單分子成像和追蹤技術(shù)在工業(yè)微生物研究中的應(yīng)用*

嚴(yán)少敏，吳 光

(廣西科學(xué)院，國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

0 引言

隨著環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展的強(qiáng)烈需求，綠色制造備受關(guān)注?，F(xiàn)代科技的迅猛發(fā)展提升了生物工程、代謝工程、合成生物學(xué)等領(lǐng)域的創(chuàng)新能力，工業(yè)微生物的應(yīng)用也日趨廣泛。然而，作為生產(chǎn)單元的底盤細(xì)胞，活的微生物菌株不斷對(duì)生產(chǎn)過程中的各種應(yīng)激做出響應(yīng)，難以在整個(gè)培養(yǎng)期間保持最大的生產(chǎn)能力，導(dǎo)致在經(jīng)濟(jì)效益上無法滿足產(chǎn)業(yè)化的要求。這個(gè)制約微生物細(xì)胞工廠發(fā)展的瓶頸問題，對(duì)酶學(xué)研究提出了新的挑戰(zhàn)。

單分子成像和追蹤技術(shù)具有獨(dú)特的監(jiān)測(cè)優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)活體生物實(shí)施直接、準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的觀察，實(shí)現(xiàn)對(duì)單分子酶催化過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。這些技術(shù)的應(yīng)用使多種酶的新單分子行為及反應(yīng)機(jī)制被發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了各種新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研發(fā)。在各種單分子工具和技術(shù)中，單分子熒光顯微鏡技術(shù)脫穎而出，它能夠高特異性地監(jiān)測(cè)熒光標(biāo)記的生物分子的時(shí)空行為，成為研究生物系統(tǒng)的有力工具。

目前，在工業(yè)微生物及酶工程領(lǐng)域的研究中，單分子成像和追蹤技術(shù)的應(yīng)用亟待提高。本文從單分子成像和追蹤技術(shù)的主要特點(diǎn)(以熒光顯微鏡為主)及其在微生物研究和酶學(xué)研究中的應(yīng)用，在工業(yè)微生物研究中的應(yīng)用和挑戰(zhàn)等4方面探討了相關(guān)內(nèi)容，旨在推動(dòng)酶的工程改造，提高細(xì)胞工廠的生產(chǎn)能力。

1 單分子成像和追蹤技術(shù)的主要特點(diǎn)

單分子工具和技術(shù)涉及面廣，包括原子力顯微鏡、單分子熒光顯微鏡、光鑷、磁鑷、納米孔鑷以及增加可觀察物數(shù)量的混合技術(shù)[1]。這些方法可以通過施加力和力矩，操縱單個(gè)生物分子，觀察單個(gè)運(yùn)動(dòng)復(fù)合體的動(dòng)態(tài)構(gòu)象變化。其中熒光顯微鏡具有極高的對(duì)比度、標(biāo)記的特異性、對(duì)生物樣品的干擾相對(duì)較小的特點(diǎn)，伴隨著監(jiān)測(cè)器、染料技術(shù)和圖像分析方法的技術(shù)進(jìn)步，單分子熒光顯微鏡技術(shù)脫穎而出，成為研究生物系統(tǒng)的有力工具，因?yàn)樗梢愿咛禺愋缘乇O(jiān)測(cè)幾乎任何熒光標(biāo)記的生物分子的時(shí)空行為。這樣的“超分辨率”顯微技術(shù)，就是以比光學(xué)分辨率極限更高的精度呈現(xiàn)空間信息的光學(xué)成像技術(shù)[2]。

