基于ITS rDNA分析辣椒幼苗根際真菌群落結(jié)構(gòu)差異

王燦，羅貞媛，孟凡來，許俊強，何鴻源，張應(yīng)華，葉歡，王艷芳

（1.云南省文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000；2.云南省飼草飼料工作站，云南 昆明 650224；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)滇臺特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化工程研究中心，云南 昆明 650201；4.云南省文山市特殊教育學(xué)校，云南 文山 663000；5.河南省南陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，河南 南陽 473000）

辣椒作為西南邊陲特色經(jīng)濟作物之一，是邊疆地區(qū)廣大農(nóng)民增收的經(jīng)濟作物。文山州地處云南邊界，位于云南省東南部低緯度高原地區(qū)，大部分地區(qū)屬西風(fēng)帶中亞熱帶季風(fēng)氣候，全境山巒起伏，河谷溝壑縱橫，海拔618—2 991.2 m，高低海拔氣候差異顯著［1］，其獨特的地理氣候造就了豐富多樣的辣椒種質(zhì)資源。辣椒育苗主要采用育苗盤方式進(jìn)行育苗，其中育苗基質(zhì)是影響辣椒幼苗質(zhì)量的主要因素之一，基質(zhì)不僅為幼苗生長提供水分與養(yǎng)分，同時也起到了對外界環(huán)境不利因素刺激的緩沖作用。有研究表明土壤微生物群落在影響植物生產(chǎn)力及病蟲害防控中作用顯著［2］。一方面根際有害微生物通過分泌物抑制植物生長，而拮抗微生物通過與有害微生物競爭營養(yǎng)物質(zhì)、侵染位點、合成抗生素類物質(zhì)抑制根際病原菌的繁殖，增強植物免疫力，促進(jìn)生長［3-4］；另一方面，植株通過根系分泌物來促進(jìn)拮抗微生物的生長繁殖以抵御生物與非生物脅迫［5］。Lakshmanan等［6］研究發(fā)現(xiàn)，番茄葉片受到病原菌侵染后，植株通過調(diào)節(jié)根系分泌物組分與含量，增加根系蘋果酸的釋放量從而促進(jìn)根際拮抗菌的生長，這些拮抗菌可提高植物的系統(tǒng)抗性以防御病原菌的浸染。Sadia等［7］在關(guān)于叢枝根菌AMF介導(dǎo)高粱植株缺鐵緩解機制研究中表明AMF對高粱缺鐵誘導(dǎo)的植物生物量、光合作用效率和細(xì)胞損傷有顯著改善，AMF通過提高硫衍生代謝物和抗氧化酶來幫助缺鐵的高粱植物來應(yīng)對氧化損傷。

大量研究表明不同作物品種之間根際微生物群落多樣性有顯著的差異，崔艷妮［8］研究表明，粳稻和秈稻根際細(xì)菌多樣性和總數(shù)有顯著差異。顏朗［9］等對不同基因型馬鈴薯根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)馬鈴薯根際細(xì)菌群落多樣性受馬鈴薯基因型因素的影響，高山地方種相較于自育種和主栽種其根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出顯著的差異。

本研究采用ITS rDNA對兩個栽培種辣椒（Capsicum annuumL.和Capsicum frutescensL.）幼苗植株根際土壤真菌群落組成進(jìn)行擴增子測序。旨在探明不同栽培種辣椒對根際真菌定植的影響機理，為辣椒生長地下部分與微生物的互作關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種

一年 生辣椒（Capsicum annuumL.）：M86、W61、WJ1和灌木辣椒（Capsicum frutescensL.）：M218、M219、M240由文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 供試材料

育苗基質(zhì)為商品育苗基質(zhì)（‘湘正農(nóng)科’牌商品育苗基質(zhì)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湘暉農(nóng)業(yè)技術(shù)研究所研制，主要成分：草炭土。）種植土壤化學(xué)性質(zhì)見表1。

表1 種植土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Chemical properties of planting soil

