5種植物內(nèi)生菌的分離及其拮抗月季黑斑病菌的篩選

宋光桃，付美云，張惠穎，吳玉紅，田偉政

（1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院a.園林學(xué)院；b.林下藥用植物應(yīng)用技術(shù)湖南工程研究中心，湖南 衡陽 421005；2.中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

月季花（Rosa chinensisJacq）是衡陽市的市花，也是中國的十大傳統(tǒng)名花之一，被譽為“花中皇后”［1］，在城市園林綠化中，有著不可或缺的價值。月季黑斑病是月季的主要病害和常見病害［2］。發(fā)病嚴重時月季全株僅剩下光禿的枝條，既降低了月季的觀賞和經(jīng)濟價值，還能導(dǎo)致月季過早衰?。?］，甚至植株死亡［4］。目前生產(chǎn)上常用化學(xué)藥劑進行防治［5-10］，由于化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等諸多不足，近年來生物防治已被人們廣泛重視。

植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)具有相對穩(wěn)定的生存空間，不容易受到外界環(huán)境的影響，并能產(chǎn)生多種抗菌生物活性物質(zhì)，已經(jīng)成為一類重要的微生物資源被用于植物病害的防治［11］。國內(nèi)外對內(nèi)生菌在植物病害防治方面的研究已經(jīng)有許多報道［12-15］，但在月季黑斑病防治上未見報道，本試驗嘗試從5種植物中分離內(nèi)生菌，并篩選出對月季黑斑病防治效果較好的菌株，為月季病害無公害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌菌株來源

從衡陽市南湖公園及湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院月季植株上采集具有典型月季黑斑病癥狀的病葉組織，以常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離，在PDA培養(yǎng)基上28℃下暗光培養(yǎng)，獲得的分離物經(jīng)純化后，在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)并于4℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試拮抗菌菌株來源

從衡陽市南湖公園及湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院月季植株上取健康葉片，在湖南環(huán)境生物職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)及附近取銀杏、鉤騰、黑老虎、山蒼子健康葉片。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(NA)、高氏一號培養(yǎng)基等，用于病原菌與拮抗菌的分離、純化和保存、拮抗性測定和培養(yǎng)性狀觀察。

1.2 方法

1.2.1 月季黑斑病菌的分離

采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，在28℃下培養(yǎng)，得到的培養(yǎng)物經(jīng)純化后保存?zhèn)溆?，并制片在顯微鏡下觀察分離物形態(tài)。

1.2.2 月季黑斑病菌的致病性測定

采用傷口接種法把月季黑斑病菌孢子懸浮液接種至健康的月季葉上，實驗重復(fù)3次，并設(shè)對照；待癥狀出現(xiàn)后，切取發(fā)病處組織，再用常規(guī)組織分離法分離病原菌，把所得病原菌純化培養(yǎng)、保存?zhèn)溆?，并制片在顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)。

1.2.3 內(nèi)生菌的分離

（1）組織表面消毒。將采集的新鮮健康月季、銀杏、鉤騰、黑老虎、山蒼子的葉組織取材后，用自來水沖洗干凈，70%的酒精浸泡3～5 s，再用0.1%的升汞浸泡3 min進行表面消毒處理，用無菌水沖洗3～4次，并作印跡對照處理［11］，檢測植物表面消毒是否徹底。

（2）分離純化方法。將消毒后的材料放于經(jīng)滅菌的盛有少量石英沙的研缽中磨碎（加入5 ml生理鹽水），取上清液梯度稀釋到濃度為10-1～10-2，取0.1 ml涂布于相應(yīng)平板上（細菌用NA平板，放線菌用高氏一號培養(yǎng)基平板，真菌用PDA平板），重復(fù)3次，置于25℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)。待涂布平板上長出菌落后挑取菌株，轉(zhuǎn)接于新鮮培養(yǎng)基上，經(jīng)純化后轉(zhuǎn)入斜面試管培養(yǎng)，放線菌和真菌培養(yǎng)3～5 d，細菌培養(yǎng)24 h后，4℃保存、備用。

