基于SSR標(biāo)記構(gòu)建廣西杉木核心種質(zhì)*

李魁鵬，陳仕昌，程 琳，賀錦鋒，唐紅亮，譚文婧，余代淵，王 斌，莫宗恒，黃開勇**

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院,廣西優(yōu)良用材林資源培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530002；2.融水苗族自治縣國營貝江河林場(chǎng)，廣西柳州 545300；3.融安縣西山林場(chǎng)， 廣西柳州 545400)

0 引言

種質(zhì)資源是動(dòng)植物遺傳改良的物質(zhì)基礎(chǔ)，在品種選育以及優(yōu)異材料創(chuàng)制和利用研究中起重要作用。由于盲目開發(fā)及生態(tài)環(huán)境問題，導(dǎo)致物種多樣性銳減，種質(zhì)資源受到世界各國的關(guān)注，并相繼創(chuàng)建了種質(zhì)資源庫[1]，保存收集各類種質(zhì)資源。隨著收集數(shù)量增多，保存管護(hù)、評(píng)價(jià)利用方面出現(xiàn)各種困難，且種質(zhì)資源未能充分發(fā)揮其重要作用，故核心種質(zhì)的概念及其構(gòu)建的方法得以提出和發(fā)展[2,3],其思想是通過合理的方法，從原始種質(zhì)中篩選代表性的材料構(gòu)成核心種質(zhì)，其數(shù)量規(guī)模遠(yuǎn)小于原始種質(zhì)，意在提高種質(zhì)資源利用效率，發(fā)掘優(yōu)異基因。

我國核心種質(zhì)研究工作起步于1994年，最先在部分農(nóng)作物上建立核心種質(zhì)[4-8]，在林木中的有關(guān)研究工作相對(duì)滯后。目前白樺Betulaplatyphylla[9]、柿Diospyroskaki[10]、灰楸Catalpafargesii[11]、歐洲黑楊Populusnigra[12]、尾葉桉Eucalyptusurophylla[13]、日本柳杉Cryptomeriajaponica[14]、銀杏Ginkgobiloba[15]、木荷Schimasuperba[16]和水青樹Tetracentronsinense[17]等樹種構(gòu)建了核心種質(zhì)。多年生林木樹體高大，占地面積廣，需耗費(fèi)大量經(jīng)費(fèi)管護(hù)，建立核心種質(zhì)可更高效地保護(hù)和利用林木種質(zhì)資源。

杉木Cunninghamialanceolata是我國南方重要的針葉用材樹種之一，具速生、材質(zhì)優(yōu)等特點(diǎn)，在國家木材儲(chǔ)備戰(zhàn)略中具有重要地位[18]。廣西從20世紀(jì)70年代開始進(jìn)行杉木遺傳改良工作，持續(xù)收集了不同產(chǎn)區(qū)的杉木種質(zhì)材料，為杉木遺傳改良提供了豐富的種質(zhì)資源[19,20]。隨著杉木種質(zhì)資源收集數(shù)量增多，保存與評(píng)價(jià)利用的難度加劇，因此構(gòu)建核心種質(zhì)對(duì)充分利用現(xiàn)有杉木種質(zhì)資源，挖掘優(yōu)異基因顯得尤為重要。本研究通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)國家杉木良種基地基因庫的864份種質(zhì)材料的遺傳多樣性，對(duì)比分析不同構(gòu)建方法的差異，從而確定合適的構(gòu)建方法和取樣比例，為廣西杉木種質(zhì)研究和挖掘優(yōu)異基因提供理論支撐與材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來自廣西融安縣西山林場(chǎng)(25°20′ N，109°23′ E)和融水苗族自治縣國營貝江河林場(chǎng)(24°57′ N，109°11′ E)國家級(jí)杉木良種基地基因庫。杉木種質(zhì)取樣總數(shù)為864份，其地理來源分別為廣西(605份)、湖南(70份)、廣東(55份)、福建(54份)、江西(40份)、貴州(31份)和湖北(9份)。

2019年11月，采集健康且無病害的杉木新鮮嫩葉，放入1.5 mL離心管后，投入液氮罐暫存，帶回實(shí)驗(yàn)室后于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器及試劑

22對(duì)SSR引物[21]由北京睿博興科公司合成，植物DNA提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，NanoDrop-2000型超微量分光光度計(jì)購自美國熱電公司，ABI 3730xl型基因測(cè)序儀購自美國ABI公司，Biometra Tone 96G PCR儀購自德國EasyCycler公司。主要試劑有氯仿、β巰基乙醇、異丙醇、50×TAE等。

