染色體上的位置進行分類,通過JBrowse(https://urgi.versailles.inra.fr/jbrowseiwgsc/gmod_jbrowse/)[30]判斷miRNA基因的分布情況,將miRNA基因分為基因間和基因內兩種類型。基因間miRNA位于蛋白質編碼基因之間,而基因內miRNA序列位置則與蛋白質編碼基因重疊[15]。判斷miRNA基因染色體位置參考的編碼蛋白質基因數據為IWGSC中國春Annotation v1.1數據庫[31],包括可高信度(HC)和低信度(LC)蛋白質編碼基因座。

    1.2 小麥miRNA基因啟動子的預測

    首先通過Zhou等[15]的方法獲得pre-miRNA的基因間5′端上游序列,當pre-miRNA與上游蛋白質編碼基因轉錄方向相同時,如果它們之間的距離大于2 400 bp,則檢索pre-miRNA上游2 000 bp序列;如果距離小于2 400 bp,則檢索上游蛋白質編碼基因下游400 bp與pre-miRNA之間的序列。當pre-miRNA及其上游蛋白質編碼基因轉錄方向相反時,如果它們之間的距離大于4 000 bp,則獲取pre-miRNA上游的2 000 bp序列,如果距離小于4 000 bp,則檢索從pre-miRNA到中間點(上游蛋白質編碼基因與pre-miRNA之間)的序列。將以上方法獲得的序列作為潛在的啟動子預測區(qū)域,利用TSSP(http://www.softberry.com)進行小麥miRNA啟動子及TSS的預測。

    1.3 小麥miRNA基因啟動子上游順式作用元件的分析

    利用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[32]對miRNA啟動子TSS到上游2 000 bp序列中的順式作用元件進行分析。對于有多個啟動子的miRNA基因,為獲得盡可能多的順式作用元件信息,選擇距離pre-miRNA起始位點最近的TSS進行分析。為了進一步研究miRNA啟動子區(qū)域基序的特異性,通過MEME(https://meme-suite.org/meme//tools/meme)[33]對miRNA啟動子上游序列中長度為10 bp的基序進行鑒定,選擇結果中前20個基序進行分析,其他設定為默認值。利用全基因組蒙特卡羅模擬方法獲得基序的Z-score,從而判斷各基序在小麥miRNA啟動子的特異性[15],具體方法如下:首先將所有獲得的miRNA啟動子序列作為目標集,然后在小麥基因組上隨機選擇長度為2 000 bp的序列作為參考集,參考集與目標集的序列數目相同;通過FIMO(https://meme-suite.org/meme//tools/fimo)統(tǒng)計特定基序在目標集和參考集miRNA序列上平均數量,分別記為Nt和Nr。Z-score的計算公式為Z=(Nt/Nr)=σ,它能測量目標集中的基序平均出現次數與參考集樣本的均值之間的歸一化差異[22]。利用CpGPlot(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cpgplot)對小麥miRNA TSS上游序列中的CpG島進行分析。

    2 結果與分析

    2.1 小麥miRNA基因的染色體定位

    目前為止,miRBase數據庫(Release 22.1)共收錄122個小麥pre-miRNA序列。小麥pre-miRNA序列和中國春基因組序列blast結果表明,105個(86.1%)pre-miRNA定位于小麥染色體上的150個基因座上,而其余17個(13.9%)pre-miRNA位于未知染色體或基因組的基因座上,下文中不對此類pre-miRNA進行統(tǒng)計。pre-miRNA分布在小麥所有42條染色體上,其中A組染色體上有54個,B染色體上有56個,而D組染色體上有40個,93個(76.2%)pre-miRNA在染色體上只有1個拷貝,含有2個和2個以上拷貝的pre-miRNA分別有4和8個,共占比 9.84%,其他17個pre-miRNA的拷貝為0。

    2.2 小麥miRNA基因的啟動子預測結果

    150個小麥miRNA基因座中有148個能夠獲得啟動子潛在區(qū)域,對148個miRNA基因座5’上游序列進行啟動子預測,由于部分miRNA基因座能夠預測到多個啟動子,因此共獲得166個miRNA潛在啟動子。115個(77.7%)小麥pre-miRNA基因能夠預測到一個啟動子,其中,69個基因的上游序列只能預測到一個啟動子,而其他基因具有多個啟動子。

