自由基級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控策略在重大疾病防治中的應(yīng)用

畢鄭妍， 劉艷嵐,2

(1.湖南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院, 長沙 410082; 2.湖南大學(xué) 分子科學(xué)與生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室化學(xué)/生物傳感與化學(xué)計(jì)量學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省適配體工程中心, 長沙410082)

0 引 言

1956年，Harman提出衰老的自由基學(xué)說，認(rèn)為衰老過程中的退行性變化是由細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的有害自由基導(dǎo)致的。自由基主要是機(jī)體內(nèi)氧化還原反應(yīng)過程的中間產(chǎn)物，也可由外界紫外線照射和電離輻射等因素誘發(fā)產(chǎn)生。其反應(yīng)活性高，可使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜，還能夠使蛋白質(zhì)和核酸等大分子交聯(lián)或變性，甚至引起DNA損傷導(dǎo)致突變，從而誘發(fā)癌癥的發(fā)生和發(fā)展。

在正常生理情況下，體內(nèi)自由基不斷產(chǎn)生，同時也受人體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)(如氧化物歧化酶和維生素等)的嚴(yán)格調(diào)控，從而維持自由基代謝平衡，保持人體各種機(jī)能的正常運(yùn)行。然而，內(nèi)防御機(jī)制失衡或者外界的一些有害刺激常引起自由基平衡失調(diào)，導(dǎo)致自由基的過度積累，對各種生物分子(如DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì))造成損害，以及招募許多炎癥介質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)衰老、自身免疫性疾病、心血管和神經(jīng)退行性疾病等許多氧化應(yīng)激相關(guān)疾病。此外，自由基的過度增加與癌癥的發(fā)生和惡化也密切相關(guān)。因此，從自由基穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方向入手治療相關(guān)疾病是一種行之有效的策略。

本文首先概述了自由基在體內(nèi)的產(chǎn)生和代謝，隨后對自由基的兩種調(diào)控機(jī)理及本課題組在相關(guān)疾病治療方面的工作進(jìn)行介紹，最后展望了該領(lǐng)域發(fā)展的方向和可能面臨的挑戰(zhàn)。

1 自由基簡介

1.1 自由基的產(chǎn)生和代謝

1.1.1 反應(yīng)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)

1.1.2 反應(yīng)活性氮(Reactive nitrogen species, RNS)

1.2 自由基級聯(lián)信號調(diào)控與疾病治療

自由基是把雙刃劍，體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失調(diào)會導(dǎo)致細(xì)胞損傷和機(jī)體病變，因此，利用抗氧化劑清除自由基維持氧化還原穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要；此外，有效利用自由基也可以殺害癌細(xì)胞進(jìn)行癌癥治療。盡管癌細(xì)胞微環(huán)境自由基水平較高，獨(dú)特的自防御機(jī)制也導(dǎo)致其具有較高的耐受能力，但當(dāng)產(chǎn)生的自由基水平超過細(xì)胞承受能力時，仍然可以有效殺死癌細(xì)胞，基于此原理的化學(xué)動力療法在癌癥治療領(lǐng)域備受矚目。

1.2.1 自由基與氧化應(yīng)激

ROS和RNS都是體內(nèi)重要的自由基，在生物體內(nèi)作為代謝產(chǎn)物和信號分子，在正常的細(xì)胞代謝和受到環(huán)境刺激時產(chǎn)生[13-14]。這些物質(zhì)通常含有孤對電子，容易與其他分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)[15]，參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)各種生理過程[16-17]，也有助于對抗病原體及其誘導(dǎo)的感染[18]。通常，由于過量ROS/RNS具有顯著的細(xì)胞毒性，這種氧化過程受到細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制的嚴(yán)格控制。當(dāng)ROS、RNS和抗氧化防御之間的平衡被破壞時，就會產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可通過急性ROS/RNS生產(chǎn)過剩或慢性ROS/RNS積累表現(xiàn)出來。由于ROS和RNS受到不同信號的調(diào)控，其過量產(chǎn)生將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號的級聯(lián)改變，引起多種細(xì)胞功能障礙，如能量代謝功能失調(diào)、細(xì)胞信號和細(xì)胞周期控制的改變、細(xì)胞運(yùn)輸機(jī)制受損、免疫激活或抑制以及炎癥[19]，甚至誘發(fā)細(xì)胞死亡等對機(jī)體造成損害的連鎖反應(yīng)，因此，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[10]。

