基于SSR分子標(biāo)記的紫薇遺傳多樣性分析

冷嘉文，喬中全，唐麗*，王曉明，陳前欣，邵雯雯

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)研究院，湖南 長沙 410004；3.長沙市木本花卉工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004）

紫薇（拉丁名：Lagerstroemia indicaL.）［1］又名百日紅，癢癢樹。紫薇是千屈菜科紫薇屬的落葉喬木或灌木，樹皮光滑，嫩枝具四棱，淡褐色；葉對生，花紅色、紫色等；原產(chǎn)于亞洲南部及東部溫帶，中國各地均有種植，是夏季著名觀賞植物。紫薇的枝條具有柔軟、易愈合、萌芽力強(qiáng)的特點(diǎn)，因此紫薇也是一種優(yōu)秀的觀花喬木，在園林綠化中，被廣泛用于公園、庭院、道路、街區(qū)城市等綠化，也是做盆景的好材料［2-5］。由于紫薇的品種多樣，來源復(fù)雜，導(dǎo)致紫薇在品種分類鑒定中產(chǎn)生困難。遺傳多樣性是種質(zhì)資源研究和評價的主要內(nèi)容之一，也是種質(zhì)資源保護(hù)、開發(fā)和利用工作的基礎(chǔ)和前提；種質(zhì)資源的遺傳多樣性為改良品種、選育新品種及開展遺傳生物學(xué)研究提供了豐富的遺傳變異和基因資源。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子標(biāo)記開展紫薇遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究已成為紫薇研究中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。王獻(xiàn)等［6］在2004年建立并優(yōu)化了20個紫薇和南紫薇的AFLP銀染色反應(yīng)系統(tǒng)，構(gòu)建了紫薇品種和其他幾種的AFLP的指紋圖譜；此外，該技術(shù)用于分析30種紫薇品種和2個近緣種的親緣關(guān)系，為紫薇的良種選育、基因連鎖圖譜的構(gòu)建以及遺傳關(guān)系等一系列研究奠定了理論基礎(chǔ)。顧翠花［7］在王獻(xiàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化并建立了適合紫薇的AFLP實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系，篩選出了適合紫薇種質(zhì)資源評價分析的引物，研究紫薇中13個群體的親緣關(guān)系。Pounders等［8］以紫薇的栽培品種“Tonto”和‘White VI’DNA為模板，以GA、AAG、ATG和CAG為基序，篩選了15個SSR位點(diǎn)。蔡明等［9］從紫薇基因組中分離出39個SSR，其中有12個多態(tài)的SSR結(jié)合現(xiàn)有的14個SSR，合計(jì)26個SSR可以明確識別所有品種，并分成兩個不同的組。新開發(fā)的SSR對于遺傳多樣性評估、遺傳圖譜構(gòu)建和分子育種是有效的。徐靜靜［10］等使用ISSR標(biāo)記技術(shù)對4種不同花色紫薇群體進(jìn)行分析，研究證明4種紫薇群體具有豐富的遺傳多樣性，聚類分析結(jié)果表明白色、紫色及粉色系的單株基本聚在一起，但紅色系的聚類結(jié)果比較分散，且紅色和白色親緣關(guān)系較近，與粉色的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Wang等［11］使用78個SSR標(biāo)記來評價51個紫薇品種、5個屋久島紫薇品種和37個種間雜種的遺傳多樣性。SSR基因座在不同的品種之間有很大差異，每個位點(diǎn)平均檢測到6.6個等位基因。聚類分析確定了紫薇栽培品種和屋久島紫薇單個品種及其種間雜種的三個主要組。謝憲［12］通過AFLP技術(shù)分析了紫薇3個雜交組合的親代和子代43個材料的聚類分析表明，紫薇紫色和紅色單株能聚成一支，粉色單株比較分散。喬中全等［13］在2019年基于ISSR分子標(biāo)記，分析了紫薇栽培品種（其中引自美國30個品種，中國8個品種）的親緣關(guān)系。分析結(jié)果表明，38個品種共聚為3支。第一個分支全部是美國引進(jìn)品種，第二個分支包括10個美國引進(jìn)的品種和7個中國種植的品種，第三個分支引進(jìn)品種和中國栽培品種是同一個。這些研究在分子水平對紫薇品種的分類、鑒定方面取得一定的進(jìn)展，但對從其他國家進(jìn)口的紫薇品種研究比較少，在遺傳多樣性和種質(zhì)資源評價方面不能進(jìn)行全面的概括。SSR分子標(biāo)記由于其在基因組中覆蓋率高、實(shí)驗(yàn)操作步驟簡單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測出品種親緣關(guān)系之間的細(xì)小差異，現(xiàn)在已經(jīng)廣泛應(yīng)用于品種種質(zhì)資源親緣關(guān)系、遺傳多樣性的研究，本試驗(yàn)對30種來源于美國的紫薇品種利用SSR分子標(biāo)記的方法探討不同紫薇品種的親緣關(guān)系。本研究對來自30個不同品種名的紫薇進(jìn)行簡單重復(fù)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記研究，避免表型分類有同名異物及同物異名的差異，希望深入探究來源不同的紫薇品種的親緣關(guān)系。