    TSS是重要的啟動子核心元件,對小麥miRNA基因TSS位點與pre-miRNA距離分布進行統(tǒng)計分析,發(fā)現大部分小麥miRNA基因的TSS分布在上游0.8 kb區(qū)域內以及1.0~1.6 kb區(qū)域內,占全部啟動子TSS數的81.9%(0~0.8 kb:54.2%,1.0~1.6 kb:27.7%)。在所有上游區(qū)域中,小麥miRNA基因的TSS在上游0.2 kb區(qū)域內分布最多(24.1%),而在上游0.8~1.0 kb區(qū)域分布較少(5.4%)。

    根據miRNA在基因組的位置不同,可分為基因間miRNA和基因內miRNA,從圖1A可以看出,兩種miRNA的TSS均在基因上游0.2 kb區(qū)域內分布較多,不同的是基因內miRNA在上游0.2~0.4 kb、0.6~0.8 kb、1.4~1.6 kb間也具有較多的TSS分布,而基因間miRNA在這幾個區(qū)域內無明顯的分布特殊性。根據miRNA的保守性,可分為保守性miRNA和非保守性miRNA,從圖1B可以看出,兩種miRNA的TSS均在基因上游0.2 kb區(qū)域內分布最多,而與非保守miRNA相比,保守miRNA在上游1.4~1.6 kb區(qū)域內也具有較多分布。

    A:基因間和基因內miRNA TSS的分布百分比;B:非保守和保守miRNA TSS的分布百分比。

    2.3 小麥miRNA基因啟動子上游的特異性順式作用元件

    利用PlantCARE對所有miRNA基因TSS上游2 000 bp序列進行順式作用元件分析,結果(圖2)表明,miRNA啟動子區(qū)域中含有的三種順式作用元件較多,分別為CAAT-box、TATA-box和Unnamed_4。此外與ABA響應相關的元件(ABRE)、與MeJA響應相關的元件(TGACG-motif、CGTCA-motif和MYC)、與光響應相關的元件(G-box)以及與多種脅迫和代謝調控相關的元件(MYB)在小麥miRNA基因上游的占比也較高。

    圖中數據為啟動子上游順式作用元件所占百分比。

    為進一步鑒定小麥miRNA基因啟動子上的基序特異性,通過MEME獲得在TSS上游序列出現頻率較高的且長度為10 bp的基序,然后利用全基因組的蒙特卡羅模擬計算獲得基序的Z-score。Z-score的大小在一定程度上能反應基序在miRNA啟動子上的特異性,Z-score大于2的基序具有miRNA基因啟動子特異性,與miRNA的轉錄調控有關的可能性較高[22];而Z-score小于2的基序在其他基因組區(qū)域普遍存在,因此不作為miRNA啟動子重要基序進行研究。根據以上標準,獲得了3個Z-score≥2的小麥miRNA啟動子特異性基序(表1)。

    表1 小麥miRNA基因啟動子特異性基序

    除順式作用元件外,CpG島也是真核生物polⅡ型啟動子的重要特征之一。由于本研究中MIR9670和MIE979可能通過同一個啟動子進行轉錄,因此對114個miRNA基因啟動子的CpG島進行分析,CpGPlot預測結果表明, 61.4%的小麥miRNA基因TSS上游序列有CpG島分布,啟動子區(qū)域含有1、2、3和4個CpG島的miRNA基因分別有41、17、10、2個。

    3 討 論

    本研究首先將miRBase數據庫目前登錄的所有小麥pre-miRNA序列定位于小麥基因組上,在122個pre-miRNA中有部分序列無法通過blast獲得基因座,其可能原因為:(1)基因位于數據庫中的未知染色體上;(2)pre-miRNA的序列信息不完全,或所研究品種的pre-miRNA序列與參考的中國春基因組序列存在差異;(3)由于小麥基因組較大,組裝困難,目前提供的基因組版本存在部分染色體序列的缺失。本研究染色體定位結果表明,所有小麥染色體上均存在miRNA基因。前人研究表明,在三個染色體組中,B組染色體上的miRNA基因分布最多,根據IWGSC數據庫,編碼蛋白的基因也在B組染色體上的分布最多[21]。本研究選擇blast結果為100%的染色體位置為miRNA基因座,因此多拷貝的miRNA基因序列相同。具有多拷貝的miRNA基因中,只有MIR6197和MIR9774在三個染色體組上均具有拷貝,其他基因只在一個或兩個染色體組上具有拷貝,這說明大部分基因在不同染色體組上存在序列不同的情況。在動物中,miRNA基因通常聚簇并形成多順反子RNA共轉錄,而只有部分植物miRNA基因存在成簇miRNA。與非成簇miRNA不同,成簇的多個miRNA可通過同一個啟動子進行轉錄[18]。Singh等[34]研究表明,小麥中209個miRNA存在于89個多順反子基因座上。本研究中,由于使用的miRBase數據庫的注釋miRNA信息有限,只發(fā)現了1個小麥miRNA簇,該miRNA簇中的MIR9670和MIR9779位于6D染色體上,為非保守miRNA,未在Singh等[35]的研究中報道。對MIR9670和MIR9779的啟動子預測結果發(fā)現,只有一個miRNA啟動子位于上游序列,說明這兩個miRNA可能通過同一個啟動子進行轉錄。小麥成簇miRNA的啟動子特點可通過其他miRNA庫進行更深層次的研究。