目前，氧化應(yīng)激相關(guān)疾病治療和自由基調(diào)控主要分為兩個方面：一方面，過量的自由基引起氧化損傷，導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病和多種代謝性疾病等，因而利用抗氧化劑增加自由基清除能力，可以消除自由基信號異常并抑制疾病發(fā)展，這被稱為抗氧化治療；另一方面，自由基的產(chǎn)生與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，癌細(xì)胞微環(huán)境相比正常細(xì)胞通常具有更高的自由基水平，這種不同的氧化還原調(diào)節(jié)機(jī)制引導(dǎo)了一個新的治療方向，即產(chǎn)生更多的自由基使其超過癌細(xì)胞耐受水平而殺死癌細(xì)胞，稱為促氧化治療。

1.2.2 抗氧化治療

近年來，抗氧化納米材料由于具有諸多優(yōu)勢引起了廣泛關(guān)注[2]，包括:(1)可以顯著提高天然抗氧化劑的抗氧化穩(wěn)定性及其藥物動力學(xué)，保護(hù)這些試劑免受環(huán)境氧化/還原和酸的侵蝕；(2)許多納米材料本身具有酶活性，相比于天然酶和小分子來說具有更高的催化效率和更強(qiáng)的環(huán)境耐受性；(3)對多種自由基，特別是次級ROS/RNS，具有強(qiáng)大的清除能力，可提供更廣泛有效的抗氧化防御；(4)可以通過功能集成，合成多功能、診療一體化抗氧化納米藥物，有望實(shí)現(xiàn)個性化治療。大量研究證明，納米材料在體內(nèi)和體外都具有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎活性，但抗氧化納米材料的臨床開發(fā)仍處于早期階段。在未來的臨床應(yīng)用研究中，仍需從給藥途徑、體內(nèi)生物相容性、藥代動力學(xué)、生物分布與代謝以及最終病理后遺癥的表達(dá)等方面深入評估現(xiàn)有和新興的大量抗氧化納米材料。

1.2.3 促氧化治療

癌癥的一大重要特征是，癌細(xì)胞含有更多的ROS和RNS等自由基，并且對自由基水平升高更為敏感，這引起了人們的廣泛關(guān)注[21]。傳統(tǒng)化療藥物如阿霉素(DOX)和As2O3，其促氧化治療機(jī)制是在癌細(xì)胞中特異地產(chǎn)生ROS殺死癌細(xì)胞。然而，目前大多數(shù)化療藥物和放療都具有不可避免的副作用。精確和特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中ROS及其他自由基水平順理成章地成為提高治療效果同時減少副作用的關(guān)鍵。因此，腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment, TME)這一與靶向策略密切相關(guān)的重要因素得到了深入研究。TME的主要特征是弱酸性、缺氧、血管異常、過氧化氫和谷胱甘肽生產(chǎn)過剩、消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)等[22-23]。基于此，復(fù)旦大學(xué)步文博課題組提出了一種將TME和Fenton反應(yīng)相結(jié)合的新的治療方法——化學(xué)動力治療(Chemodynamic therapy, CDT)[24]，通過Fenton反應(yīng)可以生成?OH特異性靶向癌細(xì)胞，反應(yīng)機(jī)理如式(1)和式(2)所示。實(shí)現(xiàn)高效的Fenton反應(yīng)需要兩個關(guān)鍵條件，即大量的H2O2和最適的pH(2～4)。

Fe2++ H2O2→Fe3++?OH + OH-

(1)

Fe3++ H2O2→Fe2++ HO2+ H+

(2)