1 材料與方法：

1.1 植物材料

30份試驗(yàn)材料均取自湖南省林業(yè)科學(xué)實(shí)驗(yàn)林場紫薇種質(zhì)資源圃，在選定的植株上隨機(jī)選取生長健康且無病蟲污染的植物葉片，用密封袋半封口并放置于冰袋上帶回實(shí)驗(yàn)室，用雙蒸水清洗干凈于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)材料編號見（表格1）。

表1 實(shí)驗(yàn)材料Table 1 Experiment Material

1.2 紫薇基因組DNA提取

紫薇葉片基因組DNA采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的新植物基因組DNA提取試劑盒，提取和改良CTAB法［14］,具體操作步驟參考新植物基因組DNA提取試劑盒使用說明書。根據(jù)紫薇屬植物的特性和實(shí)際情況進(jìn)行改進(jìn)，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和蛋白測定儀檢測DNA的完整性及濃度。

1.3 引物篩選和PCR擴(kuò)增

采用優(yōu)化好的SSR-PCR反應(yīng)體系，即25μL反應(yīng)體系，模板DNA 1μL（50 ng/L），上下游引物各1μL（10μmol/L），2×Rapid Taq PCR Master Mix（含有Taq酶、dNTP和緩沖液）12.5μL，雙蒸水補(bǔ)足至25μL。在95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，退火溫度為60℃15 s，在72℃延伸15 s，總共34個循環(huán)，在4℃保存。通過5%的瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)BIO-RAD中成像，從100對引物中選擇背景清楚、擴(kuò)增條帶清楚且亮度較高的10對引物用于紫薇樣品的SSR-PCR反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶，選擇清晰、可辨認(rèn)的條帶記為“1”，不清晰或模糊的記為“0”形成原始矩陣，使用POPGENE 32軟件計(jì)算出觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon’s信息指數(shù)（I）、遺傳距離、遺傳一致度；利用MAGE 7.0進(jìn)行紫薇品種間的聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薇葉片基因組DNA提取結(jié)果

通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得到的紫薇基因組DNA條帶清晰，檢測結(jié)果表明紫薇基因組DNA完整性好，無降解，濃度高，基本沒有蛋白質(zhì)及RNA的污染。

圖1 DNA檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresi of DNA detection