1.2 方法

1.2.1 盆栽試驗及樣品采集

試驗地點為文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，時間為2020年7月—2021年2月。將發(fā)芽整齊一致的不同辣椒種子播種于苗盤（21孔）中進(jìn)行盆栽試驗。試驗共8個處理 分 別 是：M86、W61、WJ1、M218、M219、M240、CK1、CK2。其中CK1和CK2為空白對照（CK1是種植辣椒前原始土壤基質(zhì)，CK2是未種植辣椒但依然和前面處理進(jìn)行澆水等日常管理）。每個處理3盤為一次生物學(xué)重復(fù)，并進(jìn)行常規(guī)管理育苗。育苗結(jié)束后采用5點取樣法選取植株，將5～7片真葉時期的植株整株拔出抖落附著土壤基質(zhì)后，用單獨無菌刷刷取粘附在根表面的土壤基質(zhì)并將各樣品混合后放入50 mL無菌離心管中，迅速置于干冰中保存運輸，后放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 測定項目

根際真菌DNA提取采用Magen核酸提取試劑盒（MagPure Soil DNA KF Kit），使用Equalbit dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度。以20～30 ng DNA為模板，采用GENEWIZ公司設(shè)計的PCR擴增真菌ITS rDNA上的ITS2可變區(qū)，引物如下：

F：5’-GTGAATCATCGARTC-3’

R：5’-TCCTCCGCTTATTGAT-3’

真菌PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性7 min，94℃變性60 s，57℃退火60 s，72℃延伸60 s，共32個循環(huán)，72℃延伸15 min，4℃保存。反應(yīng)體系：50μl體系，5μL 10×PCR Buffer、8μL DNA模板、1μL dNTP、引物各2μL、2μLTaq DNA聚合酶、去離子水30μl。通過PCR向ITS rDNA的PCR產(chǎn)物末端加上帶有Index的接頭，按Illumina MiSeq儀器使用說明書進(jìn)行雙端測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

原始數(shù)據(jù)整理采用WPS軟件，數(shù)據(jù)差異顯著性分析使用DPS7.05（Duncan新復(fù)極差法，P<0.05）。測序數(shù)據(jù)質(zhì)量優(yōu)化使用Cutadapt（v1.9.1）、Vsearch（1.9.6）、Qiime（1.9.1）。測序數(shù)據(jù)優(yōu)化后質(zhì)量如下（表2）：

表2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量Table 2 Sequencing data quality

2 結(jié)果

2.1 不同樣本根際真菌群落組成

試驗共采集8個樣本處理，其中6個處理為一年生辣椒（Capsicum annuumL.）M86、W61、WJ1和灌木辣椒（Capsicum frutescensL.）M218、M219、M240（圖1a）。對這些樣本測試后得出：在真菌門水平下共有7個物種種類，已知分類中子囊菌門Ascomycota和擔(dān)子菌門Basidiomycota比例最高。在子囊菌門中一年生辣椒處理共占比47.95%，而灌木辣椒占比28.27%，低于一年生辣椒處理。其中M86占比最高為17.7%，最低的是M240僅7.47%；在擔(dān)子菌門中一年生辣椒處理共占比12.29%，灌木辣椒占比23.1%，高于一年生辣椒處理，最高的是CK1處理達(dá)63.37%，最低的是M86僅0.07%（圖1b）。進(jìn)一步在屬水平下（Top10）對各樣本根際真菌種類豐度統(tǒng)計顯示（圖1c），除未分類外，排名第一的是Conlarium，第二的是節(jié)蟲孢屬Arthrobotrys，第三的是Sagenomella。其中Conlarium屬在M240中占比最高，為M240的優(yōu)勢屬。節(jié)蟲孢屬Arthrobotrys則在CK2中占比最高，其次是M218。柄孢殼菌屬Podospora和Sagenomella屬為M218的優(yōu)勢菌屬，占比高于其他處理。此外相較于其他處理，在CK1處理中錐蓋傘屬(Conocybe)占比較高，為CK1的優(yōu)勢菌屬。