實(shí)現(xiàn)超分辨率的最簡單方法是避免在遠(yuǎn)場(chǎng)區(qū)域成像，執(zhí)行近場(chǎng)成像(即熒光源和檢測(cè)器之間的距離小于幾個(gè)波長的光)，從而避免受到顯著的光學(xué)衍射效應(yīng)的影響。單分子定位顯微鏡具有兩方面功能，單分子成像能夠在納米尺度上解析生物結(jié)構(gòu)，單分子追蹤可以在毫秒范圍內(nèi)監(jiān)測(cè)分子間相互作用。其基本工作原理是通過控制單個(gè)熒光團(tuán)的熒光發(fā)射，實(shí)現(xiàn)比傳統(tǒng)熒光顯微鏡方法更高的分辨率。隨著時(shí)間的推移，通過“閃爍信號(hào)”策略可以獲得不同小熒光團(tuán)子集的圖像，并且可以高精度定位每個(gè)單獨(dú)熒光信號(hào)的質(zhì)心，以創(chuàng)建詳細(xì)的分子圖和納米尺度的超分辨圖像[3]。

單分子定位成像中最常用的熒光團(tuán)是熒光蛋白和有機(jī)染料。熒光蛋白具有遺傳標(biāo)記的優(yōu)勢(shì)，具有β-桶狀蛋白結(jié)構(gòu)保護(hù)中間的發(fā)色團(tuán)。有機(jī)染料通常比熒光蛋白提供更高的熒光量子產(chǎn)率，并且可以在化學(xué)合成過程中定制。例如，通過不同離域的π-電子系統(tǒng)設(shè)計(jì)微調(diào)其光譜性質(zhì)，通過增加發(fā)色團(tuán)兩側(cè)的基團(tuán)來增加其溶解度和光穩(wěn)定性。此外，由于可以添加可變標(biāo)簽組，有機(jī)染料的應(yīng)用非常靈活[3]。

英國約克大學(xué)生物物理科學(xué)研究所的Shashkova和Leake總結(jié)了單分子熒光顯微鏡技術(shù)的主要特點(diǎn)及其應(yīng)用[2]，相關(guān)內(nèi)容見表1。北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的孫育杰團(tuán)隊(duì)總結(jié)了5種單分子成像顯微鏡的成像模式[4]，相關(guān)內(nèi)容見表2。

表1 單分子熒光顯微鏡技術(shù)的主要特點(diǎn)

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 5種單分子成像顯微鏡的成像模式

2 單分子成像和追蹤技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用

活體微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)研究經(jīng)歷了細(xì)胞整體、單個(gè)細(xì)胞、亞細(xì)胞、低拷貝單分子、任意低拷貝單分子的發(fā)展過程[5]。在活的微生物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)存在三大障礙，即受到靈敏度、空間分辨率和光穩(wěn)定性的限制。

綠色熒光蛋白(GFP)的出現(xiàn)，提供了一種標(biāo)記蛋白質(zhì)的簡單的基因方法，該方法能夠標(biāo)記細(xì)胞中許多不同的生物分子，使對(duì)細(xì)菌的研究從群體研究快速過渡到單細(xì)胞研究，實(shí)現(xiàn)了許多細(xì)菌蛋白質(zhì)、染色體和質(zhì)粒DNA以及膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞分布的成像，成為微生物研究中的里程碑[6]。對(duì)活細(xì)菌進(jìn)行的第一次單分子熒光研究使用了熒光探針的多個(gè)拷貝，檢測(cè)細(xì)胞中的信使RNA(mRNA)分子。一個(gè)流行的系統(tǒng)依賴于RNA發(fā)夾和MS2噬菌體衣殼蛋白之間的高親和力相互作用；通過在相關(guān)mRNA中引入發(fā)夾的多個(gè)重復(fù)序列，并表達(dá)與GFP衍生物融合的MS2蛋白，可以間接地用GFP標(biāo)記mRNA分子。

在裂變酵母中，將一種快速成熟的黃色熒光蛋白(YFP)基因與一種膜定位蛋白片段(Tsr)的染色體拷貝進(jìn)行基因融合，通過lac操作子控制YFP-Tsr基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，檢測(cè)新合成的熒光蛋白質(zhì)，定位并追蹤其擴(kuò)散，建立一個(gè)可以恢復(fù)活細(xì)胞內(nèi)基本過程的定量信息，可以直接在細(xì)胞中測(cè)量蛋白質(zhì)的位置、拷貝數(shù)及其出現(xiàn)的時(shí)間[7]。