1.3 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增——SSR標(biāo)記法

杉木種質(zhì)樣本基因組DNA提取按照植物DNA提取試劑盒提供的方法進(jìn)行。 (1)用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(150 V、100 mA，15-20 min)檢測(cè)DNA純度和完整度。用紫外觀測(cè)儀觀察電泳結(jié)果，若DNA分離較好，亮度較好，沒有彌散，說明提取的DNA純度較高且比較完整；若DNA沒有分離，亮度較差且存在彌散，則需要重新提取DNA。(2)用NanoDrop-2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的DNA樣品濃度。合格標(biāo)準(zhǔn)A260/A280值為1.70-1.90，若不處于此范圍則重新提取DNA。提取結(jié)果合格的各樣品DNA模板(共864份)，用TE Buffer統(tǒng)一稀釋至15 ng/μL后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Biometra Tone 96G PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為10 μL：5 μL 2×Taq plus Mix，10 μmol/L正反向引物各0.3 μL，DNA模板2 μL，去離子水加至10 μL。擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s (40 個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在美國ABI 3730xl基因測(cè)序儀上檢測(cè)，利用GeneMarker V2.2.0軟件讀取每個(gè)位點(diǎn)的片段大小。

1.4 遺傳參數(shù)分析

采用GenAlEx 6.502軟件[22]統(tǒng)計(jì)分析22對(duì)SSR引物的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和Shannon′s信息指數(shù)(I)等5個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)，利用Cervus 3.0.7[23]分析SSR引物的多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)及無效等位基因頻率(Fna)。

1.5 核心種質(zhì)構(gòu)建方法

按照杉木種質(zhì)的地理來源進(jìn)行分組，將864份材料分為廣西、湖南、廣東、福建、江西、貴州和湖北等7組，根據(jù)Core Finder軟件[24](簡稱MC法)、Power Core軟件[25](簡稱MP法)、模擬退火算法(Simulated annealing algorithm)[26]以等位基因數(shù)最大化標(biāo)準(zhǔn)(簡稱SANA法)和模擬退火算法以遺傳多樣性最大化(Maximizing genetic diversity)標(biāo)準(zhǔn)(簡稱SAGD法)分別構(gòu)建核心種質(zhì):

(1)按照等位基因數(shù)最大化(Maximizing allelic richness)標(biāo)準(zhǔn)(M策略)，運(yùn)用MC法和MP法對(duì)原始種質(zhì)進(jìn)行分析并抽取核心種質(zhì)，取樣比例由軟件自動(dòng)設(shè)定。

(2)根據(jù)SANA法，運(yùn)用Power Marker v3.25軟件構(gòu)建核心種質(zhì)，取樣比例設(shè)置為10%、15%、20%、25%和30%。

(3)根據(jù)SAGD法，運(yùn)用Power Marker v3.25軟件構(gòu)建核心種質(zhì)，取樣比例設(shè)置為10%、15%、20%、25%和30%。

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

核心種質(zhì)構(gòu)建完成后，利用SPSS 22.0對(duì)4種方法構(gòu)建的核心種質(zhì)庫與原始種質(zhì)庫的相關(guān)遺傳參數(shù)進(jìn)行有效性t檢驗(yàn)，利用主坐標(biāo)分析法(Principal Coordinates Analysis,PCoA)生成核心種質(zhì)、原始種質(zhì)的分布圖，進(jìn)一步確認(rèn)核心種質(zhì)的代表性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性分析

對(duì)864份杉木種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。22個(gè)SSR標(biāo)記的片段大小為96-295 bp。864份材料中：(1)檢測(cè)到195個(gè)等位基因(Na)，平均每對(duì)引物檢測(cè)出8.86個(gè)等位基因，其中等位基因數(shù)最多的引物是SSR12(15)、SSR16(15)，其次是SSR8(14)，最少的是SSR2(5)、SSR13(5)；(2)有效等位基因數(shù)(Ne)最多的是SSR8(6.01)，其次是SSR12(5.01)，最少的是SSR21(1.46)，平均為3.13;(3)在觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和Shannon′s信息指數(shù)(I)方面，最高的是SSR8，最低的是SSR21，平均觀測(cè)雜合度、平均期望雜合度、平均Shannon′s信息指數(shù)值分別為0.62,0.65和1.31;(4) 22對(duì)SSR引物的多態(tài)信息含量指數(shù)(PIC)值為0.30-0.82，平均值為0.60，最高的是SSR8，最低的是SSR21，其中中度多態(tài)性引物(0.250.5)有18對(duì);(5)22對(duì)SSR引物的無效等位基因頻率(Fna)均小于0.2，均值為0.03，說明22對(duì)SSR引物對(duì)遺傳多樣性參數(shù)分析沒有影響，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表1 廣西杉木種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