    150個miRNA基因中有148個具有啟動子潛在區(qū)域,MIR1133和MIR1135基因與上游蛋白質編碼基因距離過近,無法獲得啟動子區(qū)域。本研究通過TSSP對小麥miRNA基因的polⅡ型啟動子進行了預測,結果表明,大部分pre-miRNA(77.7%)上游具有潛在的啟動子序列,而少部分miRNA基因無法預測到啟動子,原因可能為:(1)原始miRNA序列較長,利用pri-RNA加工后形成pre-miRNA序列信息進行啟動子預測,其啟動子可能位于pre-miRNA的上游2 kb以外;(2)大多數啟動子預測軟件都使用同源搜索的方法,因此可能無法預測miRNA啟動子的非保守性啟動子;(3)由于基因組的重復性,部分基因組上具有多個拷貝的pre-miRNA序列為假基因,不發(fā)生轉錄,因此無法進行啟動子預測[19]。miRNA根據基因位置分為基因間miRNA和基因內miRNA,基因內miRNA通常與宿主基因共同轉錄,但Cui等[18]的研究表明,基因內miRNA也可能具有單獨的啟動子,形成獨立的轉錄本。本研究對基因內miRNA和基因間miRNA啟動子數目分別進行了統(tǒng)計,發(fā)現74.3%的基因內miRNA至少具有1個polⅡ型啟動子。以上結果表明,小麥中相當一部分的基因內miRNA也同樣具有獨立的啟動子,而未預測到啟動子的基因內miRNA則可能由宿主基因啟動子啟動轉錄。

    TSS是基因的轉錄起始位點,因此TSS的預測對于miRNA基因轉錄特點的研究具有一定的意義。本研究對TSS與pre-miRNA的距離進行統(tǒng)計分析,結果表明,TSS大多數位于pre-miRNA序列上游800 bp內,尤其上游200 bp內。該結果與大豆和水稻中的miRNA基因TSS統(tǒng)計結果類似[18-19],這說明小麥等植物的大多數miRNA核心啟動子區(qū)域與pre-miRNA序列比較接近,miRNA的PolⅡ啟動子近端區(qū)域的核心啟動子區(qū)可能對miRNA的轉錄起到更大的作用。

    植物基因啟動子上的順式作用元件能夠識別結合特定的轉錄因子,從而對基因的轉錄進行相應的時空特異性調控[24]。本研究對TSS上游序列進行了順式作用元件分析,結果表明,miRNA基因啟動子區(qū)域存在多種順式作用元件。其中TATA-box最多,TATA-box是一種廣泛存在的DNA基序,擬南芥和水稻中miRNA特異性基序的功能尚不清楚,但新發(fā)現的基序對于在小麥中鑒定新的特異性miRNA以及進行miRNA的試驗分析具有一定的借鑒意義。除順式作用元件外,CpG島也是重要的啟動子序列特征[35]。本研究在小麥中部分miRNA基因上游序列鑒定出了CpG島,而前人在擬南芥miRNA啟動子中未鑒定到CpG島,水稻miRNA啟動子中鑒定出的CpG島也較少[15],煙草中的MIR169基因家族中也未鑒定到CpG島的存在[36]。以上結果說明,小麥、水稻等單子葉植物中,CpG島的分布情況可能與雙子葉植物不同。

    miRNA在植物的基因調控中起到了重要作用,啟動子是控制miRNA基因表達的重要結構,因此對于miRNA基因啟動子的分析研究具有較大的意義。本研究利用公布的小麥基因組信息對小麥miRNA啟動子進行了分析,研究了小麥miRNA的染色體定位以及TSS分布、順式作用元件特異性等啟動子特征,相關結果對于小麥miRNA表達調控的研究及新miRNA的預測具有一定的借鑒意義。在未來的研究中,隨著小RNA測序以及分子實驗技術的進步,可獲得更多的miRNA功能信息,并結合試驗方法對相關結果進行進一步的驗證。