雙標(biāo)記系統(tǒng)通過DNA結(jié)合蛋白與插入細(xì)菌染色體或質(zhì)粒的特定DNA序列基序的相互作用來“標(biāo)記”DNA上的特定位點(diǎn)。例如，熒光阻遏算子系統(tǒng)(基于轉(zhuǎn)錄阻遏，如lacI和tetR)；parB-parS系統(tǒng)(基于質(zhì)粒分割蛋白parB，在染色體中引入的parS位點(diǎn)上的結(jié)合和隨后的擴(kuò)增)。多探針方法在單分子微生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用，包括分析細(xì)菌染色體中核糖體RNA操縱子的三維結(jié)構(gòu)，DNA復(fù)制過程中復(fù)制叉的運(yùn)動(dòng)，細(xì)菌質(zhì)粒的流動(dòng)性和位置，染色體重組，動(dòng)力學(xué)的直接研究等[5]。

單分子成像和追蹤技術(shù)已廣泛用于微生物研究中，包括DNA修復(fù)[8-10]、轉(zhuǎn)錄機(jī)制[11-13]、膜生物學(xué)[14]、類核結(jié)構(gòu)[11,15,16]、細(xì)胞分裂[3,15,17-19]、胞吞作用[20]、纖毛結(jié)構(gòu)[21]、分泌系統(tǒng)[22,23]、生物膜[24]等許多方面。分子計(jì)數(shù)的一個(gè)重要擴(kuò)展是研究在細(xì)胞分子機(jī)制中組裝(穩(wěn)定或瞬時(shí))的蛋白質(zhì)組分的數(shù)量，即大分子機(jī)器的亞單位化學(xué)計(jì)量，通過在體內(nèi)追蹤單個(gè)蛋白質(zhì)，直接測(cè)量體內(nèi)反應(yīng)時(shí)間，研究分子間的相互作用。例如，通過鞭毛將含有MotB-GFP染色體拷貝的細(xì)胞表面固定化，并通過亮場(chǎng)和全內(nèi)反射熒光顯微鏡交替觀察細(xì)胞的旋轉(zhuǎn)[25]。

單分子追蹤的數(shù)據(jù)分析豐富了觀察信息。如追蹤光激活定位顯微鏡，提供了定位和追蹤的數(shù)量作為感興趣蛋白質(zhì)拷貝數(shù)的估計(jì)值；通過分析徑跡內(nèi)的位移來計(jì)算每個(gè)徑跡的表觀擴(kuò)散系數(shù)(考慮二維擴(kuò)散)，可以恢復(fù)蛋白質(zhì)擴(kuò)散過程；從屬于不同遷移組的蛋白質(zhì)分子軌跡的相對(duì)位置推斷出大量的空間信息；蛋白質(zhì)遷移不同模式之間的轉(zhuǎn)換可提供生化反應(yīng)或結(jié)合動(dòng)力學(xué)的信息[5,26]。

3 單分子成像和追蹤技術(shù)在酶學(xué)研究中的應(yīng)用

對(duì)于酶工程領(lǐng)域來說，酶學(xué)研究正處于一個(gè)拐點(diǎn)。在分子生物學(xué)技術(shù)的推動(dòng)下，酶工程技術(shù)獲得了突破性的發(fā)展，通過開創(chuàng)性地借助分子生物學(xué)的方法進(jìn)行快速而廣泛的分子定向進(jìn)化，從而改變酶的功能或特性，推動(dòng)了酶工程的應(yīng)用價(jià)值[27]。而且，改良的DNA技術(shù)、各種生物信息學(xué)中的新工具，以及新時(shí)代對(duì)“綠色催化”的強(qiáng)烈需求，都推動(dòng)和促進(jìn)了酶工程的發(fā)展[28]。對(duì)酶制劑的需求不僅局限在傳統(tǒng)領(lǐng)域，在新興領(lǐng)域酶制劑也獲得了廣泛應(yīng)用[29]。制藥、環(huán)境、精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域?qū)γ钢苿┑钠惹行枨?，推?dòng)和促進(jìn)了各種新型酶、新特性酶、新作用方式酶的研發(fā)[6]。這些研發(fā)涉及創(chuàng)造新的，通常是具有非天然催化活性，或者非天然底物反應(yīng)等的新酶。這些新酶的研發(fā)可以為使用化學(xué)合成工藝的傳統(tǒng)制藥領(lǐng)域帶來新的、可持續(xù)的綠色催化工藝，而且可以引入更具有特異性的催化路線[30]。然而，這對(duì)研發(fā)新特性酶的酶工程而言提出了更大的挑戰(zhàn)。