與其他癌癥治療策略如化療、放療、光熱治療(PTT)、光動力療法(PDT)和聲動力療法(SDT)相比，CDT的優(yōu)勢包括：特異性更高、不受外場穿透深度的限制、對正常組織副作用較低、生成更高水平的ROS以及無設(shè)備限制、非多藥耐藥，在臨床上顯示出良好的發(fā)展前景[25]。然而，TME的pH(6.5～6.8)和H2O2濃度等難以滿足Fenton反應(yīng)的需要。為了克服這一障礙，目前的研究主要集中在設(shè)計(jì)不同的納米材料[26-28]、原位降低反應(yīng)的pH[29-30]、原位生成H2O2[31]或消耗GSH[32]，以及引入物理場和化學(xué)場等方面，以期顯著提高Fenon反應(yīng)效率，進(jìn)而增強(qiáng)CDT療法的功效。

針對抗氧化和促氧化方法調(diào)控自由基級聯(lián)信號的機(jī)理和現(xiàn)狀，本課題組研究開發(fā)了新的材料和方法以促進(jìn)相關(guān)疾病治療的發(fā)展，包括將抗氧化黑色素納米材料用于缺血性腦損傷和人工DNA編碼器用于特定治療肥胖疾??；以及利用非晶態(tài)氧化鐵RNA干擾納米平臺和適體-前藥偶聯(lián)物解決了化學(xué)動力療法面臨的部分問題并成功應(yīng)用于促氧化癌癥治療。

2 自由基清除與抗氧化治療

2.1 抗氧化黑色素納米顆粒的抗氧化機(jī)制及其在缺血性腦中風(fēng)方面的防御研究

缺血性腦損傷的機(jī)制眾說紛紜，近年來廣受關(guān)注的自由基學(xué)說認(rèn)為自由基通過攻擊細(xì)胞膜上的多聚不飽和脂肪酸(PUFA)引發(fā)一系列反應(yīng)，造成細(xì)胞損害和死亡。在正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)存在自由基代謝酶等內(nèi)源性抗氧化劑，使自由基處于穩(wěn)態(tài)，不易引起損傷。但是腦部缺血后增多的自由基會大量消耗抗氧化劑，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)不能及時清除自由基，引起氧化應(yīng)激損傷。因此，清除腦部由于栓塞過程導(dǎo)致的過量自由基被認(rèn)為是保護(hù)腦損傷的一個重要手段。

人體內(nèi)的天然抗氧化劑具有一定的局限性，如無法及時響應(yīng)突然升高的自由基水平、不存在特定靶向次級ROS/RNS的內(nèi)源性酶等，一系列抗氧化納米材料由于其抗氧化穩(wěn)定性以及對次級ROS/RNS(如?OH和ONOO-)強(qiáng)大的清除能力等諸多優(yōu)勢引起了研究人員廣泛的興趣，但其對人體健康具有潛在的不良影響，如對免疫細(xì)胞的激活和存在基因毒性；大多數(shù)抗氧化納米材料具有較差的生物相容性，這對其應(yīng)用于治療腦部損傷造成了阻礙，目前并沒有抗氧化劑通過臨床驗(yàn)證能夠安全有效地保護(hù)缺血腦免受氧化損傷。

圖1 (a)PEG-MeNPs的TEM圖像；(b) 有/無PEG-MeNPs時100 μmol·L-1 KO2溶液中O2生成量，插圖是加入KO2 前后的PEG-MeNPs溶液；(c) RONS代謝示意圖及PEG-MeNPs清除?OH, ?NO, ONOO-的作用；(d)不同組 (Saline：生理鹽水組，NP-treated：PEG-MeNPs處理組，Sham：假手術(shù)組)對應(yīng)2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染 色腦切片的代表圖；(e、f)三組相應(yīng)的梗死面積和腦組織中水平(與生理鹽水對照組相比，*p < 0.05, **p < 0.01)。引自參考文獻(xiàn)[35]Fig.1 (a) TEM image of PEG-MeNPs; (b) O2 production from the KO2 solution (100 μmol·L-1) with vs. without PEG-MeNPs, the inset is the digital picture of the PEG-MeNPs solution before vs. after addition of KO2; (c) Schematic illustration of RONS metabolism and ?OH, ?NO, ONOO- scavenging effect of PEG-MeNPs; (d) Representative images of TTC-stained brain slices from different groups. The corresponding (e) infarct areas and (f) levels in brain tissues of the three groups (*p < 0.05 and **p < 0.01 vs. saline control). Reprinted with permission from reference [35]