2.2 品種間遺傳多樣性分析

本實(shí)驗(yàn)從100對SSR引物中篩選出10對背景清晰、亮度高、多態(tài)性好的引物對30種紫薇品種進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出清晰的條帶，總共擴(kuò)增出10條帶，多態(tài)性比率為100%。30份樣品的觀測等位基因（Na）平均含有2.7個，在SSR09位點(diǎn)有等位基因數(shù)量最多為4個、有效等位基因數(shù)（Ne）為1.6839、Shannon’s信息指數(shù)（I）分布范圍在0.3251～0.8434，平均值為0.650 2（見表格2），在SSR13位點(diǎn)最高為0.843 4，表明在此位點(diǎn)具有較為豐富的遺傳信息。以上遺傳多樣性分析均表明30個供試樣品間的遺傳多樣性較高、具有豐富的遺傳變異。

圖2 引物SSR1對30個品種的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of the amplified products of primer SSR1 on 30 varieties

圖3 引物SSR7對30個品種的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of the amplified products of primer SSR7 on 30 varieties

圖4 引物SSR32對30個品種的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of the amplified products of primer SSR32 on 30 varieties

表2 30個紫薇品種的遺傳多樣性Table 2 Genetic diversity of 30 crape myrtle varieties

2.3 遺傳一致度及遺傳距離分析

遺傳距離和遺傳一致度可以評價種品種之間遺傳分化程度和親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，遺傳距離越小，越接近于“0”，遺傳一致度越高，越接近于“1”，表明種群之間的遺傳分化程度越小，親緣關(guān)系越近；反之，種群之間的遺傳分化程度越大，親緣關(guān)系越遠(yuǎn)。通過PopGen 32軟件進(jìn)行對30個紫薇樣品間遺傳相似性系數(shù)及遺傳距離的計(jì)算。30個紫薇品種中，遺傳一致度的范圍介于0.111 2～0.911 8,平均值為0.719 7，“Bradberry Wine”和“Catawba”遺傳一致度最高為0.911 8，表明兩者親緣關(guān)系相近；“Victor”和“Blush”遺傳一致度最低，為0.111 2，表明兩者存在遺傳差異較大。Nei’s遺傳距離的范圍介于0.027 0～0.896 5,平均值為0.404 1，“Bradberry Wine”和“Catawba”遺傳距離最近，為0.027 0，表明兩者遺傳分化程度小，親緣關(guān)系相近；“Victor”和“Blush”遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.896 5，表明兩者存在遺傳分化程度大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與遺傳相關(guān)性數(shù)據(jù)一致。

2.4 紫薇品種的聚類分析

根據(jù)UPGMA法對30種紫薇品種進(jìn)行聚類分析，得到不同品種間的遺傳關(guān)系樹狀圖（見圖5）。30個紫薇品種可以大致分為4個類群。類群Ⅰ由12個品種組成：“Double Feature”、“Bradberry Wine”、“Catawba”、“Siren Red、Red Filli”、“Red Roost”、“Shell Pink”、“Purple Majic”、“Sacramento”、“Sacramento”、“Dynamite”、“Victor”、“Berry Dazzle”；類群Ⅱ由15個品種組成：“Rhapsody in Pink”、“Best Red”、“Midnight Majic”、“Peppermint”、“Cherry Dazzle”、“Crimson Red”、“Coral Malic”、“Purely Purple”、“Red Hot”、“Shawberry Dazzle”、“Pure velvet”、“Pure White”、“Tonto”、“Moonlight Majic”、“Natche”；類群Ⅲ由2個品種組成：“Chisam Fire”、“Mystic Magenta”；類群Ⅳ由單獨(dú)1個品種組成：“Blush”。

圖5 30個紫薇品種的UPGMA聚類圖Fig.5 UPGMA cluster map of 30 crape myrtle varieties

3 討論

利用改良CTAB法從紫薇葉片中提取基因組DNA，通過檢測結(jié)果可知DNA無明顯降解，濃度較高但純度一般；使用試劑盒提取紫薇基因組DNA，通過檢測結(jié)果可知DNA無明顯降解，純度較高，但濃度相比較改良CTAB法較低，使用試劑盒提取紫薇DNA基因組操作相對于改良CTAB法更方便快捷。實(shí)驗(yàn)所提取的DNA可進(jìn)一步用于后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)。