2.2 4種構(gòu)建方法的遺傳多樣性差異分析

對(duì)4種方法構(gòu)建的杉木核心種質(zhì)情況進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果見表2。4種構(gòu)建方法的等位基因數(shù)(Na)保留率均在75%以上，其中：(1)在等位基因數(shù)(Na)方面，MC法和MP法構(gòu)建的核心種質(zhì)Na保留比例達(dá)100%；SANA法取樣比例為10%時(shí)，Na保留率最低(丟失了48個(gè)等位基因，僅保留147個(gè));(2)在有效等位基因數(shù)(Ne)方面，SAGD法和SANA法的核心種質(zhì)Ne隨取樣比例增大呈先降低后升高的趨勢(shì)，最高的是MP法，其次是MC法，最少的是取樣比例為25%的SAGD法；MP法、MC法和SAGD(25%)法Ne保留率分別為108.7%、107.6%和99.4%;(3)在Shannon′s信息指數(shù)(I)方面，MP法、MC法的核心種質(zhì)高于原始種質(zhì)，而取樣比例為10%-30%的SANA法和SAGD法，其Shannon′s信息指數(shù)值隨取樣比例增加而升高，均能夠保留原始種質(zhì)97.7%的Shannon′s信息指數(shù)值，與原始種質(zhì)相差不大;(4)在觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)方面，4種構(gòu)建方法的核心種質(zhì)保留率均在98.4%以上。SANA法、SAGD法5個(gè)取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)的等位基因數(shù)與原始種質(zhì)的等位基因數(shù)存在顯著差異，未能保留所有的等位基因，最高的是取樣比例為30%的SANA法和SAGD法(僅保留了174個(gè)等位基因，丟失了21個(gè))，在抽取的種質(zhì)數(shù)量上比MC法多了179份，但保留的等位基因數(shù)沒有MC法的多。結(jié)合5個(gè)遺傳多樣性指標(biāo)的保留率及種質(zhì)數(shù)量進(jìn)行綜合考慮，可認(rèn)為MC法、MP法構(gòu)建的結(jié)果較好。

表2 不同方法構(gòu)建核心種質(zhì)的遺傳多樣性比較

2.3 核心種質(zhì)的確認(rèn)

為了驗(yàn)證核心種質(zhì)的有效性，利用SPSS 22.0分別對(duì)MC法、MP法構(gòu)建的核心種質(zhì)與原始種質(zhì)、核心種質(zhì)與保留種質(zhì)的5個(gè)遺傳多樣性參數(shù)(Na、Ne、I、Ho和He)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：(1)MC法構(gòu)建的核心種質(zhì)Na、Ne、I、Ho和He的保留率分別為100%、107.6%、106.9%、100%、103.1%；在等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne) 2個(gè)指標(biāo)上顯著高于MC法的保留種質(zhì)，但與原始種質(zhì)沒有顯著差異;(2)MP法構(gòu)建的核心種質(zhì)Na、Ne、I、Ho和He的保留率分別為100%、108.7%、107.6%、100%、104.6%；在等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因(Ne)2個(gè)指標(biāo)上均顯著高于Mp法的保留種質(zhì)，與原始種質(zhì)沒有差異；說明MC法、MP法對(duì)原始種質(zhì)的冗余材料進(jìn)行了剔除，有效地選擇含等位基因多的材料。

表3 遺傳多樣性參數(shù)t檢驗(yàn)

將MC法和MP法構(gòu)建的核心種質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)比較，結(jié)果表明，兩者在Na、Ne、I、Ho和He上沒有差異。相較于MP法，MC法僅保留80份種質(zhì)材料就能保留原始種質(zhì)的所有等位基因，其遺傳重復(fù)和冗余度小于MP法，因此最終選擇遺傳重復(fù)低、冗余度低的MC法篩選的80份材料作為廣西杉木核心種質(zhì)。在這80份核心種質(zhì)中，地理來源為廣西的種質(zhì)最多，有54份(占8.9%)，最少的是湖北(2份，占22.2%)(表4)。利用主坐標(biāo)分析法展示原始種質(zhì)與核心種質(zhì)的分布情況，對(duì)MC法核心種質(zhì)作進(jìn)一步確認(rèn)(圖1)，結(jié)果顯示,核心種質(zhì)與原始種質(zhì)均分布在主坐標(biāo)內(nèi)且范圍相近，說明MC法構(gòu)建的核心種質(zhì)的代表性較好。