1.2.4 拮抗菌的初篩

（1）拮抗細菌初篩：在PDA平板中央分別接種直徑6 mm的月季黑斑病菌菌餅，在周圍2.5 cm處接種分離的細菌，每皿接1株細菌，對稱接3點，重復(fù)3次。置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)，同時以不接細菌為對照。當對照長至培養(yǎng)皿邊緣時，測量抑菌圈大小。

（2）拮抗放線菌與真菌初篩：以月季黑斑病菌作為指示菌，采用平板對峙培養(yǎng)法進行篩選。將PDA培養(yǎng)基融化倒成平板冷卻凝固后，在平板中央分別接上月季黑斑病菌菌餅(直徑為6 mm)，周圍35 mm處等距離接4株不同放線菌與真菌菌餅(直徑為6 mm)。以中央只接月季黑斑病菌，周圍不接放線菌與真菌做對照，25℃培養(yǎng)6 d。每處理重復(fù)3次。觀察放線菌與真菌各菌株的抑菌效果，選出對月季黑斑病菌有抑菌圈的放線菌與真菌菌株作為復(fù)篩菌株。

1.2.5 拮抗菌的復(fù)篩

（1）拮抗細菌復(fù)篩：把上述抑菌圈半徑在5 mm以上的細菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在30℃、140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d。在PDA平板中央用直徑6 mm的打孔器打一孔，取出培養(yǎng)基，在孔內(nèi)注入20μl上述的拮抗細菌發(fā)酵液，在周圍距孔3.0 cm處接種供試病原菌菌餅。25℃恒溫箱中培養(yǎng)，同時以不接拮抗細菌單獨只接供試病原菌為對照。當生長快的病原菌對照長至培養(yǎng)皿邊緣時，測量抑菌圈大小。

（2）拮抗放線菌復(fù)篩：采用平板對峙培養(yǎng)法，在平板中央接種上述初篩的拮抗放線菌菌餅(直徑為6 mm)，在周圍35 mm處等距離接種供試病原物菌餅(直徑為6 mm)。以中央只接病原菌，不接放線菌做對照，25℃培養(yǎng)6 d。每處理重復(fù)3次。觀察放線菌各菌株的抑菌效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 月季黑斑病病原菌的分離與初步鑒定

用常規(guī)組織分離法從月季黑斑上分離得到3種真菌。

（1）月季炭疽菌（Colletotrichumsp.）：此菌是優(yōu)勢菌，分離時出現(xiàn)最多，在PDA培養(yǎng)基平板上菌落棉絮狀，邊緣完整，初期灰白色，隨后菌落中央變?yōu)樯罨疑?，并有粉紅色分生孢子堆出現(xiàn)，分生孢子無色，單胞，長橢圓形（見圖1，其中左邊圖A示分生孢子，右邊圖B示菌落）。將其分離物接種于健康月季葉上，一段時間后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，其特點與初始感染月季黑斑病的病葉癥狀相似（見圖2），對照沒有出現(xiàn)癥狀。將接種發(fā)病的病葉再一次分離，所得病菌的形態(tài)與第一次分離得到的分離物形態(tài)一致。后期拮抗試驗以此菌為試驗對象。

圖1 月季炭疽菌分生孢子形態(tài)(A)與菌落特征(B)Fig.1 Conidial morphology(A)and colony characteristics(B)of Colletotrichum sp.

圖2 月季炭疽菌致病性測定Fig.2 Pathogenicity of Colletotrichum sp.

（2）月季鏈格孢菌（Alternariasp.）：此菌在分離時也常出現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基平板上菌落棉絮狀，深灰色，邊緣完整，分生孢子淡褐色或深褐色，有縱橫隔膜，圓筒形、卵圓形、橢圓形或倒棍棒形（見圖3）。將其分離物接種于健康月季葉上，一段時間后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，其特點與初始感染月季黑斑病的病葉癥狀相似，對照沒有出現(xiàn)癥狀。將接種發(fā)病的病葉再一次分離，所得病菌的形態(tài)與第一次分離得到的分離物形態(tài)一致。

圖3 鏈格孢菌分生孢子Fig.3 Conidia of Alternaria sp.

