• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    小麥miRNA啟動子的基因組分析

    2022-01-08 07:06:10任治鵬王多佳婁貴成王政委
    麥類作物學報 2021年12期
    關鍵詞:基序元件染色體

    任治鵬,王多佳,田 宇,婁貴成,李 暢,王政委,張 達,蒼 晶

    (東北農業(yè)大學生命科學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

    MicroRNA(miRNA)是一類長度為21~24 nt的非編碼RNA,廣泛存在于植物中,通過負調控其靶基因,參與調控植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應[1-2]。miRNA的生物合成過程主要包括miRNA基因的轉錄、初始轉錄本加工為成熟miRNA以及成熟miRNA裝載形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)[3-7]。RISC通過酶切降解靶基因mRNA或者抑制靶基因mRNA的翻譯,從而對靶基因進行轉錄后水平上的調控[8]。

    在植物中,能夠轉錄形成miRNA的miRNA基因大部分位于基因間隔區(qū),作為獨立的轉錄單位,只有部分miRNA基因位于蛋白質編碼基因內,能與宿主基因共同轉錄[9]。研究表明,miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,Pol Ⅱ)轉錄[10]。Pol Ⅱ型啟動子包括核心啟動子區(qū)和上游作用元件,核心啟動子區(qū)主要由TATA-box、轉錄起始位點(transcription start site,TSS)等構成[11]。了解miRNA基因的位置、啟動子的TSS、特定順式作用元件等上游序列特征,對于研究miRNA的表達模式及miRNA介導的調控網絡具有重要意義[12]。近年來,通過生物信息學分析結合高通量測序,對植物miRNA基因的啟動子開展了一定的研究。如在擬南芥中,Megraw等[13]和Xie等[14]通過5′-RACE的方法,發(fā)現大部分擬南芥miRNA啟動子包含TATA-box。Zhou等[15]通過CoVote的方法,在擬南芥、水稻等植物中鑒定了基因間miRNA基因的啟動子,結果表明,miRNA基因與蛋白質編碼基因均由Pol Ⅱ型啟動子啟動,并具有特定的上游元件。Zhao等[16]利用cDNA數據對水稻和擬南芥兩種植物miRNA啟動子元件進行比較,同時通過ChIP方法對擬南芥miRNA基因的TSS進行了預測[17]。隨著植物基因組研究的發(fā)展,促進了miRNA啟動子的鑒定和研究。如Cui等[18]通過基因組數據,定位了水稻miRNA前體(miRNA precursor,pre-miRNA)在染色體上的位置,并通過TSSP軟件預測了miRNA基因的TSS、TATA-box等核心啟動子區(qū)。Liu等[19]和Han等[20]利用大豆基因組數據對miRNA基因的啟動子特征進行了相關分析。Kanjanawattanawong[21]等發(fā)現,橡膠樹中對乙烯響應的miRNA啟動子具有多種植物激素相關作用元件。Zhou等[22]利用TSSP-TCM軟件對擬南芥、毛果楊、水稻、高粱4種植物的miRNA啟動子進行生物信息學分析,發(fā)現基因間和基因內以及保守和非保守miRNA的啟動子具有不同的基因組分布特征及特異性作用元件。此外,研究者在擬南芥[23]、水稻[24]miRNA啟動子中也發(fā)現具有與脅迫相關的特異性轉錄因子結合元件。

    六倍體(2n=6x=42,AABBDD)普通小麥(TriticumaestivumL.)是全球種植最廣泛的農作物之一,為人類提供了20%的消耗能量[25]。目前,對小麥miRNA的研究主要集中于克隆鑒定、表達特征分析以及通過預測靶基因進行功能研究等方面[25-26],然而關于小麥miRNA啟動子的研究報道較少。近年來,國際小麥基因組測序聯盟(International Wheat Genome Sequencing Consortium,IWGSC)對中國春小麥基因組的組裝工作已經完成,其公布的小麥全基因組序列信息對于小麥miRNA啟動子的分析研究具有極大的促進作用。本研究通過生物信息學方法對miRNA基因組位置分布、miRNA啟動子預測以及順式作用元件的富集和特異性進行研究,以期在基因組水平對小麥miRNA啟動子有一個較為全面的了解,為小麥miRNA的轉錄調控探究以及新miRNA的預測提供依據。