表4 不同地理來源杉木種質(zhì)入選MC法核心種質(zhì)的數(shù)量及比例

圖1 MC法核心種質(zhì)的主坐標(biāo)分析

3 討論

目前，構(gòu)建核心種質(zhì)主要應(yīng)用表型數(shù)據(jù)和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)[27]。多年生林木容易受到環(huán)境因素影響，采用傳統(tǒng)調(diào)查方法得到的表型數(shù)據(jù)(樹高、胸徑、葉形、果實(shí)大小等)往往不能準(zhǔn)確地反映材料間的遺傳差異，且數(shù)據(jù)收集需持續(xù)多年觀測(cè)調(diào)查，整個(gè)過程耗費(fèi)巨大的人力和物力[28,29]。相較于傳統(tǒng)表型數(shù)據(jù)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有費(fèi)用低、數(shù)據(jù)獲取速度快和不受外界因素影響的特點(diǎn)，能夠真實(shí)地反映材料間差異及親緣關(guān)系，比表型數(shù)據(jù)更適用于構(gòu)建核心種質(zhì)和遺傳多樣性分析，被廣泛應(yīng)用于各類種質(zhì)資源研究[30-34]。

合理的取樣比例是成功構(gòu)建核心種質(zhì)的決定因素。國內(nèi)外研究報(bào)道中，大多數(shù)取樣比例為5%-40%[4,8,35-37]。吳昊等[38]利用苗期生長量及種子質(zhì)量性狀的表型數(shù)據(jù)構(gòu)建了野生榧樹Torreyagrandis種群的初級(jí)核心種質(zhì)，取樣比例為36%，并利用分子標(biāo)記檢測(cè)初級(jí)核心種質(zhì)，剔除了部分遺傳重復(fù)的材料，最終保留了15份材料，占原始種質(zhì)的10.56%；鐘永達(dá)等[39]基于幼苗及種子的表型數(shù)據(jù)，用4種不同聚類方法從872份材料中構(gòu)建了含218份種質(zhì)材料的中國樟樹Cinnamomumcamphora初級(jí)核心種質(zhì)，取樣比例為25%；彭嬋等[40]報(bào)道了含45份南方型美洲黑楊Populusdeltoides的初級(jí)核心種質(zhì)，占原始種質(zhì)的15%。這些研究結(jié)果表明，取樣比例隨原始種質(zhì)材料的數(shù)量增多而降低。一般來說，由于物種的獨(dú)特性，其取樣比例主要由樹種、遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性及種質(zhì)數(shù)量規(guī)模決定。本研究中共有864份杉木種質(zhì)材料，將不同取樣比例的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，其中SANA法和SAGD法的等位基因數(shù)隨著取樣比例增加而增加，但均未能保留原始種質(zhì)的全部基因，說明這2種方法在構(gòu)建核心種質(zhì)時(shí)并未能篩選出等位基因數(shù)多的材料，存在遺傳重復(fù)的材料，構(gòu)建效果較差。而MC法構(gòu)建結(jié)果的取樣比例最低(占原始種質(zhì)的9.3%，篩選出80份種質(zhì)材料)，取樣比例低于前人的研究結(jié)果[41-43]，但在等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon′s信息指數(shù)(I)、觀測(cè)雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的保留率上均達(dá)到100%，可見Mc法能用較少的種質(zhì)保留原始種質(zhì)所有等位基因數(shù)，保留效果較好。

不同構(gòu)建方法直接影響核心種質(zhì)的代表性和有效性。在進(jìn)行核心種質(zhì)構(gòu)建時(shí)，應(yīng)遵循優(yōu)先選擇特異基因和等位基因數(shù)目多的材料，以及盡可能保留含多等位基因的原則，以保證獲得的核心種質(zhì)具有最多的等位基因[44，45]。M策略是以每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)目最大化為標(biāo)準(zhǔn)，主要通過Core Finder[24]、Power Core[25]和Power Mstrat[46]這3款軟件實(shí)現(xiàn)，在構(gòu)建過程中能夠剔除材料中的遺傳重復(fù)，篩選出具等位基因數(shù)目多且冗余度低的材料，是目前最具優(yōu)勢(shì)的構(gòu)建方法之一。本研究的MC法、MP法、SANA法是以等位基因數(shù)最大化為標(biāo)準(zhǔn)，能夠篩選出具等位基因多的材料，而SAGD法是以遺傳多樣性最大化為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出的材料具有較大遺傳多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SANA法和SAGD法構(gòu)建結(jié)果不佳，而Core Finder軟件和Power Core軟件構(gòu)建結(jié)果的Na、Ne、I、Ho、He等5個(gè)遺傳參數(shù)的保留率高于SANA法和SAGD法，說明MC法和MP法優(yōu)于SAGD法和SANA法。在選擇核心種質(zhì)材料時(shí)，MC法、MP法均選擇等位基因數(shù)目多且冗余度低的材料，相比而言，Core Finder軟件的構(gòu)建結(jié)果比Power Core軟件的少了18份，僅用80份核心種質(zhì)保留了864份原始種質(zhì)中的全部等位基因，其構(gòu)成的核心種質(zhì)庫更為精簡，遺傳重復(fù)和冗余度更低。