圖1 不同辣椒栽培種根際真菌群落組成Fig.1 Rhizosphere fungal community composition of different pepper cultivars

2.2 不同樣本根際真菌群落多樣性

α多樣性反映微生物群落中物種的數(shù)目變動情況，Ace和Chao1是反映菌群豐富度的指標(biāo)，數(shù)值越小表明豐富度越低。表3中一年生辣椒M86、W61、WJ1與灌木辣椒M218、M219、M240相比其Ace和Chao1指數(shù)均較低，說明處理一年生辣椒的豐度低于灌木辣椒，此外與CK處理相比灌木辣椒Ace和Chao1均高于CK1和CK2。這表明灌木辣椒提高了根際真菌群落的物種豐度。Shannon、Simpson是反映菌群多樣性的指標(biāo)，其數(shù)值越小表明群落多樣性越低。表中灌木狀辣椒其Shannon和Simpson指數(shù)均高于一年生辣椒和CK1、CK2，這說明灌木狀辣椒提高了其根際真菌的多樣性。

表3 不同栽培種辣椒根際真菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity index of rhizosphere fungi of different cultivated peppers

進(jìn)一步通過主成分分析樣本間真菌群落的結(jié)構(gòu)差異，圖中樣本點距離的遠(yuǎn)近代表了樣本中微生物群落的相似性，距離越近，相似度越高，聚集在一起的樣本由相似的微生物群落構(gòu)成。如圖2顯示，第一主坐標(biāo)揭示了樣本間56.9%的差異并將各樣本區(qū)分開，第二主坐標(biāo)揭示了樣本26.5%的差異。一年生辣椒中M86和WJ1樣本點最近，而W61則與灌木辣椒M219、M240最近，灌木狀辣椒M218則遠(yuǎn)離其他辣椒樣本與CK2相近，CK1與各樣本均較遠(yuǎn)。表明一年生辣椒、灌木辣椒、CK1之間真菌群落具有較顯著差異。

圖2 不同栽培種辣椒根際真菌主成份分析Fig.2 Principal component analysis of rhizosphere fungi in different cultivars of peppers

3 討論

基質(zhì)土壤不僅為幼苗生長提供水分與養(yǎng)分，同時也為微生物生長與繁殖提供了適宜的環(huán)境，微生物參與土壤腐殖質(zhì)的形成及碳、氮等營養(yǎng)元素的循環(huán)，是根際微生態(tài)環(huán)境的重要組成部分［10］。研究表明每一種植物都有特定的根際微生物組成［11］，即使在同一物種中不同基因型間根際微生物組成也存在著差異［12］。Bouffaud［13］等研究發(fā)現(xiàn)玉米不同品種基因型對玉米根際細(xì)菌群落組成有顯著影響，主要表現(xiàn)于某些β變形菌屬和特定的伯克氏菌屬上的改變。采用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析在4個大豆品種不同基因型的根際微生物后發(fā)現(xiàn)其中兩個品種對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響差異明顯［14］。水稻中，有研究報道不同的水稻基因型間對根系微生物群落差異有顯著的影響，這種變異主要是在水稻內(nèi)生菌群落（P=0.001），而根際群落的影響不顯著（P=0.191）［9］。試驗對云南文山地區(qū)兩種常見的辣椒栽培種幼苗根際真菌群落進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)一年生辣椒中子囊菌門為優(yōu)勢群落，而在灌木狀辣椒中則是擔(dān)子菌門為優(yōu)勢菌群，這與前人研究結(jié)果一致，不同基因型辣椒對根際真菌群落具有明顯的影響。此外在α多樣性分析中，與一年生辣椒對照相比，灌木辣椒明顯提高了其根際真菌群落的豐度和多樣性。分析認(rèn)為這可能與植物根系分泌物有關(guān)；植物根系分泌物是植物-微生物相互作用的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，根系分泌物的成分除了質(zhì)子H+、其它無機離子、無機酸、氧氣和水外，主要由碳基化合物組成，如氨基酸、有機酸、糖、酚類和其它次生代謝物等［15］。植物根系通過分泌物直接（吸引、排斥某些微生物）或間接（改變根際土壤理化性質(zhì)）參與根際微生物群落的“招募”［16］。Rudrappa等［17］研究表明，擬南芥根系通過分泌三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物蘋果酸來選擇性地招募有益的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。Edwards等［18］研究指出，在控制條件下水稻根際和根內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤類型和宿主植物基因型的共同調(diào)控。

