PM 2.5對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度和生物力學(xué)性能的影響

倪清麗 黃惠娟 林妹珠 董怡君劉宗玉 蔡芬 張小蕊

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院婦產(chǎn)科, 福建 福州 350025 2.廈門大學(xué)附屬附屬東方醫(yī)院, 福建 福州 350025 3.福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院, 福建 福州 350025

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥 (postmenopausal osteoporosis, PMOP)指女性衰老相關(guān)性低雌激素效應(yīng)導(dǎo)致高效骨重塑向骨吸收方向進(jìn)行致骨脆性增加、骨顯微結(jié)構(gòu)改變的一種全身骨代謝性疾病[1]。該病發(fā)病率逐年增加[2], 容易導(dǎo)致老年女性群體胸腰椎等部位骨折[3],骨折引發(fā)的高致殘率和高致死率給社會(huì)和家庭帶來了巨大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[4]。大氣細(xì)顆粒物PM 2.5 (particulate matter 2.5)是指大氣中空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的固體和液體顆粒物的總稱，由于其粒徑小，比表面積大，幾乎可隨呼吸深達(dá)肺泡并沉積，進(jìn)而進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)多臟器損害。國內(nèi)外流行病學(xué)研究[5-7]指出，PM 2.5與較低的骨密度(bone mineral density,BMD)存在關(guān)聯(lián)。本研究擬探討不同濃度的PM 2.5對(duì)去勢SD大鼠骨密度及骨生物力學(xué)特性的影響，為PM 2.5與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)健康的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取3周齡約50 g的SPF級(jí)雌性健康SD大鼠50只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) [SCXK(滬)2017-0001]。在中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科分籠飼養(yǎng), 自由進(jìn)食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度18 ℃～25 ℃ , 相對(duì)濕度為40 %～70 %。將大鼠適應(yīng)生長一周后隨機(jī)分為5組，每組10只，分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、PM 2.5低、中、高劑量組。

1.1.2主要儀器：Thermo Sciencce GUV-15-H-1 大流量采樣器；三點(diǎn)力學(xué)測量儀器(型號(hào):INSTRON，中國科學(xué)院長春科新公司)；雙能X線骨密度儀(型號(hào):HOLOGICDISCOVERYW,美國) 。

1.2 方法

1.2.1PM 2.5的收集及混懸液配置

1.2.1.1PM 2.5的采集及處理：自2019年7月-2020年8月，選取福建省環(huán)境監(jiān)測站主樓八樓作為采樣點(diǎn)(PM 2.5來源主要為交通排放和生活污染)，采樣高度約為10 m，用 Thermo Sciencce GUV-15-H-1大流量采樣器采樣。PM 2.5采樣頭 G1200-41(美國 Thermo Sciencce公司)，流量為 1.13 m3/min，用石英纖維膜(英國Whatman 公司)采集大氣PM 2.5。為消除可能載帶的有機(jī)物，采樣前需將纖維濾膜至于馬沸爐中450 ℃焙燒5 h。收集本地區(qū)大氣PM 2.5樣本，每連續(xù)采樣24 h更換一次濾膜。將采有PM 2.5的濾膜放入密封袋，于-20 ℃避光保存。

1.2.1.2PM 2.5染毒液制備：將采有PM 2.5的濾膜裁剪成1 cm×1 cm大小，浸入含有超純水的燒杯中，將燒杯放置于超聲振蕩器器的水浴箱中，超聲4 ℃震蕩30 min×6次，8層無菌紗布過濾洗脫P(yáng)M 2.5顆粒后低溫高速離心機(jī)離心30 min(12 000 r/min)，棄上清液后沉淀物質(zhì)真空冷凍干燥12 h。冷凍干燥后水分完全揮發(fā)，瓶底的PM 2.5灰色粉末室溫稱重后加入無菌PBS配制成 2 μg/μL混懸染毒母液，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2PM 2.5暴露濃度的計(jì)算及其依據(jù):低、中、高暴露劑量分別根據(jù)中華人民共和國環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3095-2012)一、二級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 24 小時(shí)平均年濃度限值(35、75 μg/m3)，以及國際環(huán)保組織綠色和平發(fā)布的《2015 年度中國366座城市PM 2.5濃度排名》中PM 2.5年均濃度150 μg/m3進(jìn)行計(jì)算。以 150 μg/m3(0.150 μg/L)為例：健康人通氣量以 6 L/min計(jì)，24 h的PM 2.5吸入量為 0.150 μg/L×6 L/min×60 min/h×24 h/d=1 296 μg/d；大鼠通氣量以73 mL/min(0.073 L/min)計(jì)，則24 h 的PM 2.5吸入量為 15.91 μg/d。參照吸入的PM 2.5 在氣道深部和肺的沉積率為68 %～70 %。以70 %計(jì)算，則實(shí)際每日暴露量為15.91 μg×70 %11.14 μg。同法可推算輕、中劑量分別為 2.6、5.57 μg。將3 d劑量一次滴注，低、中、高劑量組每次染毒為7.8 μg、16.5 μg、33.3 μg，即低、中、高劑量組每次染毒分別為3.9 μL、8.25 μL、16.65 μL(PM 2.5混懸母液濃度為2 μg/μL)。假手術(shù)組、模型對(duì)照組給予生理鹽水20 μL，PM 2.5低、中、高劑量組給予PM 2.5混懸液,實(shí)驗(yàn)時(shí)間持續(xù)九個(gè)月。

