金銀花變色與5-羥甲基糠醛等有效成分含量的相關(guān)性研究

羅弈皓，劉楠，袁楓林，陳蓓蓓，吳沁璇

（長沙醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410219）

金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.）的干燥花蕾或帶初開的花，是臨床常用的具有抗菌、抗病毒、護(hù)肝、抗氧化等作用的大宗中藥材之一［1］。在新型冠狀病毒COVID-19治療中，金銀花臨床使用量非常之大［2］。中藥材的色澤是近代以來一直用于鑒定中藥材質(zhì)量品質(zhì)的重要指標(biāo)，但是長期以來缺乏數(shù)據(jù)化的指標(biāo)［3］?；谶@個問題，近年來，在中藥研究鑒定中提出了一種基于色度學(xué)原理的分析方法，以L*、a*、b*三種參數(shù)分別表示明度、紅綠、黃藍(lán)方向，可用于藥材顏色的快捷檢測［4］。這種方法已在藥材顏色與質(zhì)量評價中占據(jù)重要地位［5-7］。因此本研究收集了色澤不同的金銀花，對金銀花顏色值進(jìn)行測量，同時通過HPLC法測定金銀花中綠原酸和5-羥甲基糠醛含量，并分析金銀花色度值與顏色相關(guān)的有效成分含量的相關(guān)性，以期為金銀花的質(zhì)量評價提供新依據(jù)和新方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

SPD-M20A型HPLC高效液相色譜儀（日本島津）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；FB224型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；UV-7500型紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；LS171色差儀（深圳林上科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20782，純度≥98%）；

5-羥甲基糠醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：H2020335，純度≥99%）；

水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆患状迹ㄉV純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；磷酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；收集產(chǎn)自山東不同年限的金銀花樣品（江西百仁中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：山東。批號：200601）（湖南新匯制藥股份有限公司，產(chǎn)地：山東。批號：151001），由長沙醫(yī)學(xué)院吳沁璇講師鑒定，均為藥典所規(guī)定的忍冬科植物忍冬Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 金銀花的顏色測定

（1）測定條件。光源D65，視場10°，測量口徑8 mm，測量時間約1 s，色差公式采用△E*ab，數(shù)據(jù)用L*、a*、b*進(jìn)行表示。

（2）測定方法。將9批不同年限金銀花樣品進(jìn)行顏色的分類，平鋪于色差儀測試口，平均測量10次，取其平均值。

1.3.2 金銀花活性成分含量測定

（1）色譜條件。WondaSil-C18(4.6 mm×250 mm，5μm)；流動相：以乙腈(A)-0.4%磷酸水(B)（10:90）；流速：1 mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：284 nm；進(jìn)樣量：10μL。

（2）對照品溶液制備。精密稱取綠原酸對照品10 mg于25 ml容量瓶，加入50%甲醇溶解定容，得400μg/ml綠原酸對照品溶液；精密稱取5-羥甲基糠醛對照品3.73 mg于10 ml容量瓶，加入50%甲醇溶解定容，得373μg/ml5-羥甲基糠醛對照品溶液。

（3）供試品溶液制備。粉碎金銀花后過4號篩，稱取金銀花的粉末1.0 g于具塞錐形瓶，精密加入50%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用50%的甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻過濾，微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（4）線性關(guān)系的考察。精密量取綠原酸對照品溶液3 ml、2.5 ml、2 ml、1.5 ml、1 ml、0.5 ml，精密量取5-羥甲基糠醛對照品溶液1.5 ml、1 ml、0.5 ml、0.25 ml、0.1 ml、0.05 ml，各置于10 ml棕色容量瓶制備成混合對照品溶液，按照色譜條件檢測，以混合對照品溶液濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)（X），將峰面積做（Y）進(jìn)行線性回歸。得出綠原酸回歸方程為Y=18.03X+15.221，R2=0.981 5；5-羥甲基糠醛Y=80.65X-65.015，R2=0.9962。表明綠原酸在20～120μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，5-羥甲基糠醛在1.865～55.95μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed reference substance(A)and test substance(B)

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花的顏色

金銀花顏色測量值見表1所示。結(jié)果顯示，L*值從棕褐色開始逐漸升高，a*值總體上從棕褐色開始逐漸降低，b*值無明顯變化趨勢，儲存年限越長，金銀花顏色越趨于棕褐色。

表1 不同年限金銀花顏色測量值Table 1 Color measurement values of Lonicera japonica Thunb of different years

2.2 金銀花5-羥甲基糠醛與綠原酸含量

將制備好的供試品溶液，按照色譜條件下進(jìn)樣測定，記錄峰面積，采用外標(biāo)法計算金銀花樣品中活性成分的含量，結(jié)果見表2。結(jié)果大致顯示顏色偏棕黃的金銀花綠原酸含量低，5-羥甲基糠醛含量高。