在現(xiàn)階段，酶學(xué)研究和酶工程改造通常依賴于已知酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。例如，纖維素酶的蛋白質(zhì)工程主要有兩個(gè)趨勢(shì)：第一，計(jì)算蛋白質(zhì)工程的結(jié)果對(duì)于推動(dòng)該領(lǐng)域的研究越來越重要，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)想和結(jié)果仍然很少；第二，進(jìn)一步研究纖維素水解的輔助蛋白，如溶解性多糖單加氧酶(LPO)，以改進(jìn)纖維素酶的屬性和結(jié)構(gòu)[31]。由于蛋白質(zhì)結(jié)晶和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，大部分酶都沒有提供蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息[32]，因此，以往在對(duì)酶分子改造的研究中，假設(shè)在反應(yīng)條件下(低酶濃度、高底物濃度、有機(jī)溶劑等)酶的結(jié)構(gòu)與結(jié)晶酶(高酶濃度、無底物和/或有機(jī)溶劑)的結(jié)構(gòu)非常相似，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行各種研究。實(shí)際上，酶在不同條件下的分子作用方式差異極大[33]，根據(jù)結(jié)晶酶及其催化反應(yīng)條件等來設(shè)計(jì)酶的改造策略往往是失敗的。

因此，對(duì)于酶工程研究來說，急需一種快速直接的蛋白質(zhì)特性分析手段，為酶工程改造提供技術(shù)支撐。單分子成像技術(shù)具備這個(gè)優(yōu)勢(shì)。利用單分子成像可以直接對(duì)單分子酶的催化過程實(shí)時(shí)監(jiān)控，直接觀察到蛋白質(zhì)在各種不同條件下的作用方式，特別是單個(gè)蛋白質(zhì)的各種氨基酸殘基的作用力學(xué)變化，這個(gè)優(yōu)勢(shì)使得研究人員可以根據(jù)每個(gè)催化反應(yīng)來觀察分子變化，從而加速了催化策略或分子改造策略的實(shí)施方案[34,35]。

單分子酶蛋白質(zhì)研究是新近隨著分析儀器的更新和進(jìn)步，在生命科學(xué)領(lǐng)域開拓出來的新熱點(diǎn)和新技術(shù)手段。生物學(xué)中的各種反應(yīng)，都是由單個(gè)分子的各種反應(yīng)聚集而成的宏觀現(xiàn)象。實(shí)際上，分子相互作用和化學(xué)反應(yīng)總在單分子水平上發(fā)生，但由于研究手段的限制，各種化學(xué)反應(yīng)和生物反應(yīng)的數(shù)據(jù)幾乎都是從含有大量分子的實(shí)驗(yàn)中得到。對(duì)于由微觀匯集成宏觀的生物反應(yīng)過程，利用傳統(tǒng)的研究手段無法觸探到反應(yīng)的本質(zhì)，只能是采用間接的方法，通過宏觀的現(xiàn)象變化推測(cè)分子級(jí)別的反應(yīng)特性。

