高劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)成年雄性小鼠PDGF-BB分泌及H型血管生長(zhǎng)的作用研究

李素麗 詹先琴 張艷君 馬艷榮 王英 王燕

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院,新疆 烏魯木齊 830001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量降低、骨脆性增加、骨強(qiáng)度下降、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為特征的全身性、代謝性骨病[1]。在繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)是臨床上常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥之一，多伴有骨質(zhì)疏松或并發(fā)骨折。大量研究表明，超生理量的類固醇激素及其類似物對(duì)骨骼系統(tǒng)的發(fā)育、生長(zhǎng)與細(xì)胞代謝有明顯不利影響。歐洲絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松婦女指南已經(jīng)明確將每日使用強(qiáng)的松龍5 mg、時(shí)間超過3個(gè)月或更長(zhǎng)作為骨質(zhì)疏松癥的臨床危險(xiǎn)因素[2]。

目前GIOP治療的藥物多局限在雙膦酸鹽、性激素替代及重組甲狀旁腺素、抗RANKL單克隆抗體的治療上[2-4]，對(duì)于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的病因還不是很清楚。本研究將探討長(zhǎng)期高劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)成年雄性小鼠破骨前體細(xì)胞PDGF-BB分泌的影響以及對(duì)骨成長(zhǎng)特異的H型血管生長(zhǎng)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:12只雄性3月齡C57小鼠，體重21～24 g [購于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001]。

1.1.2實(shí)驗(yàn)儀器及試劑小動(dòng)物Micro-CT儀(德國Bruker公司SkyScan 1176)；冰凍切片機(jī)(LEICA CM1950)；熒光顯微鏡(日本尼康Nikon Eclipse TS2R)；成像系統(tǒng)(日本尼康Nikon DS-Ri2)；強(qiáng)的松龍[愛必信(上海)生物科技有限公司，CAS號(hào)：83-43-2]；rhPDGF-BB(peprotech，100-14B)；Mouse PDGF-BB ELISA kit(cusabio，CSB-E08925)；Mouse Osteocalcin ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E06917 m)；Mouse BSAP ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E11914 m)；Mouse PINP ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E12775 m)；Mouse CTX-1 ELISA試劑盒(cusabio，CSB-E12782 m);PBS(南京生興生物)；TRAP(solarbio，G1492)；CD31(abcam，ab24590)；Endomucin(abcam，ab106100)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及處理：12只C57小鼠被隨機(jī)分為兩組，每組各6只。GIOP組通過腹腔注射強(qiáng)的松龍(10 mg/m2)，每天一次，持續(xù)四周。BSA(體表面積)=k*W2/3，k=9.82，w=body weight；對(duì)照組通過腹腔注射等量的PBS。

1.2.2標(biāo)本取材及處理：分別取各組小鼠外周血1 mL。將外周血置于冷凍離心機(jī), 4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測(cè)。測(cè)定骨形成標(biāo)志物骨鈣素(osteocalcin ,OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase ,BSAP)、膠原氨基酸延長(zhǎng)肽I(aminoterminal propeptide of type I procollagen，PINP)及骨吸收標(biāo)志物：血清C端交聯(lián)肽(serum C-telopeptide，CTX)。測(cè)定血小板衍化生長(zhǎng)因子(platelet drive growth factor-BB, PDGF-BB)。解剖分離小鼠股骨，剪開股骨兩端，用500 μL滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗小鼠股骨干，冷凍離心機(jī)4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測(cè)，測(cè)定骨髓上清PDGF-BB水平。取C57小鼠股骨行Micro-CT掃描。將股骨制成80 μm厚的冰凍切片，行CD31hiEmcnhiH型血管免疫熒光染色。分別取各組小鼠外周血1 mL。將外周血置于冷凍離心機(jī), 4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測(cè)。測(cè)定骨形成標(biāo)志物骨鈣素(osteocalcin ,OC)、骨特異性堿性磷酸酶(bone-specific alkaline phosphatase ,BSAP)、膠原氨基酸延長(zhǎng)肽I(aminoterminal propeptide of type I procollagen，PINP)及骨吸收標(biāo)志物：血清C端交聯(lián)肽(serum C-telopeptide，CTX)。測(cè)定血小板衍化生長(zhǎng)因子(platelet drive growth factor-BB, PDGF-BB)。解剖分離小鼠股骨，剪開股骨兩端，用500 μL滅菌生理鹽水反復(fù)沖洗小鼠股骨干，冷凍離心機(jī)4 500 r/min，4 ℃離心10 min，取上清部分做ELISA檢測(cè)，測(cè)定骨髓上清PDGF-BB水平。取C57小鼠股骨行Micro-CT掃描。將股骨制成80 μm厚的冰凍切片，行CD31hiEmcnhiH型血管免疫熒光染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血清中BSAP、CTX-1、OC和PINP的表達(dá)