    猜你喜歡
    基序元件染色體
    EPIYA 基序與幽門螺桿菌感染相關胃病關系的研究進展
    新醫(yī)學(2023年10期)2023-12-09 15:04:51
    帶TRS基序突變的新型冠狀病毒威脅更大
    芥藍Aux/IAA家族基因生物信息學與表達分析
    多一條X染色體,壽命會更長
    科學之謎(2019年3期)2019-03-28 10:29:44
    為什么男性要有一條X染色體?
    科學之謎(2018年8期)2018-09-29 11:06:46
    能忍的人壽命長
    QFN元件的返工指南
    再論高等植物染色體雜交
    在新興產業(yè)看小元件如何發(fā)揮大作用
    寶馬i3高電壓元件介紹(上)
    亚洲天堂国产精品一区在线| 黄色片一级片一级黄色片| a级毛片在线看网站| 国产精品av久久久久免费| 亚洲成人国产一区在线观看| 青草久久国产| 久久伊人香网站| 99国产精品99久久久久| 亚洲精品在线美女| 男女床上黄色一级片免费看| 香蕉国产在线看| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美不卡视频在线免费观看 | 亚洲欧美激情综合另类| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产野战对白在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产亚洲av高清不卡| 熟女电影av网| 久久久久久免费高清国产稀缺| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 长腿黑丝高跟| a级毛片a级免费在线| 丝袜美腿诱惑在线| 男女视频在线观看网站免费 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产免费av片在线观看野外av| 极品教师在线免费播放| 三级毛片av免费| 脱女人内裤的视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 欧美午夜高清在线| 俺也久久电影网| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 91在线观看av| 亚洲真实伦在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人av教育| 免费在线观看日本一区| 国产高清视频在线播放一区| www.999成人在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 久久人妻av系列| 亚洲av五月六月丁香网| 国产精品av视频在线免费观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产一区在线观看成人免费| 一级片免费观看大全| 中出人妻视频一区二区| 色老头精品视频在线观看| 成人国产一区最新在线观看| 91成年电影在线观看| 久99久视频精品免费| xxx96com| 午夜视频精品福利| 久久久久久大精品| 欧美黄色淫秽网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 夜夜爽天天搞| 免费看日本二区| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲全国av大片| 国产av不卡久久| 欧美乱妇无乱码| 中文字幕最新亚洲高清| 全区人妻精品视频| 在线免费观看的www视频| 中国美女看黄片| 日本三级黄在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 99久久精品热视频| 桃红色精品国产亚洲av| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产午夜福利久久久久久| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲男人天堂网一区| 日本一二三区视频观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲专区国产一区二区| 免费高清视频大片| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 成人特级黄色片久久久久久久| 久久99热这里只有精品18| 日本a在线网址| 性欧美人与动物交配| 国产精品乱码一区二三区的特点| 在线观看一区二区三区| 制服诱惑二区| 男男h啪啪无遮挡| 嫩草影视91久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99精品久久久久人妻精品| 日日爽夜夜爽网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 俄罗斯特黄特色一大片| 日本在线视频免费播放| 我的老师免费观看完整版| 国产av不卡久久| 亚洲人与动物交配视频| 欧美性长视频在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久久久国内视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产高清视频在线观看网站| xxxwww97欧美| 国产黄片美女视频| 国产高清视频在线观看网站| 国产97色在线日韩免费| av免费在线观看网站| 1024香蕉在线观看| 妹子高潮喷水视频| 国产成年人精品一区二区| 精品欧美国产一区二区三| 免费在线观看日本一区| 亚洲精品一区av在线观看| 黄频高清免费视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 不卡一级毛片| 听说在线观看完整版免费高清| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲熟妇熟女久久| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 床上黄色一级片| 免费在线观看成人毛片| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 黄片大片在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| a在线观看视频网站| 精品国产乱子伦一区二区三区| 欧美一区二区精品小视频在线| 色综合站精品国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 中文字幕高清在线视频| 丁香欧美五月| 久久九九热精品免费| 精品高清国产在线一区| 精品久久久久久,| 一级片免费观看大全| 99热这里只有是精品50| 国产野战对白在线观看| 青草久久国产| 老司机深夜福利视频在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产伦一二天堂av在线观看| 免费在线观看完整版高清| 制服诱惑二区| 亚洲午夜理论影院| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久午夜亚洲精品久久| 国产亚洲精品一区二区www| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产成人影院久久av| 99精品在免费线老司机午夜| 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲精华国产精华精| 国产在线精品亚洲第一网站| 嫩草影视91久久| 大型av网站在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久久国产欧美日韩av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲人成网站高清观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 精品久久久久久久末码| 一本精品99久久精品77| 亚洲最大成人中文| 男人舔女人下体高潮全视频| 制服丝袜大香蕉在线| 国产麻豆成人av免费视频| 中文在线观看免费www的网站 | 变态另类丝袜制服| 久久久国产成人免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美日本视频| 