2.2 人工DNA編碼器的構(gòu)建用于調(diào)控自由基級聯(lián)反應(yīng)和肥胖治療

肥胖是一種多因素的慢性代謝性疾病，可增加糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝、癌癥以及心血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種疾病的患病風(fēng)險，被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的公共健康問題之一。肥胖病理學(xué)的最新進(jìn)展表明，由代謝組織中各種活性氧和活性氮(RONS)的產(chǎn)生和積累引起的氧化應(yīng)激是肥胖發(fā)病和進(jìn)展的共同特征和核心機(jī)制之一。這種不平衡的氧化還原穩(wěn)態(tài)協(xié)調(diào)級聯(lián)適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括活化常駐白細(xì)胞和招募炎癥細(xì)胞，釋放炎性因子和更多的自由基，從而導(dǎo)致氧化損傷和炎性反應(yīng)加劇的惡性循環(huán)，進(jìn)一步促進(jìn)脂肪形成并誘發(fā)許多并發(fā)癥[36]。顯而易見，選擇性調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有望成為治療肥胖相關(guān)疾病的一個通用方法。

在正常生理狀態(tài)下，人體內(nèi)存在的抗氧化網(wǎng)絡(luò)能夠嚴(yán)格控制自由基級聯(lián)反應(yīng)(FRC)，通過復(fù)制-轉(zhuǎn)錄-翻譯(對應(yīng)信息的發(fā)射、傳播和接收)等分子通訊過程表達(dá)抗氧化劑，維持細(xì)胞氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷[37-38]。然而，這種由基因組介導(dǎo)的分子通訊受到耗時、信息傳遞不充分、無法解碼一些高活性自由基(?OH)等限制，不能有效和及時地解碼肥胖疾病發(fā)生時復(fù)雜的FRC，因此，開發(fā)新的實(shí)時自由基解碼器至關(guān)重要。然而到目前為止，臨床上還沒有抗氧化劑被用于治療與肥胖相關(guān)的疾病。

針對基因組介導(dǎo)的分子通訊過程面臨的問題，本課題組提出了一種基于DNA框架結(jié)構(gòu)的人工DNA編碼器，用于調(diào)控脂肪化過程中自由基級聯(lián)反應(yīng)，如圖2(a)所示。考慮到對肥胖疾病特定和靶向治療的有效性和必要性，選擇一個能特異性識別脂肪細(xì)胞的適配體序列作為接收器，單寧酸(TA)作為效應(yīng)器。TA是一種天然的小分子，具有廣泛的生物學(xué)功能，包括抗氧化和抗炎癥。利用滾動循環(huán)復(fù)制(RCR)和密集包裝驅(qū)動的DNA組裝方法，合成了能夠解碼多種復(fù)雜自由基級聯(lián)信號的人工DNA編碼器TADN[39]。在RCR過程中，通過適配體介導(dǎo)的分子識別，收發(fā)器模塊使編碼器能夠主動感知環(huán)境壓力下FRC失調(diào)的目標(biāo)細(xì)胞。一旦被識別，內(nèi)部即時可用的效應(yīng)器直接作用于失調(diào)的FRC以清除過量的自由基，而不需要耗時的復(fù)制-轉(zhuǎn)錄-翻譯過程來產(chǎn)生抗氧化酶。另外，相比基因組DNA編碼產(chǎn)生的酶，該人工DNA編碼器對各種自由基具有更廣泛的清除活性如圖2(b)所示，而且基于DNA框架的通道可以有效防止惡劣環(huán)境對效應(yīng)器活性的負(fù)面影響，從而保障通信的穩(wěn)定。此外，驗(yàn)證了人工DNA編碼器在體內(nèi)的主動傳感和驅(qū)動作用。結(jié)果表明，該編碼器可以通過重組由脂肪生成驅(qū)動的失調(diào)FRC和代謝，同時阻礙自由基與炎癥網(wǎng)絡(luò)之間的有害通訊，協(xié)同抗肥胖治療，如圖2(c)～圖2(e)所示。