相對(duì)于對(duì)照組，GIOP組血清中CTX-1(P=0.000 3)表達(dá)上升，BSAP(P=0.000 01)、OC(P=0.001 3)和PINP(P=0.005 9)表達(dá)下降，見圖1。

圖1 血清中BSAP、CTX-1、OC和PINP的表達(dá)Fig.1 The expression of BSAP, CTX-1, OC and PINP in serum

從股骨Micro CT結(jié)果中可以看出，GIOP組相對(duì)于對(duì)照組，骨量減少, Tb.Th即小梁骨厚度有顯著差異(P=0.000 6)，見圖2、表1。

表1 股骨Micro CT結(jié)果Table 1 Results of femur bone micro CT

圖2 股骨Micro CT結(jié)果Fig.2 Results of femur bone Micro CT

從腰椎骨Micro CT結(jié)果(圖3、表2)中可以看出，GIOP組相對(duì)于對(duì)照組，骨量明顯減少。主要在TV(P=0.020 5)、BV(P=0.003 2)、Tb.N(P=0.039 9)和 BMD方面有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.031 2)。

圖3 腰椎Micro CT結(jié)果Fig.3 Results of lumbar bone micro CT

表2 腰椎Micro CT結(jié)果Table 2 Results of lumbar spine micro CT

相對(duì)于對(duì)照組，GIOP組血清和骨髓中的PDGF-BB表達(dá)明顯下降，CD31和Endomucin 表達(dá)均有所下調(diào)，見圖4、圖5。

圖4 血清和骨髓中PDGF-BB的表達(dá)Fig.4 The expression of PDGF-BB in serum and bone marrow

圖5 H血管CD31和Endomucin表達(dá)Fig.5 CD31 and Endomucin expression of H type blood vessels

3 討論

GIOP的發(fā)生具有一定的異質(zhì)性[5]。一般來說，根據(jù)BMD的測(cè)定結(jié)果來看，在使用糖皮質(zhì)激素一年之內(nèi)，患者骨量快速丟失比例為6%～12%。此后，隨著治療的進(jìn)行，每年依次丟失骨量3%[6]。在糖皮質(zhì)激素短期高劑量、長(zhǎng)期中等劑量和一次關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射就可以引起股骨頸或肱骨近端無菌性壞死，發(fā)生率為25%[7]。

由于糖皮質(zhì)激素不可替代的作用，在臨床工作中被廣泛使用。在炎性和免疫性疾病中，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病、腎病綜合征會(huì)在全身性使用[8]。在皮炎、哮喘、結(jié)膜炎等疾病中會(huì)被局部使用。而在急性炎癥反應(yīng)如休克、腦水腫和移植術(shù)后會(huì)使用高劑量的糖皮質(zhì)激素[9]。在2019年對(duì)于新冠病毒的治療中，也有不同程度的使用[10]。長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素，將不可避免的出現(xiàn)骨量減少、骨質(zhì)疏松或骨質(zhì)壞死。

糖皮質(zhì)激素通過多種途徑影響骨代謝，抑制成骨，增加骨吸收，最終導(dǎo)致骨量的丟失。目前已知的具體機(jī)制如下：①糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)骨細(xì)胞程序性死亡，加速成骨細(xì)胞凋亡；②促使骨基質(zhì)細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，從而減少骨細(xì)胞數(shù)量[11]；③通過直接抑制睪丸和卵巢及促性腺激素的釋放，抑制性激素的合成，雄、雌激素的減少進(jìn)一步加重骨量丟失；④通過影響鈣在腸道和腎臟的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)，使尿鈣增加、腸鈣吸收明顯減少，鈣流失增多；⑤刺激甲狀旁腺素的合成、分泌和釋放，誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松的發(fā)生。本課題組前期的研究認(rèn)為骨微環(huán)境尤其是微血管數(shù)目的減少，是GIOP的一個(gè)重要原因，糖皮質(zhì)激素可能影響了與這些細(xì)胞及器官組織有關(guān)的血管聯(lián)系，破壞骨形成的微環(huán)境[12]，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松或骨量減少。