表2 含量測定結(jié)果Table 2 Content determination results

2.3 相關(guān)性分析

2.3.1 金銀花成分含量與顏色值相關(guān)性分析

將金銀花中5-羥甲基糠醛、綠原酸的含量分別與顏色值L*、a*、b*用SPSS20.0軟件做相關(guān)性分析，結(jié)果見表3。

表3 金銀花有效成分與色度值相關(guān)系數(shù)（n=9）Table 3 Correlation coefficient between active components and chromaticity value of Lonicera japonica Thunb(n=9)

由表3所示，金銀花中5-羥甲基糠醛與綠原酸均與明度L*存在相關(guān)性，具有顯著影響。5-羥甲基糠醛與L*的雙尾檢驗的概率為0.016（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為-0.769，說明5-羥甲基糠醛與L*呈負(fù)相關(guān)；綠原酸與L*的雙尾檢驗的概率為0.018（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)為0.757，說明綠原酸與L*呈正相關(guān)；而這兩成分與a*、b*值均無相關(guān)性（P>0.05）。

2.3.2 金銀花顏色值與有效成分回歸分析

將金銀花中5-羥甲基糠醛、綠原酸的含量為自變量與顏色值L*、a*、b*分別為因變量用SPSS 20.0軟件做回歸分析。

由表4可知，L*與5-羥甲基糠醛、綠原酸的R2為0.638，說明明度L*有63.8%的程度與這2個有效成分的含量存在影響。由表5方差分析可知，P=0.047<0.05，所以2個有效成分構(gòu)成的回歸式統(tǒng)計上是顯著的。根據(jù)表6得知，該回歸方程為：

表4 L*與5-羥甲基糠醛、綠原酸模型匯總Table 4 L*and The summarization of 5-HMF and chlorogenic acid models

表5 L*與5-羥甲基糠醛、綠原酸方差分析Table 5 L*and variance analysis of 5-HMF and chlorogenic acid

表6 L*與5-羥甲基糠醛、綠原酸回歸系數(shù)Table 6 L*and regression coefficient of 5-HMF and chlorogenic acid

具有統(tǒng)計學(xué)意義。由于以a*、b*為因變量時進(jìn)行回歸分析發(fā)現(xiàn)不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義，故省略。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本實驗通過測定9批年限不同的金銀花中的綠原酸、5-羥甲基糠醛的含量及顏色L*、a*、b*值，將活性成分的含量與顏色值做相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)金銀花中綠原酸的含量與L*呈正相關(guān)，5-羥甲基糠醛的含量與L*呈負(fù)相關(guān)，說明在金銀花樣品中，L*值越大則綠原酸含量越高，5-羥甲基糠醛含量越低。同時發(fā)現(xiàn)色澤偏棕顏色較深的金銀花中5-羥甲基糠醛的含量越大，說明5-羥甲基糠醛對顏色也存在一定影響。

本實驗將金銀花中5-羥甲基糠醛、綠原酸的含量分別為因變量、以顏色值L*、a*、b*自變量，做回歸分析，結(jié)果都不顯著，故省略；以2個有效成分與L*為因變量做出的回歸分析，得出了具有統(tǒng)計學(xué)意義的回歸方程，該方程可以通過一個色度值推測金銀花中有效成分的含量，為以后的金銀花質(zhì)量控制提供了一種新方案，為金銀花的質(zhì)量評價提供了參考依據(jù)。

3.2 討論

實驗發(fā)現(xiàn)，除了HPLC測定出的綠原酸、5-羥甲基糠醛含量與色度存在變化關(guān)系外，同時發(fā)現(xiàn)不同色度的金銀花中也有其他物質(zhì)的峰面積存在一定變化，可能對色度也存在一定影響，在后續(xù)的實驗中，應(yīng)該予以關(guān)注。

市場存在金銀花和山銀花相互摻假的現(xiàn)象，導(dǎo)致市場混亂。這兩種藥材都是忍冬科植物，在形態(tài)成分、藥理作用等等具有極其相似的作用。因此，可以考慮對山銀花進(jìn)行高效液相色譜法的5-羥甲基糠醛及其他活性成分含量測定，并分析其與色度值的相關(guān)性，評判該方法對鑒別金銀花和山銀花是否存在價值。

5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）是由葡萄糖等單糖化合物在高溫或弱酸性等條件下脫水生成的具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的醛類化合物，是麥拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物之一［8］，具有一定的神經(jīng)毒性、致癌性［9］。最近發(fā)現(xiàn)5-羥甲基糠醛與中藥材的色澤程度存在一定的相關(guān)性，色澤程度越深的藥材，5-羥甲基糠醛的含量大多偏高［10-11］。中藥中5-羥甲基糠醛藥理、毒理作用的研究較多，但其與金銀花顏色相關(guān)性的研究較少，還未將其納入藥材的控制指標(biāo)。從本實驗數(shù)據(jù)來看，可初步認(rèn)定5-羥甲基糠醛對色度有影響，但是要建立一套控制中藥材質(zhì)量的方法，實現(xiàn)中藥材藥效成分含量的快速檢測，還需通過進(jìn)一步的實驗驗證。