1.2.3建立人工絕經(jīng)模型：除假手術(shù)組外，其余組在氣管滴注的5個(gè)月后行去勢術(shù): 全程嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行，去勢前禁食禁水8 h。在大鼠腹腔注射3 %戊巴比妥鈉溶液(1 mL/kg) ，注射約15～20 min即被麻醉。仰臥位固定、備皮、消毒鋪單后背側(cè)雙切口入路逐層切開皮膚→皮下筋膜→肌肉和腹膜→腹腔。用一針線將切口兩側(cè)肌肉連同腹膜固定，充分暴露操作視野，事先準(zhǔn)備好一圈與切口大小相近套線放置于切口處，鑷子輕柔撥開脂肪層找到卵巢(呈粉紅色桑葚樣)，結(jié)扎卵巢與子宮結(jié)合部，切除卵巢。同法切除另一側(cè)卵巢。術(shù)后密切觀察大鼠切口情況，切口邊緣連續(xù)3 d注射青霉素G 20萬單位抗菌消毒。假手術(shù)組僅取卵巢旁1 cm3大小脂肪組織，余下處理同上。

1.2.4檢測指標(biāo)

1.2.4.1BMD 測定：去勢后第2、4個(gè)月進(jìn)行骨密度測定，具體步驟：術(shù)前禁食禁水8 h，用3 %戊巴比妥鈉溶液對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，麻醉后鋪單,讓大鼠呈仰臥位，四肢自然放松狀態(tài)于骨密度儀檢查床上，最大程度伸展大鼠腰椎(L3～5)及右側(cè)股骨，使充分暴露于X線下，運(yùn)用大鼠測量軟件掃描腰椎(L3～5)及右側(cè)股骨，測量骨密度數(shù)值。

1.2.4.2骨生物力學(xué)測定：使用三點(diǎn)力學(xué)生物儀器對(duì)分離的左股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲測試評(píng)估。持續(xù)滴注9個(gè)月處死大鼠后用高壓滅菌后的手術(shù)器械取出左側(cè)股骨，剔除周圍結(jié)締組織后放入生理鹽水當(dāng)中浸泡2 h，浸泡結(jié)束取出后將股骨頭凹面向下，股骨頭頭端朝前的位置放在間距為 20 mm 的兩個(gè)支撐點(diǎn)上，最大加載速度 2 mm /min，啟動(dòng)開關(guān)施加壓力，等待股骨斷裂后根據(jù)力儀器操作屏幕上自帶的軟件記錄載荷-位移曲線并分析數(shù)據(jù)，最后得出彈性模量、極限載荷、彈性載荷等骨生物力學(xué)指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 去勢大鼠一般情況

各組大鼠術(shù)后 3 d 活動(dòng)較少，進(jìn)食飲水量減少，考慮與術(shù)后切口疼痛有關(guān)。各組大鼠于術(shù)后第4天均可正常飲食 , 活動(dòng)恢復(fù)正常。各組大鼠術(shù)后切口均愈合良好 , 無紅腫、皮溫高等表現(xiàn), 無大鼠出現(xiàn)死亡 , 所有實(shí)驗(yàn)大鼠于術(shù)后1周拆除縫線。

2.2 PM 2.5對(duì)去勢大鼠不同時(shí)間各組間腰椎(L3～5)、右側(cè)股骨BMD的影響

據(jù)7個(gè)月時(shí)測得的骨密度結(jié)果顯示 , 5組SD大鼠腰椎及右側(cè)股骨BMD比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。滴注9個(gè)月后，模型對(duì)照組及PM 2.5各劑量組腰椎及右側(cè)股骨 BMD 與本組去勢7個(gè)月時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。滴注9個(gè)月后PM 2.5去勢組腰椎及右側(cè)股骨BMD低于假手術(shù)組及模型對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且PM 2.5各組間呈現(xiàn)一定的劑量關(guān)聯(lián)趨勢，中、高劑量組BMD降低趨勢明顯，同時(shí)模型對(duì)照組腰椎及右側(cè)股骨BMD明顯低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見表1。

表1 大鼠去勢后不同時(shí)間腰椎(L3～5)、右側(cè)股骨BMD 比較Table 1 Comparison of BMD of lumbar vertebrae (L3-5) and right femur at different time after ovariectomy in g/cm2)

2.3 PM2.5對(duì)去勢大鼠各組間左側(cè)股骨生物力學(xué)比較

三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型對(duì)照組、PM 2.5低劑量組股骨的彈性載荷、極限載荷、彈性模量與假手術(shù)組相比均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，PM 2.5劑量組的股骨彈性載荷、極限載荷和彈性模量降低(P<0. 05) ，下降趨勢與BMD一致，高劑量組下降最為顯著。見表2。