    1 材料與方法

    1.1 小麥miRNA基因位置的預測

    所有的小麥miRNA序列來源于miRBase數據庫(Release 22.1,http://www.mirbase.org/)[27]。從Ensembl Plants(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-48/fasta/triticum_aestivum/dna/)下載中國春小麥基因組序列信息。使用URGI BLAST(https://urgi.versailles.inrae.fr/blast/?dbgroup=wheat_iwgsc_refseq_v2_chromosomes&program=blastn)[28]進行小麥pre-miRNA的基因組定位,選擇identities=100%的blast結果作為miRNA基因的位置,對于identities≠100%的miRNA則將identities≥97%且mismatches≤2的結果作為miRNA基因的位置[19]。預測的miRNA基因通過Mapchart 2.30[29]軟件進行小麥染色體圖譜的繪制。所有能夠定位于小麥基因組上的miRNA基因根據兩種方法進行分類,第一種分類方法是根據miRNA保守性分為保守和非保守miRNA基因,鑒定方法如下:首先利用miRBase提供的所有物種pre-miRNA序列建立本地blast庫,然后將所有小麥pre-miRNA進行本地blast比對。如果其他植物中存在identities>85%且alignment length>90%的相似序列[22],則該基因為小麥保守miRNA基因,否則為非保守性miRNA基因。第二種分類方法則根據miRNA基因在染色體上的位置進行分類,通過JBrowse(https://urgi.versailles.inra.fr/jbrowseiwgsc/gmod_jbrowse/)[30]判斷miRNA基因的分布情況,將miRNA基因分為基因間和基因內兩種類型。基因間miRNA位于蛋白質編碼基因之間,而基因內miRNA序列位置則與蛋白質編碼基因重疊[15]。判斷miRNA基因染色體位置參考的編碼蛋白質基因數據為IWGSC中國春Annotation v1.1數據庫[31],包括可高信度(HC)和低信度(LC)蛋白質編碼基因座。

    1.2 小麥miRNA基因啟動子的預測

    首先通過Zhou等[15]的方法獲得pre-miRNA的基因間5′端上游序列,當pre-miRNA與上游蛋白質編碼基因轉錄方向相同時,如果它們之間的距離大于2 400 bp,則檢索pre-miRNA上游2 000 bp序列;如果距離小于2 400 bp,則檢索上游蛋白質編碼基因下游400 bp與pre-miRNA之間的序列。當pre-miRNA及其上游蛋白質編碼基因轉錄方向相反時,如果它們之間的距離大于4 000 bp,則獲取pre-miRNA上游的2 000 bp序列,如果距離小于4 000 bp,則檢索從pre-miRNA到中間點(上游蛋白質編碼基因與pre-miRNA之間)的序列。將以上方法獲得的序列作為潛在的啟動子預測區(qū)域,利用TSSP(http://www.softberry.com)進行小麥miRNA啟動子及TSS的預測。

    1.3 小麥miRNA基因啟動子上游順式作用元件的分析

    利用PlantCARE數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)[32]對miRNA啟動子TSS到上游2 000 bp序列中的順式作用元件進行分析。對于有多個啟動子的miRNA基因,為獲得盡可能多的順式作用元件信息,選擇距離pre-miRNA起始位點最近的TSS進行分析。為了進一步研究miRNA啟動子區(qū)域基序的特異性,通過MEME(https://meme-suite.org/meme//tools/meme)[33]對miRNA啟動子上游序列中長度為10 bp的基序進行鑒定,選擇結果中前20個基序進行分析,其他設定為默認值。利用全基因組蒙特卡羅模擬方法獲得基序的Z-score,從而判斷各基序在小麥miRNA啟動子的特異性[15],具體方法如下:首先將所有獲得的miRNA啟動子序列作為目標集,然后在小麥基因組上隨機選擇長度為2 000 bp的序列作為參考集,參考集與目標集的序列數目相同;通過FIMO(https://meme-suite.org/meme//tools/fimo)統(tǒng)計特定基序在目標集和參考集miRNA序列上平均數量,分別記為Nt和Nr。Z-score的計算公式為Z=(Nt/Nr)=σ,它能測量目標集中的基序平均出現次數與參考集樣本的均值之間的歸一化差異[22]。利用CpGPlot(http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/cpgplot)對小麥miRNA TSS上游序列中的CpG島進行分析。