隨著生命科學(xué)中分析儀器和分析技術(shù)的發(fā)展，對(duì)單個(gè)分子進(jìn)行分析成為可能。從20世紀(jì)90年代中期開始，許多研究人員轉(zhuǎn)向室溫單分子檢測(cè)，尤其是生物體系的單分子研究，實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞單分子生化反應(yīng)的高特異性、毫秒時(shí)間分辨率的探測(cè)。在過去的十年中，科學(xué)和技術(shù)的進(jìn)步使生物催化成為實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)規(guī)?；瘜W(xué)合成中，傳統(tǒng)金屬和有機(jī)催化實(shí)用和環(huán)境友好的替代品。隨著DNA測(cè)序和基因合成技術(shù)取得的關(guān)鍵進(jìn)展，在通過蛋白質(zhì)工程和設(shè)計(jì)裁剪生物催化劑以及將酶重組為新的生物合成途徑的能力方面取得了巨大進(jìn)展[36]。由于單分子技術(shù)具有避免集群研究的平均效應(yīng)、捕獲瞬態(tài)中間產(chǎn)物和表征非均一行為等優(yōu)勢(shì)，科研人員得以觸探到生物反應(yīng)的本質(zhì)變化，從而使生物學(xué)的許多領(lǐng)域取得重要突破。

利用單分子成像和追蹤技術(shù)在研究酶和DNA的相互作用方式中，誕生了單分子測(cè)序方法，即現(xiàn)在所稱的第三代測(cè)序技術(shù)。單分子測(cè)序不需要任何PCR的過程，有效避免了以前的測(cè)序方法因PCR偏向性而導(dǎo)致的系統(tǒng)錯(cuò)誤，同時(shí)具有提高讀長，并保持二代技術(shù)的高通量、低成本的優(yōu)點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)了技術(shù)上的大跨越。利用單分子原理的測(cè)序技術(shù)儀器也得到推廣，并且逐步取代在2008年才面世的第二代測(cè)序儀器，進(jìn)入第三代測(cè)序時(shí)代[37]。

單細(xì)胞基因組學(xué)通過單分子技術(shù)與基因組學(xué)的交匯，實(shí)現(xiàn)在單細(xì)胞中檢測(cè)基因拷貝數(shù)以及單個(gè)點(diǎn)突變。與此同時(shí)單分子成像和追蹤技術(shù)用于追蹤運(yùn)動(dòng)軌跡，探明細(xì)胞中單個(gè)分子或單個(gè)粒子的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)[38]。所以，單分子實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果不僅是對(duì)以往總體平均研究方法的有力補(bǔ)充，而且在許多方面單分子技術(shù)已成為深入研究酶的生物活性不可或缺的手段。

單分子成像和追蹤技術(shù)在酶工程研究中得到應(yīng)用，如對(duì)分子馬達(dá)機(jī)械力化學(xué)耦合的深入分析使人工工程馬達(dá)的發(fā)展成為可能。分子馬達(dá)是一種將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為機(jī)械能的酶，在這種酶的作用下，它可以執(zhí)行關(guān)鍵的細(xì)胞功能，如DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、DNA超螺旋、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和ATP合成。單分子成像和追蹤技術(shù)已被廣泛用于識(shí)別分子馬達(dá)反應(yīng)循環(huán)中的結(jié)構(gòu)中間體，并了解能量消耗的子步驟如何驅(qū)動(dòng)中間體之間的轉(zhuǎn)換。這些技術(shù)被應(yīng)用于研究各種馬達(dá)，如螺旋酶、DNA和RNA聚合酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、核小體重組子，以及參與DNA縮合、分離和消化的馬達(dá)[1]。通過突變、化學(xué)修飾和光遺傳學(xué)等技術(shù)，重新設(shè)計(jì)現(xiàn)有的分子馬達(dá)，例如改變速度、過程性或功能性[1,39]。

基于單分子成像和單分子生物學(xué)的研究結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞里直接觀測(cè)生物大分子。中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的研究團(tuán)隊(duì)鑒定了兩種核酸內(nèi)切酶缺陷、單組分可編程RNA引導(dǎo)和RNA靶向Cas13 RNA酶(dCas13)，可對(duì)活細(xì)胞中的RNA進(jìn)行穩(wěn)健的實(shí)時(shí)成像和跟蹤。dCas13和dCas9(Cas9的突變形式，其內(nèi)切核酸酶活性通過點(diǎn)突變被去除)系統(tǒng)的進(jìn)一步組合允許同時(shí)可視化活細(xì)胞中的基因組DNA和RNA轉(zhuǎn)錄[40]。