SSR分子標(biāo)記由于其在基因組中覆蓋率高，同時具有實(shí)驗(yàn)操作步驟簡單、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，是研究作物種質(zhì)資源遺傳多樣性及群體結(jié)構(gòu)分析的重要工具［15］，廣泛應(yīng)用于大部分植物遺傳多樣性研究。從100對SSR引物中篩選出10對背景清晰、亮度高、多態(tài)性好的引物。用篩選出的10對引物通過PCR擴(kuò)增30個紫薇品種，可以擴(kuò)增出10個清晰的多態(tài)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為100%，表明SSR分子標(biāo)記可以用于紫薇品種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系鑒定。劉陽等［16］利用41對SSR引物對48個紫薇品種遺傳多樣性分析中總共獲得317個等位基因位點(diǎn)，其中單對引物最多獲得15個等位基因位點(diǎn)，最少有3個。相比之下，此次試驗(yàn)結(jié)果均低于該研究。

聚類分析是根據(jù)試供材料的多個數(shù)據(jù)指標(biāo)進(jìn)行分類，是探究種質(zhì)資源遺傳多樣性和遺傳背景的有效手段［17］，是植物保護(hù)和利用的前提，分析后聚集在同一類別的材料具有很大程度的相似性，不同類別的則差異性較大。聚類分析可以直觀的表示品種或群類之間的遺傳關(guān)系及遺傳相似性。SSR聚類分析依據(jù)分子水平上的遺傳一致度和遺傳距離關(guān)系分類，可以直觀的了解紫薇品種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。群類Ⅰ和群類Ⅱ中包含30個紫薇品種的大部分，其中“Dynamite”、單獨(dú)為一類的品種“Blush”分類意見與喬中全等［13］研究結(jié)果意見不一致。群類Ⅱ中“Crimson Red”和“Coral Malic”兩者親緣關(guān)系較為接近卻出現(xiàn)不同的花色，確與遺傳距離更遠(yuǎn)的品種花色相同，這與王獻(xiàn)等［6］提出的不能單獨(dú)以花色這一形態(tài)特征鑒別紫薇品種的意見一致。本實(shí)驗(yàn)未能擴(kuò)增出特異性片段與紫薇品種的花色或其他形態(tài)特征相關(guān)，因此還需大量開發(fā)特異性引物，更深入探究紫薇品種的遺傳背景。

本次試驗(yàn)中，由于所采用的紫薇品種不夠豐富，不能完全概括紫薇的遺傳關(guān)系，應(yīng)該增加試驗(yàn)材料品種的豐富度，選用不同引物，結(jié)合株型、花萼特征、花色等表型形狀，表型形狀是受基因型和環(huán)境因素共同影響的［18］，由于紫薇的品種多樣，來源復(fù)雜，只憑傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記不能對品種進(jìn)行有效鑒定，易致紫薇在品種分類，遺傳多樣性的鑒定中產(chǎn)生困難，同時以表型形狀為選育標(biāo)準(zhǔn)可能導(dǎo)致紫薇新品種育種失敗。往后會繼續(xù)結(jié)合紫薇的表型形狀、生物學(xué)特性、細(xì)胞學(xué)分析、分子水平上的鑒定綜合分析紫薇品種的親緣關(guān)系。本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自美國的30個紫薇品種遺傳多樣性分析及親緣關(guān)系進(jìn)行初步探討。目前我國紫薇屬植物有18種，但尚處于研究初期，起步較晚，與美國、日本等國家存在一定差距［19］。因此，我們要大力加強(qiáng)對紫薇屬植物的開發(fā)利用，積極開展相關(guān)試驗(yàn)工作，進(jìn)一步深入研究紫薇屬植物遺傳特性，為紫薇屬植物種質(zhì)資源多樣性提供重要信息，以期對紫薇新品種開發(fā)選育、繁殖栽培等方面提供技術(shù)支撐。