    2 結果與分析

    2.1 小麥miRNA基因的染色體定位

    目前為止,miRBase數據庫(Release 22.1)共收錄122個小麥pre-miRNA序列。小麥pre-miRNA序列和中國春基因組序列blast結果表明,105個(86.1%)pre-miRNA定位于小麥染色體上的150個基因座上,而其余17個(13.9%)pre-miRNA位于未知染色體或基因組的基因座上,下文中不對此類pre-miRNA進行統(tǒng)計。pre-miRNA分布在小麥所有42條染色體上,其中A組染色體上有54個,B染色體上有56個,而D組染色體上有40個,93個(76.2%)pre-miRNA在染色體上只有1個拷貝,含有2個和2個以上拷貝的pre-miRNA分別有4和8個,共占比 9.84%,其他17個pre-miRNA的拷貝為0。

    2.2 小麥miRNA基因的啟動子預測結果

    150個小麥miRNA基因座中有148個能夠獲得啟動子潛在區(qū)域,對148個miRNA基因座5’上游序列進行啟動子預測,由于部分miRNA基因座能夠預測到多個啟動子,因此共獲得166個miRNA潛在啟動子。115個(77.7%)小麥pre-miRNA基因能夠預測到一個啟動子,其中,69個基因的上游序列只能預測到一個啟動子,而其他基因具有多個啟動子。

    TSS是重要的啟動子核心元件,對小麥miRNA基因TSS位點與pre-miRNA距離分布進行統(tǒng)計分析,發(fā)現大部分小麥miRNA基因的TSS分布在上游0.8 kb區(qū)域內以及1.0~1.6 kb區(qū)域內,占全部啟動子TSS數的81.9%(0~0.8 kb:54.2%,1.0~1.6 kb:27.7%)。在所有上游區(qū)域中,小麥miRNA基因的TSS在上游0.2 kb區(qū)域內分布最多(24.1%),而在上游0.8~1.0 kb區(qū)域分布較少(5.4%)。

    根據miRNA在基因組的位置不同,可分為基因間miRNA和基因內miRNA,從圖1A可以看出,兩種miRNA的TSS均在基因上游0.2 kb區(qū)域內分布較多,不同的是基因內miRNA在上游0.2~0.4 kb、0.6~0.8 kb、1.4~1.6 kb間也具有較多的TSS分布,而基因間miRNA在這幾個區(qū)域內無明顯的分布特殊性。根據miRNA的保守性,可分為保守性miRNA和非保守性miRNA,從圖1B可以看出,兩種miRNA的TSS均在基因上游0.2 kb區(qū)域內分布最多,而與非保守miRNA相比,保守miRNA在上游1.4~1.6 kb區(qū)域內也具有較多分布。

    A:基因間和基因內miRNA TSS的分布百分比;B:非保守和保守miRNA TSS的分布百分比。

    2.3 小麥miRNA基因啟動子上游的特異性順式作用元件

    利用PlantCARE對所有miRNA基因TSS上游2 000 bp序列進行順式作用元件分析,結果(圖2)表明,miRNA啟動子區(qū)域中含有的三種順式作用元件較多,分別為CAAT-box、TATA-box和Unnamed_4。此外與ABA響應相關的元件(ABRE)、與MeJA響應相關的元件(TGACG-motif、CGTCA-motif和MYC)、與光響應相關的元件(G-box)以及與多種脅迫和代謝調控相關的元件(MYB)在小麥miRNA基因上游的占比也較高。

    圖中數據為啟動子上游順式作用元件所占百分比。

    為進一步鑒定小麥miRNA基因啟動子上的基序特異性,通過MEME獲得在TSS上游序列出現頻率較高的且長度為10 bp的基序,然后利用全基因組的蒙特卡羅模擬計算獲得基序的Z-score。Z-score的大小在一定程度上能反應基序在miRNA啟動子上的特異性,Z-score大于2的基序具有miRNA基因啟動子特異性,與miRNA的轉錄調控有關的可能性較高[22];而Z-score小于2的基序在其他基因組區(qū)域普遍存在,因此不作為miRNA啟動子重要基序進行研究。根據以上標準,獲得了3個Z-score≥2的小麥miRNA啟動子特異性基序(表1)。