表2 PM 2.5對(duì)去勢9個(gè)月后大鼠左側(cè)各組間股骨生物力學(xué)比較

3 討論

PMOP 是臨床上常見的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的一種類型[8],是老年女性群體發(fā)生胸腰椎及腕部骨折的主要原因[2]。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查[5-7]表明環(huán)境中的大氣細(xì)顆粒物(PM 2.5)暴露與骨密度(BMD)降低及 OP 的發(fā)病有關(guān)。因此，明確PM 2.5暴露對(duì)OP的影響，對(duì)引起人們對(duì)環(huán)境問題和絕經(jīng)后女性骨骼健康的重視具有重要意義。

雙側(cè)卵巢切除大鼠模型已被廣泛應(yīng)用于婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的動(dòng)物模型[9-10]，研究[11]發(fā)現(xiàn)大鼠去卵巢后, 在12周內(nèi)即可發(fā)生骨質(zhì)疏松。因此，課題組選擇對(duì)飼養(yǎng)5個(gè)月后的SD大鼠進(jìn)行去勢手術(shù)，之后繼續(xù)對(duì)去卵巢SD大鼠進(jìn)行PM 2.5氣管滴注3～4個(gè)月，以觀察PM 2.5是否會(huì)加重SD大鼠絕經(jīng)后骨量減少。本實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與假手術(shù)組相比，腰椎、股骨的骨密度及骨生物力學(xué)均有顯著下降，證實(shí)OVX骨質(zhì)疏松模型成功。

BMD 降低是骨質(zhì)疏松時(shí)骨變化的重要特征,在目前眾多檢測BMD的方法中，DXA被公認(rèn)為是診斷骨質(zhì)疏松的金標(biāo)準(zhǔn)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)采用DXA對(duì)大鼠腰椎和股骨進(jìn)行了檢測，測量結(jié)果表明，氣道滴注第9個(gè)月末時(shí), 模型對(duì)照組及PM 2.5劑量組大鼠腰椎及右股骨 BMD 與本組7個(gè)月末時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，這與大鼠的骨骼發(fā)育成熟期及皮質(zhì)骨代謝周期一致。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)PM 2.5染毒可明顯降低去卵巢大鼠的骨密度,中、高劑量組的BMD明顯降低，而且骨損傷與PM 2.5劑量之間呈負(fù)相關(guān)，即隨著染毒劑量的增加，單位骨組織的骨礦含量下降，骨強(qiáng)度降低。由此可見，控制大氣污染，可能成為預(yù)防骨質(zhì)疏松癥及其相關(guān)骨折的一項(xiàng)新措施。

生物力學(xué)特性綜合反映了骨結(jié)構(gòu)連續(xù)性、骨量、骨皮質(zhì)厚度以及骨的材料特性，從生物力學(xué)角度來看，骨脆性不僅僅由骨強(qiáng)度來定義，而是由生物力學(xué)中的彈性模量、脆性等眾多指標(biāo)構(gòu)成[14-15]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇彈性載荷、極限載荷、彈性模量具有代表性的三大指標(biāo)來研究PM 2.5對(duì)去勢大鼠骨組織生物力學(xué)性能的影響。結(jié)果表明模型對(duì)照組、PM 2.5低劑量組的彈性載荷、極限載荷、彈性模量均低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。與模型對(duì)照組比較，PM 2.5劑量組降低了股骨的彈性載荷、極限載荷和彈性模量(P<0. 05)，這說明PM 2.5加重了骨生物力學(xué)和結(jié)構(gòu)力學(xué)性能的下降，減少骨組織的承載能力，降低骨骼抵抗外力沖擊的能力，從而加速去卵巢后引起的骨質(zhì)疏松，增加骨折的發(fā)生。

PM 2.5 作為大氣污染中的主要污染物，由于粒徑小，比表面積大，易富集多環(huán)芳烴等特點(diǎn)，可隨著人的呼吸進(jìn)入體內(nèi)導(dǎo)致呼吸和心血管等系統(tǒng)疾病，其在骨代謝中的作用機(jī)制尚不完全清楚。長期暴露于PM 2.5 引起的氧化性損害和炎性反應(yīng)，可能影響骨骼健康[16]。張寶玉等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM 2.5可能是通過調(diào)節(jié)RANKL/OPG 信號(hào)通路的表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多破骨細(xì)胞，影響骨代謝，最終引起骨量減少甚至導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。PM 2.5中的PAHs、重金屬、多氯化聯(lián)苯同源物等成分可誘發(fā)癌變，腫瘤細(xì)胞可以通過刺激破骨細(xì)胞增殖，加速骨丟失，從而引起骨質(zhì)疏松癥[18]。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將通過氧化損傷、OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路、癌變作用等方面研究PM 2.5暴露如何加速PMOP的發(fā)展。

綜上，PM 2.5會(huì)加劇去勢大鼠BMD及生物力學(xué)指標(biāo)的下降，但確切的作用機(jī)制及信號(hào)通路尚無定論，值得進(jìn)一步研究探討。