廣西是全國杉木主產(chǎn)區(qū)之一，1976年和1979年，廣西區(qū)內(nèi)29個(gè)種源參加全國杉木產(chǎn)區(qū)的種源試驗(yàn)，廣西融水種源在兩次試驗(yàn)中表現(xiàn)突出，其因適應(yīng)范圍廣，單株材積大、樹高和胸徑生長量高且穩(wěn)定，被認(rèn)定為全國杉木優(yōu)良種源之一。廣西屬典型的喀斯特地貌，地形復(fù)雜多變，山地丘陵居多，北回歸線橫穿境內(nèi)，南北溫差大，各地種源在生長量和適應(yīng)性方面存在差異，具較強(qiáng)的地域性。受喀斯特地理隔離影響，廣西境內(nèi)還有一些特異的種質(zhì)資源，如念水糠杉、白云糠杉和四榮紅心杉等[20,47,48]。融江河流域位于全國優(yōu)良種源南嶺的西部，是廣西杉木的中心產(chǎn)區(qū)[49-51]。本研究廣西的605份材料中，主要由融水(262份)、融安(152份)、河池(75份)、桂林(36份)、玉林(34份)、百色(19份)、梧州(13份)、南寧(7份)和欽州(7份)等9個(gè)不同市縣的種質(zhì)構(gòu)成。入選的80份核心種質(zhì)中，有54份材料來自廣西，其中廣西杉木中心產(chǎn)區(qū)來自融水縣(20份)、融安縣(15份)的種質(zhì)材料居多，其余的分別來自河池(7份)、百色(5份)、桂林(3份)、梧州(2份)、玉林(2份)和欽州(1份)，本次入選的種質(zhì)材料基本涵蓋了整個(gè)廣西杉木分布區(qū)。未入選核心種質(zhì)的材料仍不能隨意舍棄，當(dāng)核心種質(zhì)遭受自然災(zāi)害發(fā)生衰亡或無當(dāng)前生產(chǎn)實(shí)踐所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和抗逆性強(qiáng)的重要性狀時(shí)，可從保留種質(zhì)中尋找相似材料進(jìn)行補(bǔ)充[24]。隨著核心種質(zhì)的深入研究，需要及時(shí)對(duì)核心種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)和材料進(jìn)行調(diào)整與更新，不斷增補(bǔ)新發(fā)現(xiàn)的特異材料，使其具有更豐富的遺傳變異，更合理的遺傳結(jié)構(gòu)。

本研究利用SSR分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，通過對(duì)比分析不同構(gòu)建方法的差異，從而確定以等位基因數(shù)最大化為標(biāo)準(zhǔn)(M策略)、通過Core Finder軟件構(gòu)建廣西杉木核心種質(zhì)的構(gòu)建方法。由于缺少生長量、抗逆性等表型數(shù)據(jù)以及SSR分子標(biāo)記數(shù)量的限制，并沒有將表型數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)結(jié)合起來構(gòu)建，今后的研究中仍需收集調(diào)查表型生長性狀，將兩者相結(jié)合起來，對(duì)核心種質(zhì)作進(jìn)一步全面分析和調(diào)整。

4 結(jié)論

本研究基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，以廣西杉木864份種質(zhì)為材料，通過構(gòu)建方法篩選，最終確定M策略(Core Finder軟件)構(gòu)建方法，并構(gòu)建了含80份材料的廣西杉木核心種質(zhì)，其中，種質(zhì)數(shù)占原始種質(zhì)的9.3%，Na、Ne、I、Ho和He遺傳多樣性參數(shù)的保留率達(dá)100%，經(jīng)主坐標(biāo)分析和t檢驗(yàn)，驗(yàn)證所構(gòu)建的核心種質(zhì)與原始種質(zhì)差異不顯著，分布范圍與原始種質(zhì)基本一致，說明構(gòu)建結(jié)果有效且具較好的代表性，可為廣西杉木種質(zhì)資源優(yōu)異基因資源挖掘、創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)與材料基礎(chǔ)。