    表1 小麥miRNA基因啟動子特異性基序

    除順式作用元件外,CpG島也是真核生物polⅡ型啟動子的重要特征之一。由于本研究中MIR9670和MIE979可能通過同一個啟動子進行轉錄,因此對114個miRNA基因啟動子的CpG島進行分析,CpGPlot預測結果表明, 61.4%的小麥miRNA基因TSS上游序列有CpG島分布,啟動子區(qū)域含有1、2、3和4個CpG島的miRNA基因分別有41、17、10、2個。

    3 討 論

    本研究首先將miRBase數據庫目前登錄的所有小麥pre-miRNA序列定位于小麥基因組上,在122個pre-miRNA中有部分序列無法通過blast獲得基因座,其可能原因為:(1)基因位于數據庫中的未知染色體上;(2)pre-miRNA的序列信息不完全,或所研究品種的pre-miRNA序列與參考的中國春基因組序列存在差異;(3)由于小麥基因組較大,組裝困難,目前提供的基因組版本存在部分染色體序列的缺失。本研究染色體定位結果表明,所有小麥染色體上均存在miRNA基因。前人研究表明,在三個染色體組中,B組染色體上的miRNA基因分布最多,根據IWGSC數據庫,編碼蛋白的基因也在B組染色體上的分布最多[21]。本研究選擇blast結果為100%的染色體位置為miRNA基因座,因此多拷貝的miRNA基因序列相同。具有多拷貝的miRNA基因中,只有MIR6197和MIR9774在三個染色體組上均具有拷貝,其他基因只在一個或兩個染色體組上具有拷貝,這說明大部分基因在不同染色體組上存在序列不同的情況。在動物中,miRNA基因通常聚簇并形成多順反子RNA共轉錄,而只有部分植物miRNA基因存在成簇miRNA。與非成簇miRNA不同,成簇的多個miRNA可通過同一個啟動子進行轉錄[18]。Singh等[34]研究表明,小麥中209個miRNA存在于89個多順反子基因座上。本研究中,由于使用的miRBase數據庫的注釋miRNA信息有限,只發(fā)現了1個小麥miRNA簇,該miRNA簇中的MIR9670和MIR9779位于6D染色體上,為非保守miRNA,未在Singh等[35]的研究中報道。對MIR9670和MIR9779的啟動子預測結果發(fā)現,只有一個miRNA啟動子位于上游序列,說明這兩個miRNA可能通過同一個啟動子進行轉錄。小麥成簇miRNA的啟動子特點可通過其他miRNA庫進行更深層次的研究。

    150個miRNA基因中有148個具有啟動子潛在區(qū)域,MIR1133和MIR1135基因與上游蛋白質編碼基因距離過近,無法獲得啟動子區(qū)域。本研究通過TSSP對小麥miRNA基因的polⅡ型啟動子進行了預測,結果表明,大部分pre-miRNA(77.7%)上游具有潛在的啟動子序列,而少部分miRNA基因無法預測到啟動子,原因可能為:(1)原始miRNA序列較長,利用pri-RNA加工后形成pre-miRNA序列信息進行啟動子預測,其啟動子可能位于pre-miRNA的上游2 kb以外;(2)大多數啟動子預測軟件都使用同源搜索的方法,因此可能無法預測miRNA啟動子的非保守性啟動子;(3)由于基因組的重復性,部分基因組上具有多個拷貝的pre-miRNA序列為假基因,不發(fā)生轉錄,因此無法進行啟動子預測[19]。miRNA根據基因位置分為基因間miRNA和基因內miRNA,基因內miRNA通常與宿主基因共同轉錄,但Cui等[18]的研究表明,基因內miRNA也可能具有單獨的啟動子,形成獨立的轉錄本。本研究對基因內miRNA和基因間miRNA啟動子數目分別進行了統(tǒng)計,發(fā)現74.3%的基因內miRNA至少具有1個polⅡ型啟動子。以上結果表明,小麥中相當一部分的基因內miRNA也同樣具有獨立的啟動子,而未預測到啟動子的基因內miRNA則可能由宿主基因啟動子啟動轉錄。