使用納米拷貝技術(shù)可以放大單個(gè)標(biāo)記基因，從而能夠在擁擠的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，在可尋址的亞衍射體積中進(jìn)行單分子檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)以單分子分辨率對(duì)RNA聚合酶Ⅱ(Pol Ⅱ)進(jìn)行成像、跟蹤和量化，揭示其在轉(zhuǎn)錄周期中的動(dòng)態(tài)，并進(jìn)一步研究多個(gè)功能相關(guān)事件—調(diào)節(jié)因子—染色質(zhì)相互作用、Pol Ⅱ動(dòng)力學(xué)和新生轉(zhuǎn)錄動(dòng)力學(xué)，揭示了迄今為止在體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)的基因調(diào)控機(jī)制的詳細(xì)操作參數(shù)[41]。此外，一種基于納米結(jié)構(gòu)的雙色熒光探針，通過雙色共定位成像提高了測(cè)量精度，從而大大避免了假陽性信號(hào)，并實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中微小RNA的實(shí)時(shí)原位成像，推進(jìn)了在單分子水平上對(duì)活細(xì)胞中各種生物分子進(jìn)行無酶放大監(jiān)測(cè)和成像[42]。

4 單分子成像和追蹤技術(shù)在工業(yè)微生物研究中的應(yīng)用和挑戰(zhàn)

隨著生物工程技術(shù)和計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)的迅猛發(fā)展，工業(yè)微生物的應(yīng)用日趨廣泛。近年來，新的合成生物學(xué)方法提高了原始菌株的高附加值次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，新的生物合成基因簇的挖掘和構(gòu)建開辟了工程菌株的應(yīng)用途徑[43]。代謝工程提供了以可再生方式生產(chǎn)新分子的極好能力，拓寬了通過細(xì)胞系統(tǒng)從化學(xué)元素合成有用產(chǎn)品的范圍，加速了生物燃料、生物材料和納米技術(shù)的應(yīng)用[44]。但是，隨著培養(yǎng)條件和細(xì)胞狀態(tài)的動(dòng)態(tài)變化，底盤細(xì)胞不能在整個(gè)培養(yǎng)期間保持最大的生產(chǎn)能力，在經(jīng)濟(jì)效益上不能滿足產(chǎn)業(yè)化的需求，成為制約微生物細(xì)胞工廠發(fā)展的瓶頸。

工業(yè)微生物在發(fā)酵過程中通常作為活細(xì)胞催化劑，常用的工業(yè)微生物有細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌。單分子成像和追蹤技術(shù)在工業(yè)微生物研究中得到了應(yīng)用。德國馬克斯普朗克陸地微生物研究所的研究團(tuán)隊(duì)詳細(xì)總結(jié)了單分子成像和追蹤技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀特點(diǎn)[3]，歸納為圖1。從圖1可見該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀有以下特點(diǎn)：①單色研究為主，多色研究尚不多見；②大多數(shù)研究在模式微生物中進(jìn)行；③結(jié)構(gòu)成像較多，單粒子追蹤很少；④大多數(shù)研究按時(shí)間順序記錄不同的靶點(diǎn)，并行成像較少；⑤在各種標(biāo)記方法中，最主要的是基因標(biāo)記，特別是熒光蛋白融合；⑥成熟的多色標(biāo)簽不多。因此，單分子成像和追蹤技術(shù)在工業(yè)微生物研究中的應(yīng)用仍處在起步階段，這是因?yàn)槠湓趯?shí)際應(yīng)用中面臨諸多挑戰(zhàn)。