圖2 (a) 基于DNA框架的人工DNA編碼器的結(jié)構(gòu)示意圖、基于自然基因組DNA系統(tǒng)和人工DNA編碼器介導(dǎo)自由 基級聯(lián)(FRC)的潛在分子通訊機(jī)制；(b)TADN對H2O2、1O2和ONOO-清除作用的熒光分析；(c) 靜脈注射 TADN或非靶向NTADN人工DNA編碼器后，正常飲食(ND)或HFD(高脂飲食)小鼠的時間依賴性全身熒光 成像和(d)不同器官的熒光成像；(e)靜脈注射PBS、TADN、非靶向NTADN或游離TA的典型ND/HFD小鼠的 圖片。引自參考文獻(xiàn)[39]Fig.2 (a) Schematic illustration of the structure of the DNA framework-based artificial DNA encoder and the underlying molecular communication mechanisms mediated by natural genome DNA-based system and the artificial DNA encoder towards the free radical cascade (FRC); (b) Fluorescence analysis of the scavenging efficacy of TADN towards H2O2, 1O2, and ONOO-; (c) Time-dependent whole-body fluorescence imaging of normal diet (ND) or HFD-fed mice after intravenous injection of TADN or NTADN artificial DNA encoder; (d) Fluorescence imaging of different organs harvested from these three groups in panel (b); (e) Digital picture of representative ND/HFD-fed mice that received iv injection of PBS, TADN, NTADN, or free TA. Reprinted with permission from reference [39]

3 放大自由基級聯(lián)信號用于癌癥治療

與上述自由基調(diào)控機(jī)理相反，基于Fenton反應(yīng)機(jī)理的化學(xué)動力療法，通過產(chǎn)生高毒性自由基來殺死惡性細(xì)胞，這種促氧化療法在癌癥治療上也備受關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明，與正常細(xì)胞相比，許多類型的癌細(xì)胞都表現(xiàn)出ROS水平的升高[21]。由于細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生增加或?qū)ψ杂苫那宄芰ο陆?，會?dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞，這種內(nèi)在的氧化應(yīng)激常常被視為惡性事件，癌細(xì)胞的異常生長也與活性氧及其他自由基的增加有關(guān)。然而，由于過度水平的自由基應(yīng)激對細(xì)胞有毒，外源性藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基時，氧化應(yīng)激增加的癌細(xì)胞可能更容易受到傷害。因此，通過氧化還原調(diào)節(jié)自由基水平可能是一種選擇性殺死癌細(xì)胞而不會對正常細(xì)胞造成顯著毒性的方法。

3.1 RNA干擾策略用于放大自由基反應(yīng)及癌癥靶向治療

在特異性調(diào)節(jié)癌細(xì)胞自由基穩(wěn)態(tài)上，CDT展現(xiàn)了良好的前景。目前，CDT方法主要依賴于內(nèi)源性過氧化氫(H2O2)通過經(jīng)典的Fenton或Haber-Weiss化學(xué)轉(zhuǎn)化為高毒性羥基自由基[7]。然而，由于有效的化學(xué)反應(yīng)需要強(qiáng)酸性，以及腫瘤H2O2不足和上調(diào)抗氧化防御以對抗自由基引起的氧化損傷，CDT的抗癌效果受到極大的限制。因此，研究人員開發(fā)了很多策略，對pH和H2O2等腫瘤微環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)以滿足CDT反應(yīng)的需要。