    TSS是基因的轉錄起始位點,因此TSS的預測對于miRNA基因轉錄特點的研究具有一定的意義。本研究對TSS與pre-miRNA的距離進行統(tǒng)計分析,結果表明,TSS大多數位于pre-miRNA序列上游800 bp內,尤其上游200 bp內。該結果與大豆和水稻中的miRNA基因TSS統(tǒng)計結果類似[18-19],這說明小麥等植物的大多數miRNA核心啟動子區(qū)域與pre-miRNA序列比較接近,miRNA的PolⅡ啟動子近端區(qū)域的核心啟動子區(qū)可能對miRNA的轉錄起到更大的作用。

    植物基因啟動子上的順式作用元件能夠識別結合特定的轉錄因子,從而對基因的轉錄進行相應的時空特異性調控[24]。本研究對TSS上游序列進行了順式作用元件分析,結果表明,miRNA基因啟動子區(qū)域存在多種順式作用元件。其中TATA-box最多,TATA-box是一種廣泛存在的DNA基序,擬南芥和水稻中miRNA特異性基序的功能尚不清楚,但新發(fā)現的基序對于在小麥中鑒定新的特異性miRNA以及進行miRNA的試驗分析具有一定的借鑒意義。除順式作用元件外,CpG島也是重要的啟動子序列特征[35]。本研究在小麥中部分miRNA基因上游序列鑒定出了CpG島,而前人在擬南芥miRNA啟動子中未鑒定到CpG島,水稻miRNA啟動子中鑒定出的CpG島也較少[15],煙草中的MIR169基因家族中也未鑒定到CpG島的存在[36]。以上結果說明,小麥、水稻等單子葉植物中,CpG島的分布情況可能與雙子葉植物不同。

    miRNA在植物的基因調控中起到了重要作用,啟動子是控制miRNA基因表達的重要結構,因此對于miRNA基因啟動子的分析研究具有較大的意義。本研究利用公布的小麥基因組信息對小麥miRNA啟動子進行了分析,研究了小麥miRNA的染色體定位以及TSS分布、順式作用元件特異性等啟動子特征,相關結果對于小麥miRNA表達調控的研究及新miRNA的預測具有一定的借鑒意義。在未來的研究中,隨著小RNA測序以及分子實驗技術的進步,可獲得更多的miRNA功能信息,并結合試驗方法對相關結果進行進一步的驗證。