（3）月季盤二孢菌（Marssoninasp.）：此菌在分離時不易出現(xiàn)，在PDA培養(yǎng)基平板上菌落灰白狀，深灰色，邊緣完整，分生孢子卵圓形或橢圓形，無色，雙細胞（見圖4）。將其分離物接種于健康月季葉上，一段時間后出現(xiàn)發(fā)病癥狀，其特點與初始感染月季黑斑病的病葉癥狀相似，對照沒有出現(xiàn)癥狀。將接種發(fā)病的病葉再一次分離，所得病菌的形態(tài)與第一次分離得到的分離物形態(tài)一致。

圖4 盤二孢菌分生孢子Fig.4 Conidia of Marssonina sp.

2.2 拮抗菌菌株的分離、純化

采用涂布分離法，從健康月季、銀杏、鉤藤、黑老虎、山蒼子的葉組織共得內(nèi)生分離物69株，其中細菌分離物37株、放線菌3株、真菌29株（見表1）。從表1可知，69株內(nèi)生菌中，月季分離物13株，銀杏分離物14株，鉤藤分離物12株、黑老虎分離物13株、山蒼子分離物17株；只有銀杏分離物中有放線菌。

表1 內(nèi)生菌菌株分離結(jié)果Table 1 The results of endophytic strains isolation

2.3 拮抗菌的初篩結(jié)果

以優(yōu)勢菌月季炭疽病菌為目標菌，用對峙生長法測試了分離獲得的內(nèi)生菌對月季炭疽病菌的拮抗作用。結(jié)果顯示，內(nèi)生菌中有20株（細菌14株、放線菌2株、真菌4株）對月季炭疽病菌有拮抗作用，拮抗圈大于5 mm的有8株，其中細菌7株，放線菌1株（見表2）。真菌抑菌效果不明顯。

表2 拮抗內(nèi)生菌的初篩結(jié)果Table 2 The results of preliminary screening of antagonistic endophytes

續(xù)表

2.4 拮抗菌的復(fù)篩結(jié)果

以月季炭疽病菌為目標菌，用對峙生長法測試了初篩的7株拮抗菌的發(fā)酵液和1株拮抗放線菌對月季炭疽病菌的抑菌效果（見表3）。

表3 拮抗內(nèi)生菌的復(fù)篩結(jié)果Table 3 The results of re-screening of antagonistic endophytes

由表2、表3可知，本次篩選沒有得到抑菌效果較明顯的真菌菌株，篩選出了對月季炭疽病菌抑菌效果最明顯的細菌菌株是YJX2，它是從月季上分離的，放線菌菌株YXF1抑菌效果優(yōu)于菌株YJX2，抑菌效果最好，但YXF1是從銀杏上分離的，因此可將菌株YJX2與YXF1作為生物防治備選菌株進一步研究用于防治月季黑斑病。

3 結(jié)論與討論

本試驗用常規(guī)分離法分離了月季黑斑病菌，得到了3個不同菌株，其中炭疽菌為優(yōu)勢菌，并對3個病菌進行了形態(tài)觀察與致病性測定，都能出現(xiàn)黑斑癥狀；從新鮮健康月季、銀杏、鉤騰、黑老虎、山蒼子的葉組織內(nèi)共分離得到內(nèi)生菌中有20株（細菌14株、放線菌2株、真菌4株）對月季炭疽病菌有拮抗作用，拮抗圈大于5 mm的有8株，其中細菌7株，放線菌1株。復(fù)篩后細菌菌株YJX2，放線菌菌株YXF1抑菌效果較好，可作為月季黑斑病生物防治的備選菌株。

已有研究表明［16-19］，植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)與宿主植物形成了密切的互惠共生關(guān)系，具有多種抑菌功能，有些防病效果較明顯，有一定的開發(fā)利用前景。本試驗除月季外，還從4種藥用植物（銀杏、鉤騰、黑老虎、山蒼子）體內(nèi)分離了內(nèi)生菌，它們也有一部分內(nèi)生菌能抗月季黑斑病菌，其中從銀杏體內(nèi)得到的放線菌菌株YXF1抑菌效果最好，它能否在月季上定植，還有待進一步研究。李玲玲等［20］從銀杏莖葉中分離出多株真菌、細菌與放線菌，有多株菌株抑菌效果顯著。本次分離的菌株YJX2與菌株YXF1的抑菌范圍將進行下一步研究。另外，它們是否相互抑制也需后續(xù)研究。