腫瘤微環(huán)境的重要特征之一是缺氧，在缺氧狀態(tài)下，癌細(xì)胞的代謝途徑可能會重塑，通過平衡生物合成過程和快速生產(chǎn)大量的ATP以支持細(xì)胞增殖，因而在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中會觀察到有氧糖酵解或“瓦伯格效應(yīng)”[40]。糖酵解的高速率引起乳酸的過量生成，這導(dǎo)致單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(MCTs)的上調(diào)[41]，與該過程相關(guān)的主要是MCT4，其控制乳酸/H+的流出，維持穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)pH并誘導(dǎo)細(xì)胞外環(huán)境的微酸化(pH 6.5～6.8)。MCT4表達(dá)升高與許多癌癥的轉(zhuǎn)移、血管生成、預(yù)后不良和復(fù)發(fā)有關(guān)[42]。因此，假設(shè)沉默MCT4基因可以阻止癌細(xì)胞內(nèi)乳酸的外排，使細(xì)胞內(nèi)pH降低，從而增強(qiáng)Fenton反應(yīng)效率。

結(jié)合RNAi策略，開發(fā)了一個非晶態(tài)氧化鐵納米顆粒(AIO NPs)平臺(圖3(a)和圖3(b))有效遞送靶向MCT4的小干擾RNA(siRNA)，用于沉默MCT4的表達(dá)[29]。AIO NPs對siRNA的有效封裝避免其與酶接觸而被降解，同時利用AIO NPs酸性響應(yīng)特點(diǎn)釋放鐵離子，與癌細(xì)胞內(nèi)的H2O2通過類Fenton反應(yīng)產(chǎn)生高反應(yīng)性和毒性的?OH，促進(jìn)內(nèi)涵體逃逸并顯著加劇腫瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。更重要的是，MCT4基因沉默后可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)的H2O2含量上升，結(jié)合細(xì)胞內(nèi)由于MCT4沉默導(dǎo)致的乳酸積累，F(xiàn)enton反應(yīng)的效率大幅度提高，從而高效地殺傷癌細(xì)胞。

在荷瘤小鼠模型中，通過將NPs靜脈注射到PC3荷瘤小鼠中，檢測了AIO RNAi NPs的體內(nèi)基因沉默效果。圖3(c)～圖3(e)表明，與NP(siControl)處理組相比，NP(siMCT4)處理小鼠的MCT4表達(dá)得到顯著抑制。此外，類Fenton反應(yīng)引起氧化損傷對腫瘤抑制起到了協(xié)同作用，從而顯著抑制了腫瘤的生長。同時，氧化鐵NPs還具有MRI造影的功能，從而實(shí)現(xiàn)了對AIO RNAi NPs腫瘤積聚的無創(chuàng)可視化如圖3(f)所示?？傮w來說，該AIO RNAi NPs具有體積小、基因沉默高效、腫瘤積累高、腫瘤組織穿透深、生物相容性好以及MRI介導(dǎo)的腫瘤積累跟蹤等特點(diǎn)，有望為各種惡性腫瘤的治療提供有價值的工具。

圖3 (a)AIO RNAi NPs的形成和(b)多重功能的示意圖；(c) Western blot分析NP(siControl)與NP(siMCT4)對PC3荷瘤小鼠MCT4表達(dá)的影響；(d) PBS、NP(siControl)或NP(siMCT4)治療后PC3異種移植小鼠腫瘤生長(*p<0.05和**p<0.01 vs. PBS對照)；(e) 三組荷瘤小鼠和腫瘤組織的代表性圖片；(f) 靜脈注射AIO RNAi NPs后PC3荷瘤小鼠全身T1、T2加權(quán)MRI圖像。引自參考文獻(xiàn)[29]