圖1 單分子成像和追蹤技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀

微生物細(xì)胞是小而密集的單細(xì)胞有機(jī)體，其特點(diǎn)是具有強(qiáng)大的細(xì)胞壁保護(hù)，特定的自體熒光或彩色色素背景，蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)相當(dāng)?shù)停L速度和新陳代謝速度卻相當(dāng)快[3]。在微生物細(xì)胞中進(jìn)行單分子檢測(cè)是一項(xiàng)復(fù)雜的工作，這是因?yàn)槠渲写嬖趶?fù)雜的擴(kuò)散模式；許多熒光蛋白傾向于寡聚，扭曲的相互作用會(huì)使蛋白質(zhì)的定位和聚集狀態(tài)發(fā)生改變；在同一個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行雙色/多色測(cè)量，共定位檢測(cè)技術(shù)相當(dāng)復(fù)雜；準(zhǔn)確計(jì)算分子數(shù)量是復(fù)雜的，可能出現(xiàn)計(jì)算不足或過多的情況，需要有每個(gè)特定的熒光蛋白在特定的細(xì)胞環(huán)境中檢測(cè)效率的知識(shí)。

蛋白質(zhì)完全熒光融合的方法在應(yīng)用中仍然存在限制，難以處理中到大拷貝數(shù)的蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈儠?huì)使典型的細(xì)菌細(xì)胞過于熒光“擁擠”，因此很難研究大多數(shù)蛋白質(zhì)在活細(xì)菌中的自然拷貝數(shù)行為。對(duì)低拷貝數(shù)的需求也妨礙了從單個(gè)細(xì)胞收集大量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，從而限制了研究分子異質(zhì)性的機(jī)會(huì)，這種異質(zhì)性可能反映化學(xué)異質(zhì)性(共價(jià)或非共價(jià))或不同的細(xì)胞環(huán)境[5]。

標(biāo)記分子的正常生理功能可能受到干擾。例如，在DNA上標(biāo)記標(biāo)簽可能會(huì)干擾局部染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；內(nèi)切酶(TALE，Cas9)或抑制物與染色質(zhì)的結(jié)合可能干擾基因轉(zhuǎn)錄；將多個(gè)適配體外殼蛋白標(biāo)記到單個(gè)mRNA會(huì)顯著增加mRNA的大小，從而干擾轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)；蛋白質(zhì)標(biāo)記的潛在缺陷可能源于內(nèi)源性標(biāo)記和外源性標(biāo)記分子之間的差異；大多數(shù)單分子成像都是在外源蛋白上進(jìn)行，由于靶蛋白的過度表達(dá)，很可能會(huì)產(chǎn)生人為的效應(yīng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)等基因工程技術(shù)可以有效地將標(biāo)記模塊插入靶標(biāo)分子的內(nèi)源性基因組位點(diǎn)，使融合分子在生理水平上表達(dá)，實(shí)現(xiàn)在生理相關(guān)水平上對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行成像[22]。

熒光探針的不理想性能和光毒性，可能導(dǎo)致對(duì)單分子數(shù)據(jù)的不精確甚至不正確解釋。蛋白質(zhì)停留時(shí)間的計(jì)算取決于標(biāo)記熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性，胞內(nèi)成像所需的標(biāo)記性能與現(xiàn)有的探針相比還有很大的差距，長期、連續(xù)、快速、低光毒性的單分子成像需要更明亮、更穩(wěn)定、更簡單的探針和標(biāo)記方法，有待開發(fā)用于活細(xì)胞單分子成像的優(yōu)秀探針。進(jìn)一步優(yōu)化非傳統(tǒng)熒光團(tuán)，例如納米體、量子點(diǎn)、共軛半導(dǎo)體聚合物點(diǎn)和碳納米點(diǎn)，可能成為活細(xì)胞單分子成像的優(yōu)秀探針[4]。

對(duì)于單分子動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞行為之間的聯(lián)系，目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都是在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系上進(jìn)行，由于光的散射，很難在生物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)單分子成像。另外，組織細(xì)胞在培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)和馴化可能引起細(xì)胞性狀和組織成分的改變，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的誤解。大體積的高速成像是光片顯微技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的重要方向，自適應(yīng)光學(xué)、光片顯微鏡和明亮的基因編碼標(biāo)簽的結(jié)合將使單分子成像更加深入[4]。