    猜你喜歡
    基序元件染色體
    EPIYA 基序與幽門螺桿菌感染相關胃病關系的研究進展
    新醫(yī)學(2023年10期)2023-12-09 15:04:51
    帶TRS基序突變的新型冠狀病毒威脅更大
    芥藍Aux/IAA家族基因生物信息學與表達分析
    多一條X染色體,壽命會更長
    科學之謎(2019年3期)2019-03-28 10:29:44
    為什么男性要有一條X染色體?
    科學之謎(2018年8期)2018-09-29 11:06:46
    能忍的人壽命長
    QFN元件的返工指南
    再論高等植物染色體雜交
    在新興產業(yè)看小元件如何發(fā)揮大作用
    寶馬i3高電壓元件介紹(上)
    51国产日韩欧美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产真实乱freesex| 直男gayav资源| 亚洲性久久影院| 国产免费一级a男人的天堂| 99久久精品热视频| 最近的中文字幕免费完整| 色尼玛亚洲综合影院| 内射极品少妇av片p| 此物有八面人人有两片| 久久久精品94久久精品| 简卡轻食公司| 美女被艹到高潮喷水动态| 熟女电影av网| 国产精品一及| 国产精品嫩草影院av在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日韩精品有码人妻一区| 91久久精品国产一区二区成人| 久久久久性生活片| 国产午夜精品论理片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美精品国产亚洲| 久久久色成人| 成人美女网站在线观看视频| 国产高潮美女av| 日韩三级伦理在线观看| 一级毛片我不卡| 亚洲国产精品国产精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲综合色惰| 国产成人影院久久av| 亚洲国产精品国产精品| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品久久久久久精品电影| 岛国在线免费视频观看| 国产久久久一区二区三区| 国内精品一区二区在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | av卡一久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲无线观看免费| 亚洲国产精品sss在线观看| av在线天堂中文字幕| 一区二区三区免费毛片| 免费看日本二区| 久久久欧美国产精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久这里只有精品中国| 禁无遮挡网站| 国产精品野战在线观看| 日韩av不卡免费在线播放| 国产精品三级大全| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品国产三级普通话版| 春色校园在线视频观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久99精品国语久久久| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久草成人影院| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 天美传媒精品一区二区| 日本三级黄在线观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产在视频线在精品| 一级黄色大片毛片| 国产成人精品婷婷| 免费在线观看成人毛片| 色5月婷婷丁香| 日韩欧美精品v在线| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品456在线播放app| 伊人久久精品亚洲午夜| 成人国产麻豆网| 一区二区三区免费毛片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 日日啪夜夜撸| 嫩草影院入口| 国产精品电影一区二区三区| 国产一区二区三区av在线 | av.在线天堂| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产色片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本色播在线视频| 久久午夜福利片| 中文在线观看免费www的网站| 欧美三级亚洲精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 秋霞在线观看毛片| 久久久久久久久久久免费av| 97超视频在线观看视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲,欧美,日韩| 精华霜和精华液先用哪个| 色播亚洲综合网| 亚洲图色成人| 欧美精品一区二区大全| 综合色丁香网| 国产乱人偷精品视频| 熟女电影av网| av在线天堂中文字幕| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 高清午夜精品一区二区三区 | 成人永久免费在线观看视频| 最新中文字幕久久久久| 一级毛片我不卡| 国产探花在线观看一区二区| 久久国产乱子免费精品| 在线观看午夜福利视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 岛国在线免费视频观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 欧美区成人在线视频| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 免费看av在线观看网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 99久久精品一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 18禁在线播放成人免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲人成网站在线播| 亚洲中文字幕日韩| 欧美一区二区国产精品久久精品| 午夜精品国产一区二区电影 | 久久久久久大精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲中文字幕日韩| 99九九线精品视频在线观看视频| 天堂影院成人在线观看| 久久久午夜欧美精品| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲国产精品久久男人天堂| 免费观看在线日韩| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产熟女欧美一区二区| 国产精品三级大全| 在线播放国产精品三级| 蜜臀久久99精品久久宅男| 成人午夜高清在线视频| 级片在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产高清有码在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| av在线蜜桃| 最近视频中文字幕2019在线8| 99久国产av精品| 日本成人三级电影网站| 久久久精品欧美日韩精品| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产视频首页在线观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费看a级黄色片| 亚洲五月天丁香| 国产探花在线观看一区二区| 婷婷六月久久综合丁香| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产探花极品一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 人妻系列 视频| 国产精品.