3.2 生物正交適體-前藥結(jié)合膠束用于非H2O2和pH依賴性癌癥化學(xué)動力治療

如上所述，傳統(tǒng)的Fenton反應(yīng)由于受到反應(yīng)速率的限制，通常需要大量的H2O2和較低的pH (2～4)[44]，而腫瘤內(nèi)環(huán)境自身達(dá)不到如此高的要求。除了在上述工作中通過增加H2O2含量及降低細(xì)胞內(nèi)pH來提高Fenton反應(yīng)效率外，設(shè)計(jì)一個H2O2和pH非依賴的化學(xué)動力學(xué)療法也是提高其抗腫瘤效果的另一個重要途徑。因此，本課題小組設(shè)計(jì)了一種自由基前藥和核酸適體偶聯(lián)物(ApPdC)，首次將生物正交反應(yīng)引入化學(xué)動力療法，實(shí)現(xiàn)了Fe2+可激活的有毒碳自由基的原位釋放和放大，靶向殺死腫瘤細(xì)胞且不依賴腫瘤的酸性或H2O2[32]。

如圖4(a)所示，在ApPdC中利用適配體AS1411特異性識別癌癥中過表達(dá)的核仁素，并引入正交化學(xué)和前藥設(shè)計(jì)，首先合成人工前藥堿基——金剛烷穩(wěn)定的四氧六烷單體(“T”)作為疏水尾部，適配體作為親水端，通過自組裝作用成功制備了一個剛性的、多組分的ApPdC納米膠束。所得到的ApPdC納米膠束在生理?xiàng)l件下是不活躍的，然而它們在癌細(xì)胞受體介導(dǎo)的攝取后，引起級聯(lián)的生物正交反應(yīng)。本設(shè)計(jì)引入與人工前藥堿基選擇性共給藥的血紅素hemin，從而實(shí)現(xiàn)Fe2+的自供應(yīng)并能有效地激活前藥。在癌細(xì)胞中，hemin中的配位Fe3+可以被細(xì)胞內(nèi)還原劑(如GSH)還原為Fe2+-配位血紅素，而后前藥堿基T被亞鐵血紅素(Fe2+)/游離Fe2+激活，通過單電子轉(zhuǎn)移釋放毒性自由基。在活化過程中，過氧化物被裂解后通過生物正交化學(xué)觸發(fā)氧自由基的產(chǎn)生，不穩(wěn)定的氧自由基通過C—C β斷裂重排成C中心自由基，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。圖4(b)證實(shí)了ApPdC膠束的活化及C中心自由基的形成。

實(shí)驗(yàn)表明，ApPdC膠束具有良好的特異性識別和位點(diǎn)選擇性激活機(jī)制，如圖4(c)所示。此外，由于血紅素的減少導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的消耗，可顯著降低腫瘤細(xì)胞的抗氧化能力，從而進(jìn)一步促進(jìn)毒性C中心自由基的抗癌作用，如圖4(d)所示。也驗(yàn)證了ApPdC膠束協(xié)同治療癌癥的潛力，顯然，Ap-6G-H-“T”比不含血紅素的Ap-6G-“T”更能有效抑制細(xì)胞增殖和生長，而且與單T膠束相比，Ap-6G-2“T”也展現(xiàn)了高效選擇性治療腫瘤的潛力。

圖4 (a) ApPdC膠束的合成及在癌細(xì)胞中自循環(huán)和原位擴(kuò)增產(chǎn)生有毒自由基的示意圖；(b) 以DEPMPO為自旋俘獲劑，測定“T”在二亞硫酸鈉誘導(dǎo)血紅素還原產(chǎn)生Fe2+(上圖)或血紅素(Fe2+)(下圖)活化下自由基的生成；(c) 不同處理下HepG2肝癌細(xì)胞中自由基水平的流式細(xì)胞術(shù)分析(上圖)和共聚焦熒光成像(下圖)；(d) Ap-6G-“T”、Ap-6G-H-“T”、Ap-6G-2“T”、Ap-6G-H-2“T”及相應(yīng)的非靶向樣品處理HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活性。引自參考文獻(xiàn)[32]