相反微生物群落也在植物生長發(fā)育、耐逆境方面發(fā)揮著重要的作用［19］。如在植物促生菌PGPRs（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria）的研究中，將PGPR定殖于根際可直接（活化各種中微量營養(yǎng)元素如固氮、溶磷、解鉀；調(diào)控植物激素；產(chǎn)生揮發(fā)性促生物質(zhì)等）或間接（與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，分泌抑制土傳病害；誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性；誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對非生物脅迫的系統(tǒng)耐性等）促進(jìn)植物生長、抑制植物病害、提高植物生長潛力和誘導(dǎo)植物抗逆性［20-27］。如黃桿菌屬Flavobacterium、假單胞菌屬Pseudomonas具有溶磷能力［28］，研究表明在缺氮條件下豆科植物根系會分泌黃酮類物質(zhì)吸引根瘤菌，并激活根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，最終引起根瘤菌侵染植物根系形成共生關(guān)系［16,29］。He等［30］向多年生黑麥草接種旱生鹽土植物梭梭中的PGPR菌株假單胞菌M30-35，發(fā)現(xiàn)其提高了多年生黑麥草的耐鹽性。另外Jennifer等［31］通過向鹽逆境下的紫花苜蓿接種芽孢桿菌（Bacillus）MK873882和鹽單胞菌屬（Halomonas）MK873884，發(fā)現(xiàn)其顯著促進(jìn)紫花苜蓿的生長。不同類群真菌中子囊菌門和擔(dān)子菌門對凋落物植被分解過程扮演不同角色，其中子囊菌主要分解植物殘渣和降解有機物質(zhì)，有機質(zhì)豐富的環(huán)境更適宜生存；而擔(dān)子菌則偏向于分解木質(zhì)化程度較高的植物殘體［32-33］。試驗發(fā)現(xiàn)一年生辣椒中子囊菌門為優(yōu)勢群落，而灌木狀辣椒中則是擔(dān)子菌門為優(yōu)勢菌群，這表明不同辣椒可根據(jù)生長環(huán)境選擇性“招募”不同的有益真菌群類來分解環(huán)境中不同有機體為自身提供養(yǎng)分以促進(jìn)生長，因此向一年生辣椒和灌木辣椒生長環(huán)境中施入相對應(yīng)的優(yōu)勢真菌群類可能成為促進(jìn)生長質(zhì)量、提高產(chǎn)量品質(zhì)的有效手段。此外灌木辣椒木質(zhì)化程度較高，喜熱、味極辣、抗疫病及黃萎病，在長期自然選擇的壓力下，逐步演化出了耐高溫潮濕、抗病、耐瘠薄、耐弱光及具有獨特芳香味的特性［34］；這是否與其所特有的微生物群落有關(guān)聯(lián)，在其抗病、抗旱中是否有這些特有微生物參與，在生產(chǎn)中應(yīng)用有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

綜上，試驗結(jié)果表明了一年生辣椒和灌木辣椒其根際真菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異，其次在α多樣性分析中，灌木辣椒根際真菌群落豐富度和多樣性顯著高于一年生辣椒。這對于下一步研究一年生辣椒及灌木辣椒特有的根際益生菌群功能挖掘、調(diào)控機制及應(yīng)用提供了參考。同時也為開發(fā)針對地方種的專用生物菌肥和生物農(nóng)藥具有指導(dǎo)意義，為云南文山地方種辣椒種植土壤環(huán)境改良實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源廣譜性種植奠定基礎(chǔ)。