久久久| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲一区高清亚洲精品| 在线观看66精品国产| 国产精品三级大全| 天堂影院成人在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 性色avwww在线观看| 久久久久久久久中文| 在线观看一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品国产高清国产av| 波多野结衣高清作品| 久久99热6这里只有精品| 黄色日韩在线| 一级毛片电影观看 | 成人美女网站在线观看视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 一本久久精品| 国产精品国产高清国产av| 国产亚洲91精品色在线| 久久久久久久久久久丰满| 日本免费一区二区三区高清不卡| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产精品福利在线免费观看| 高清毛片免费观看视频网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 国产人妻一区二区三区在| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲精品色激情综合| 美女高潮的动态| 欧美区成人在线视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 高清在线视频一区二区三区 | 成人国产麻豆网| 乱系列少妇在线播放| 黄色一级大片看看| 久久久精品欧美日韩精品| 高清在线视频一区二区三区 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费无遮挡裸体视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 真实男女啪啪啪动态图| 少妇丰满av| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 18禁在线播放成人免费| 成人一区二区视频在线观看| 免费av毛片视频| 国产视频内射| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本欧美国产在线视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美一区二区亚洲| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 3wmmmm亚洲av在线观看| 秋霞在线观看毛片| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲av一区综合| 成人综合一区亚洲| 搡女人真爽免费视频火全软件| 亚洲成人久久爱视频| 免费av不卡在线播放| 综合色av麻豆| 最近最新中文字幕大全电影3| 2021天堂中文幕一二区在线观| 99riav亚洲国产免费| 伦精品一区二区三区| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 黄色欧美视频在线观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 久久99热6这里只有精品| 天堂中文最新版在线下载 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产亚洲91精品色在线| 国产 一区 欧美 日韩| 黄片无遮挡物在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 国产精品一区二区在线观看99 | 国产av在哪里看| 国产亚洲精品久久久com| 国产探花极品一区二区| 18禁在线播放成人免费| 日韩欧美在线乱码| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄片wwwwww| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲中文字幕日韩| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲在线观看片| 最新中文字幕久久久久| 极品教师在线视频| 久久人人精品亚洲av| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 伦精品一区二区三区| 色哟哟·www| 国产大屁股一区二区在线视频| 精品人妻视频免费看| 简卡轻食公司| 边亲边吃奶的免费视频| 亚洲四区av| 网址你懂的国产日韩在线| 嫩草影院精品99| 亚洲av成人精品一区久久| 国内揄拍国产精品人妻在线| 中出人妻视频一区二区| 国产三级在线视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲第一区二区三区不卡| av卡一久久| 一个人看视频在线观看www免费| 久久久精品94久久精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 免费观看a级毛片全部| 日韩 亚洲 欧美在线| 人体艺术视频欧美日本| av视频在线观看入口| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 丰满的人妻完整版| 国产精品久久电影中文字幕| 国产真实伦视频高清在线观看| 一进一出抽搐动态| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产免费一级a男人的天堂| 中国美女看黄片| 亚洲最大成人中文| 中文字幕熟女人妻在线| 看片在线看免费视频| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | а√天堂www在线а√下载| 亚洲成av人片在线播放无| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 男女下面进入的视频免费午夜| 久久99热6这里只有精品| 亚洲精品亚洲一区二区| 一级黄片播放器| 一区二区三区高清视频在线| 一本一本综合久久| 国产免费一级a男人的天堂| 最近手机中文字幕大全| av天堂中文字幕网| 午夜老司机福利剧场| 黄色一级大片看看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 男人的好看免费观看在线视频| 免费无遮挡裸体视频| 狠狠狠狠99中文字幕| av在线亚洲专区| 中文字幕熟女人妻在线| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久精品94久久精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 九草在线视频观看| 亚洲七黄色美女视频| kizo精华| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久久久久久午夜电影| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国产黄a三级三级三级人| 精品久久久久久久久久免费视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美高清性xxxxhd video| 看非洲黑人一级黄片| 国产成人aa在线观看| www.av在线官网国产| 日本色播在线视频| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产黄片视频在线免费观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本与韩国留学比较| 中国美女看黄片| 99久久精品一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲国产色片| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产高清有码在线观看视频| av专区在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 午夜福利在线观看吧| 美女被艹到高潮喷水动态| 日韩制服骚丝袜av| 一进一出抽搐动态| 亚洲无线观看免费| 免费av毛片视频| 久久久久网色| 亚洲色图av天堂| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 女人被狂操c到高潮| 久久久久久久久久久免费av| АⅤ资源中文在线天堂| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美激情在线99| 18+在线观看网站| 波多野结衣高清作品| 中文字幕制服av| 三级国产精品欧美在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产成人91sexporn| 最近手机中文字幕大全| 成年版毛片免费区| 中文字幕熟女人妻在线| a级一级毛片免费在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲欧美精品专区久久| 插阴视频在线观看视频| 成人永久免费在线观看视频| 