亚洲全国av大片| 亚洲精品色激情综合| 色播亚洲综合网| 国产97色在线日韩免费| 91在线观看av| 日韩免费av在线播放| 99精品欧美一区二区三区四区| 夜夜爽天天搞| 中文在线观看免费www的网站 | 人成视频在线观看免费观看| 国产激情久久老熟女| 国产免费男女视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产又色又爽无遮挡免费看| 热99re8久久精品国产| 成年版毛片免费区| 香蕉丝袜av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 波多野结衣高清无吗| 国产精品久久视频播放| 成人永久免费在线观看视频| 久久久久久国产a免费观看| 久久国产精品影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日本在线视频免费播放| 国产在线观看jvid| 99精品久久久久人妻精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久人人精品亚洲av| 两性夫妻黄色片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 欧美一级毛片孕妇| 午夜免费成人在线视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久亚洲真实| 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品一区二区三区四区久久| www.熟女人妻精品国产| 久久久久亚洲av毛片大全| 免费看十八禁软件| 757午夜福利合集在线观看| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国模一区二区三区四区视频 | 欧美日本亚洲视频在线播放| av福利片在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 丝袜美腿诱惑在线| 在线国产一区二区在线| 深夜精品福利| 正在播放国产对白刺激| 午夜a级毛片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产在线精品亚洲第一网站| 丰满的人妻完整版| 欧美极品一区二区三区四区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一区二区三区高清视频在线| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲欧美日韩东京热| 19禁男女啪啪无遮挡网站| www.熟女人妻精品国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av熟女| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久亚洲精品不卡| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 中文资源天堂在线| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 三级国产精品欧美在线观看 | 日韩欧美国产在线观看| 草草在线视频免费看| 国产69精品久久久久777片 | 九色成人免费人妻av| 国产久久久一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 黑人操中国人逼视频| 五月玫瑰六月丁香| 两个人看的免费小视频| 一进一出好大好爽视频| 成熟少妇高潮喷水视频| www日本黄色视频网| 国产成人av教育| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 91国产中文字幕| 白带黄色成豆腐渣| 99国产精品一区二区蜜桃av| 757午夜福利合集在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av成人av| 两个人看的免费小视频| 国产精品,欧美在线| 国产成人啪精品午夜网站| 成人三级黄色视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产一级毛片七仙女欲春2| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品福利观看| 老鸭窝网址在线观看| 99国产精品一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 日韩大尺度精品在线看网址| www.999成人在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美在线黄色| 国产亚洲欧美98| 老熟妇仑乱视频hdxx| 青草久久国产| 999久久久精品免费观看国产| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 欧美不卡视频在线免费观看 | 婷婷精品国产亚洲av| 午夜亚洲福利在线播放| 搞女人的毛片| 一夜夜www| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲欧美日韩东京热| 久久中文字幕一级| 99久久99久久久精品蜜桃| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 黄片小视频在线播放| 色尼玛亚洲综合影院| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜成年电影在线免费观看| 日本 av在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲国产精品sss在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 99久久精品国产亚洲精品| 大型黄色视频在线免费观看| 很黄的视频免费| www.自偷自拍.com| av片东京热男人的天堂| 国产三级在线视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| √禁漫天堂资源中文www| 国产真人三级小视频在线观看| 少妇的丰满在线观看| 亚洲美女黄片视频| 特大巨黑吊av在线直播| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 成人三级做爰电影| 欧美av亚洲av综合av国产av| 色av中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 一二三四社区在线视频社区8| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久久久久久久黄片| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久精品国产综合久久久| 国产精品精品国产色婷婷| 在线国产一区二区在线| 我要搜黄色片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲专区字幕在线| cao死你这个sao货| 国产精品免费视频内射| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看免费日韩欧美大片| 悠悠久久av| 1024手机看黄色片| 999精品在线视频| 一级作爱视频免费观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 999久久久国产精品视频| 国产真实乱freesex| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲成av人片免费观看| 身体一侧抽搐| 三级毛片av免费| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 日韩精品免费视频一区二区三区| 一本精品99久久精品77| 久久久水蜜桃国产精品网| 波多野结衣巨乳人妻| 成在线人永久免费视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩高清综合在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 在线观看免费午夜福利视频| 