設(shè)計(jì)的ApPdC膠束能夠?qū)崿F(xiàn)TME雙靶向和自我循環(huán)，在癌細(xì)胞中原位擴(kuò)增產(chǎn)生有毒自由基，顯示了很好的治療效果，但仍需要進(jìn)一步的研究，如體內(nèi)藥代動力學(xué)和ApPdC膠束的抗癌效果，以更好地說明它們在癌癥治療中的潛力。此外，盡管ApPdC膠束旨在靶向獨(dú)特的癌細(xì)胞代謝以最小化副作用，但未來還需要更多的研究來評估其對正常細(xì)胞或組織的長期安全性。另外，由于鐵代謝失調(diào)和易受氧化應(yīng)激影響是癌癥的共同特征，本研究可以為開發(fā)新型有效的專門治療多種晚期癌癥的ApPdC奠定基礎(chǔ)。

4 總結(jié)與展望

自由基在生物體中擔(dān)任重要功能，其過量產(chǎn)生會導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等生物分子發(fā)生變形和失活。自由基的增加也與癌細(xì)胞的異常生長有關(guān)，可能在癌癥的開始和發(fā)展中扮演重要角色。此外，過量自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可能誘發(fā)很多其他疾病，如腦中風(fēng)和神經(jīng)退行性疾病，因此，維持自由基穩(wěn)態(tài)對保障細(xì)胞正常功能至關(guān)重要。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時，由于人體內(nèi)抗氧化機(jī)制無法平衡自由基的產(chǎn)生與消除，往往需要利用一些外源的抗氧化劑進(jìn)行抗氧化治療。然而，由于過高水平的自由基應(yīng)激也可能殺害細(xì)胞，癌細(xì)胞氧化應(yīng)激增加時可能更容易受到外源性藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基的損傷。因此，促氧化療法也是一種調(diào)節(jié)自由基水平特異性殺死癌細(xì)胞的有利選擇。

在抗氧化納米材料的合理設(shè)計(jì)上，需要繼續(xù)探索和優(yōu)化合成途徑，使材料具有更強(qiáng)、更穩(wěn)定的體內(nèi)抗氧化活性，并且高效、高選擇性地調(diào)節(jié)氧化還原微環(huán)境靶位點(diǎn)，使全身副作用最小化；為達(dá)到顯著的臨床效益，還需深入了解不同疾病的氧化還原病理和抗氧化納米材料的詳細(xì)抗氧化機(jī)制，以及進(jìn)行廣泛的臨床前研究，為開發(fā)設(shè)計(jì)抗氧化納米材料提供關(guān)鍵信息。迫切需要明確自由基在調(diào)節(jié)特定生物事件的分子機(jī)制，以及氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的動力學(xué)進(jìn)展。開發(fā)新的和更具有臨床相關(guān)性的體外或體內(nèi)動物模型也是自由基研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，可對不斷涌現(xiàn)的抗氧化納米技術(shù)進(jìn)行強(qiáng)有力的評價。

對于促氧化療法的發(fā)展，一方面，針對自由基的產(chǎn)生，亟待開發(fā)新的材料來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以滿足需要，或者利用現(xiàn)有的環(huán)境開辟新的自由基產(chǎn)生機(jī)制；另一方面，由于涉及氧化還原調(diào)控和應(yīng)激反應(yīng)的因素很多，癌細(xì)胞的氧化還原變化非常復(fù)雜，單純使用自由基生成劑并不一定產(chǎn)生足夠的腫瘤殺傷性能。在持續(xù)的內(nèi)源性氧化應(yīng)激下，許多癌細(xì)胞能夠很好地適應(yīng)這種應(yīng)激并導(dǎo)致內(nèi)源性抗氧化劑性能增強(qiáng)。為了有效殺死癌細(xì)胞并克服與氧化還原適應(yīng)相關(guān)的耐藥性，了解癌細(xì)胞中復(fù)雜的氧化還原變化及其潛在機(jī)制是很重要的。同時，將促氧化試劑與傳統(tǒng)的化療或放療等治療方式相結(jié)合，有望顯著增強(qiáng)癌癥治療效果。

綜上所述，自由基調(diào)控是一種新型的、具有廣闊發(fā)展前景的疾病防治策略。期待著上述挑戰(zhàn)在可預(yù)見的未來得到解決，早日實(shí)現(xiàn)抗氧化和促氧化技術(shù)在預(yù)防和治療人類重大疾病方面的臨床應(yīng)用。