综合色av麻豆| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 精华霜和精华液先用哪个| 少妇熟女欧美另类| 成人毛片a级毛片在线播放| 岛国在线免费视频观看| 麻豆一二三区av精品| 国产精品人妻久久久影院| 高清在线视频一区二区三区 | 一级黄色大片毛片| 欧美激情在线99| 久久久久久久久中文| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲人成网站在线播| eeuss影院久久| 亚洲成人久久爱视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 卡戴珊不雅视频在线播放| 内射极品少妇av片p| 免费观看人在逋| 国产精品99久久久久久久久| 久久久久久国产a免费观看| 可以在线观看毛片的网站| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 亚洲美女搞黄在线观看| 午夜a级毛片| 晚上一个人看的免费电影| 日韩欧美 国产精品| 一级毛片我不卡| 久久久久久久久久成人| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美国产在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 在线免费十八禁| av天堂中文字幕网| 观看美女的网站| 可以在线观看毛片的网站| www.色视频.com| 中出人妻视频一区二区| 国产三级中文精品| 给我免费播放毛片高清在线观看| 成年版毛片免费区| 免费看美女性在线毛片视频| 99精品在免费线老司机午夜| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 免费看日本二区| 波多野结衣高清无吗| 精品一区二区三区视频在线| 成年女人看的毛片在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 国产三级在线视频| 国产久久久一区二区三区| 亚洲av免费在线观看| 久久这里有精品视频免费| 深爱激情五月婷婷| 中国美白少妇内射xxxbb| 最近中文字幕高清免费大全6| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 综合色丁香网| 欧美最新免费一区二区三区| 久久久久网色| 国产一区二区三区av在线 | 国产精品三级大全| 不卡视频在线观看欧美| 午夜免费激情av| 在线观看av片永久免费下载| 欧美色欧美亚洲另类二区| 日韩中字成人| 久久人妻av系列| 欧美精品国产亚洲| 91狼人影院| 毛片一级片免费看久久久久| 日本黄大片高清| 久久人人爽人人片av| 少妇被粗大猛烈的视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 成人特级av手机在线观看| 国产成人freesex在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人毛片a级毛片在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 高清日韩中文字幕在线| 在线国产一区二区在线| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美三级亚洲精品| 国产精品一二三区在线看| 一区福利在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久精品91蜜桃| 韩国av在线不卡| 日韩精品有码人妻一区| 免费人成在线观看视频色| 欧美日韩乱码在线| 国产熟女欧美一区二区| 久久久久性生活片| 国产成人91sexporn| 99久久精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 欧美三级亚洲精品| 成年免费大片在线观看| 亚洲av男天堂| 国产亚洲精品av在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品伦人一区二区| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 午夜福利视频1000在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 国产 一区 欧美 日韩| 中文字幕熟女人妻在线| 小说图片视频综合网站| 秋霞在线观看毛片| 亚洲综合色惰| 欧美日本视频| 一区二区三区免费毛片| 2022亚洲国产成人精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 在线a可以看的网站| 可以在线观看的亚洲视频| 婷婷色综合大香蕉| 99精品在免费线老司机午夜| 久久6这里有精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | a级毛片a级免费在线| 久久久久久久久久久免费av| 一进一出抽搐动态| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 99久久精品一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 午夜精品国产一区二区电影 | 日本一本二区三区精品| 观看美女的网站| 国产成人精品久久久久久| 婷婷色av中文字幕| 亚洲18禁久久av| 欧美人与善性xxx| 毛片女人毛片| 91aial.com中文字幕在线观看| 老女人水多毛片| 超碰av人人做人人爽久久| 日本黄色视频三级网站网址| 国产69精品久久久久777片| 高清日韩中文字幕在线| 麻豆成人av视频| 国内精品宾馆在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产免费一级a男人的天堂| 亚洲av不卡在线观看| 精品久久久久久久久av| 看十八女毛片水多多多| 精品无人区乱码1区二区| 久久久久久伊人网av| av在线亚洲专区| 亚洲四区av| 日韩中字成人| 欧美变态另类bdsm刘玥| 能在线免费看毛片的网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 观看免费一级毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品一区二区性色av| 校园春色视频在线观看| 亚洲无线在线观看| 高清午夜精品一区二区三区 | 爱豆传媒免费全集在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 能在线免费观看的黄片| 亚洲综合色惰| 特级一级黄色大片| 成人性生交大片免费视频hd| 99久久精品热视频| 国产午夜精品论理片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 中文字幕av在线有码专区| 插阴视频在线观看视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产激情偷乱视频一区二区| 嫩草影院入口| 村上凉子中文字幕在线| 免费人成在线观看视频色| 欧美成人a在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产日韩欧美在线精品| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 高清在线视频一区二区三区 | 给我免费播放毛片高清在线观看| av国产免费在线观看| 国产在线男女| 美女cb高潮喷水在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲精品影视一区二区三区av| 免费看a级黄色片| 成人综合一区亚洲| 亚洲五月天丁香| 国产精品福利在线免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 好男人视频免费观看在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 午夜精品一区二区三区免费看| 丝袜美腿在线中文| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产成人a区在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲真实伦在线观看| 国产探花在线观看一区二区| 中国美女看黄片| 哪个播放器可以免费观看大片| 麻豆一二三区av精品| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩中字成人| 日韩成人伦理影院| 久久久久网色| 日日撸夜夜添|