最好的美女福利视频网| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久亚洲精品不卡| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久精品综合一区二区三区| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日韩大码丰满熟妇| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产成人aa在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 少妇的丰满在线观看| 午夜a级毛片| 国产人伦9x9x在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 亚洲成av人片在线播放无| 黄频高清免费视频| 又紧又爽又黄一区二区| 在线观看日韩欧美| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩有码中文字幕| 国产野战对白在线观看| 国产久久久一区二区三区| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲无线在线观看| 99国产精品一区二区三区| 日本 欧美在线| 午夜两性在线视频| 99久久国产精品久久久| www日本黄色视频网| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产av一区二区精品久久| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲精品粉嫩美女一区| 91九色精品人成在线观看| 岛国在线免费视频观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 久久香蕉激情| 精品久久久久久,| 日本三级黄在线观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 亚洲精品中文字幕在线视频| 青草久久国产| 亚洲真实伦在线观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产91精品成人一区二区三区| 99热这里只有是精品50| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 欧美不卡视频在线免费观看 | av天堂在线播放| 成人三级做爰电影| 男女床上黄色一级片免费看| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品国产高清国产av| www.www免费av| 亚洲成人久久性| 桃色一区二区三区在线观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本a在线网址| 全区人妻精品视频| aaaaa片日本免费| 日本 av在线| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品精品国产色婷婷| 国语自产精品视频在线第100页| 俺也久久电影网| 女同久久另类99精品国产91| 午夜老司机福利片| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 午夜精品一区二区三区免费看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产乱人伦免费视频| 久9热在线精品视频| 亚洲成人精品中文字幕电影| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品美女久久av网站| 又黄又粗又硬又大视频| 禁无遮挡网站| 久久国产乱子伦精品免费另类| 正在播放国产对白刺激| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产黄片美女视频| 一进一出抽搐动态| 国产主播在线观看一区二区| 黄色毛片三级朝国网站| 大型av网站在线播放| 老汉色∧v一级毛片| 成人国语在线视频| 免费在线观看完整版高清| 欧美日本视频| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美国产日韩亚洲一区| 91成年电影在线观看| 午夜激情av网站| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 免费av毛片视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产成人精品无人区| 久久婷婷成人综合色麻豆| www国产在线视频色| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 午夜福利视频1000在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产片内射在线| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一本一本综合久久| 五月伊人婷婷丁香| 国内精品久久久久精免费| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 小说图片视频综合网站| xxxwww97欧美| 99热只有精品国产| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 男插女下体视频免费在线播放| 久久人人精品亚洲av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 一夜夜www| 国产乱人伦免费视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲美女视频黄频| 精品高清国产在线一区| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 黄色视频,在线免费观看| 久久香蕉精品热| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 757午夜福利合集在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 搡老岳熟女国产| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| av视频在线观看入口| 午夜福利高清视频| www.熟女人妻精品国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 国产乱人伦免费视频| 久久这里只有精品19| 久久精品国产清高在天天线| 中文资源天堂在线| 午夜精品在线福利| 五月伊人婷婷丁香| 麻豆一二三区av精品| 亚洲五月天丁香| av中文乱码字幕在线| 99热这里只有是精品50| 成人午夜高清在线视频| 999久久久国产精品视频| 国产片内射在线| 我要搜黄色片| 日韩欧美 国产精品| 色尼玛亚洲综合影院| av在线天堂中文字幕| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美极品一区二区三区四区| 国产三级黄色录像| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人欧美在线观看| 天堂√8在线中文| 国产精品一区二区精品视频观看| 免费在线观看亚洲国产| 男女床上黄色一级片免费看| 婷婷亚洲欧美| 欧美色欧美亚洲另类二区| 天堂动漫精品| 老司机在亚洲福利影院| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲av五月六月丁香网| xxxwww97欧美| 国产av不卡久久| 在线观看66精品国产| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 婷婷精品国产亚洲av| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美又色又爽又黄视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品一区二区三区四区久久| 免费一级毛片在线播放高清视频| 九九热线精品视视频播放| 不卡av一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 欧美黑人欧美精品刺激| √禁漫天堂资源中文www|