骨組織血管豐富，有廣泛的大血管和毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)交織。破骨細(xì)胞的作用并不是簡(jiǎn)單的理解為促進(jìn)骨吸收的因素。它與成骨細(xì)胞、血管生成偶聯(lián)，起到促進(jìn)新生血管生成的作用。骨穩(wěn)態(tài)的維持和新骨的生成與血管生成密不可分。H型血管是科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的對(duì)CD31 和Endomucin (Emcn)高表達(dá)的骨特異性血管，H型血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌成骨轉(zhuǎn)錄因子Osterix。研究[13-14]證明隨著年齡增長(zhǎng)尤其是在老齡小鼠骨中，隨著骨前體細(xì)胞和骨質(zhì)量的減少，H型血管明顯減少，在這點(diǎn)上，老年性骨質(zhì)疏松癥可能也有相似的發(fā)病機(jī)制。

血小板衍化生長(zhǎng)因子(platelet drive growth factor, PDGF )是一組生長(zhǎng)因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，尤其是在血管生成方面作用顯著。主要由體內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞合成。一般認(rèn)為，PDGF源于間充質(zhì)干細(xì)胞，包括纖維母細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞，儲(chǔ)存在血小板α顆粒中，在血小板被激活后釋放。PDGF分成AA/AB/BB三種具有生理活性的形式，其中BB型式更能促進(jìn)纖維母細(xì)胞的生長(zhǎng)。作為巨噬細(xì)胞的趨化因子[15]，促進(jìn)血管新生和動(dòng)脈生成[16]，體內(nèi)研究證實(shí)，這一過程早于血管的萌芽和神經(jīng)血管的生成[17-20]。

本研究在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型中，證明使用4周糖皮質(zhì)激素會(huì)使PDGF-BB明顯下降，出現(xiàn)骨量降低[18]。謝輝等[19]的研究證實(shí)了在卵巢切除小鼠中骨H型血管減少,而外源性的注射PDGF-BB 或cathepsin K阻滯劑可以增加破骨前體細(xì)胞數(shù)量，PDGF-BB的升高可以提高H型血管的數(shù)量，促進(jìn)卵巢切除小鼠的骨形成。他們的研究提示在骨髓中PDGF-BB約有72.6%始自TRAP+的細(xì)胞分泌(主要為破骨前體細(xì)胞)，12.6%由內(nèi)皮細(xì)胞分泌，14.8%源自其他細(xì)胞。最近的研究[18]也證實(shí)，骨血流量的多少進(jìn)一步控制了骨的功能血管生成和骨的生成。

經(jīng)過Micro-CT測(cè)定，地塞米松使用3周(相當(dāng)于人類的3～4年)使小鼠股骨遠(yuǎn)端小梁骨的厚度及數(shù)量明顯減少[21]。本研究進(jìn)一步證實(shí)長(zhǎng)期高劑量糖皮質(zhì)激素對(duì)成年小鼠破骨前體細(xì)胞PDGF-BB分泌及對(duì)骨成長(zhǎng)特異的H型血管生長(zhǎng)均具有抑制作用，相對(duì)于對(duì)照組，GIOP組血清和骨髓中的PDGF-BB表達(dá)明顯下降；GIOP組血清中CTX-1表達(dá)上升，BASP、OC和PINP表達(dá)下降。

當(dāng)然，本研究也存在一定的不足。在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步通過PDGF-BB局部穿刺注射治療動(dòng)態(tài)觀察骨的代謝產(chǎn)物和H型血管的變化。另外，對(duì)于使用糖皮質(zhì)激素4周的C57小鼠模型，從股骨Micro CT結(jié)果中看到GIOP組相對(duì)于對(duì)照組骨量減少，以小梁骨厚度有顯著差異為主(P=0.000 64)；在腰椎骨的組織量(P=0.020 5)、骨量(P=0.003 2)、骨小梁數(shù)(P=0.039 9)、骨密度方面(P=0.031 2)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但以股骨為代表的皮質(zhì)骨、以腰椎為代表的松質(zhì)骨為什么會(huì)對(duì)糖皮質(zhì)激素的應(yīng)答不一致，目前還未得出結(jié)論，今后應(yīng)在這方面進(jìn)一步展開研究與探討。