當(dāng)?shù)孜锖兔敢院艿偷目截悢?shù)存在時(shí)，還應(yīng)考慮生化反應(yīng)的波動(dòng)，許多過程具有區(qū)隔效應(yīng)，在限制拷貝數(shù)的過程中多功能蛋白質(zhì)之間存在競爭，無法復(fù)制構(gòu)成活細(xì)胞自然環(huán)境復(fù)雜的生物分子混合物[5]。

現(xiàn)有的成像工作已是“大數(shù)據(jù)”項(xiàng)目，所提供的大數(shù)據(jù)集，需要復(fù)雜的圖像和時(shí)間序列分析來探測(cè)蛋白質(zhì)的位置和流動(dòng)性。大數(shù)據(jù)集的可用性以及定量的、統(tǒng)計(jì)上可靠的、基于成像的活體內(nèi)分子特性信息，從活體內(nèi)的分子擴(kuò)散到復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)和分子機(jī)器的功能，也為構(gòu)建描述許多過程的數(shù)學(xué)模型提供了極好的輸入[45]。伴隨著合成生物學(xué)家生產(chǎn)的工程合成細(xì)胞、成像分辨率和通量的提高，將進(jìn)一步擴(kuò)大數(shù)學(xué)模型的應(yīng)用范圍。

許多因素會(huì)影響微生物細(xì)胞內(nèi)單分子成像的性能，需要進(jìn)一步提高單分子成像的性能。可通過擴(kuò)展研究方法，如改進(jìn)的熒光團(tuán)和標(biāo)記方法，高級(jí)微拷貝、分辨率更高、內(nèi)容更豐富、照片損傷更低的成像技術(shù)，力傳感器，微流體，數(shù)據(jù)分析程序，數(shù)學(xué)建模等，增強(qiáng)單分子成像的能力和適用性[46]。

所有使用的單分子工具都已接近當(dāng)前的技術(shù)極限。在用納米技術(shù)研究納米生物學(xué)問題時(shí)，每一項(xiàng)新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用都離不開方法的改進(jìn)。一個(gè)懸而未決的問題是如何追蹤動(dòng)態(tài)、協(xié)同移動(dòng)的交互靶標(biāo)。探針的發(fā)展可能改變當(dāng)前的技術(shù)限制，包括研發(fā)能長時(shí)間和更精確地追蹤不同微生物靶點(diǎn)軌跡，能標(biāo)記更小靶點(diǎn)的探針，不干擾細(xì)胞生物學(xué)，高標(biāo)記密度和效率的探針[3]。

采用盡量減少樣品體積，設(shè)計(jì)光穩(wěn)定性更好的熒光蛋白新變體，提高相機(jī)探測(cè)器的靈敏度，以提高信號(hào)的檢測(cè)能力。開發(fā)各種分析工具來提高信噪比，如細(xì)胞圖像的自動(dòng)“分割”方法，用于追蹤熒光標(biāo)記分子的穩(wěn)健軟件算法，追蹤分子形成的分子絡(luò)合物的化學(xué)計(jì)量分析。

對(duì)細(xì)胞工廠中生產(chǎn)單元的細(xì)胞進(jìn)行單分子成像分析，可借助微流控裝置，控制菌細(xì)胞的大小或形狀，將細(xì)胞引入不同的微環(huán)境，測(cè)試對(duì)環(huán)境暴露的反應(yīng)，或監(jiān)測(cè)不同菌株之間的相互作用(合作或?qū)?[46]。

5 展望

單分子成像和追蹤技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)部生命的直接可視化和原位測(cè)量，對(duì)理解生物過程至關(guān)重要，在生物學(xué)研究中帶來了許多深刻的發(fā)現(xiàn)。單分子成像和追蹤技術(shù)在工業(yè)微生物中的研究仍處在起步階段，在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)。展望未來，單分子成像和追蹤技術(shù)的應(yīng)用必將促進(jìn)納米生物學(xué)的發(fā)展，推動(dòng)酶工程改造，提高細(xì)胞工廠的生產(chǎn)能力。