新疆焉耆地區(qū)4 種動(dòng)物源的沙門菌耐藥性及耐藥基因檢測

宋強(qiáng)強(qiáng)，軒慧勇，劉雪連，宋超慧，徐琦琦，秦蕾，夏利寧*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司，北京 100192；3.新疆草食動(dòng)物新藥研究與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052)

沙門菌(Salmonella)是腸道常見的人畜共患病原菌之一，其宿主廣泛，可引起人畜多種急性、慢性或隱性感染，沙門菌引發(fā)疾病的暴發(fā)給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，并嚴(yán)重威脅人類健康[1]?？咕幬镆恢笔丘B(yǎng)殖企業(yè)治療沙門菌病的首選藥物[2]，在長期不斷增長的抗菌藥物選擇性壓力下，沙門菌耐受抗菌藥物的種類不斷增加，多重耐藥基因mcr1-9[3]、tet(X3)和tet(X4)[4]等在動(dòng)物源沙門菌中不斷涌現(xiàn)。王亞楠等[5]研究表明，養(yǎng)殖業(yè)是耐藥菌產(chǎn)生的重要來源，耐藥基因可沿著食物鏈進(jìn)行傳播。因此，亟待有效進(jìn)行動(dòng)物源沙門菌的鑒定和耐藥沙門菌的控制。新疆焉耆地區(qū)以小中型散養(yǎng)戶為主，未形成規(guī)范化的用藥標(biāo)準(zhǔn)，其不同動(dòng)物源沙門菌的流行現(xiàn)狀和耐藥情況不清。針對以上問題，本研究中，從新疆焉耆縣的雞源、羊源、豬源和牛源4 種動(dòng)物源的糞樣中分離沙門菌，對其進(jìn)行耐藥性及相關(guān)耐藥基因的檢測，分析不同動(dòng)物源沙門菌流行情況及其耐藥特征，旨在為該地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)臨床的合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品

2019 年10 月，在新疆焉耆地區(qū)分別采集羊(200份)、豬(300 份)、牛(100 份)和雞(300 份)肛拭子樣品，共計(jì)900 份。

1.1.2 質(zhì)控菌株及培養(yǎng)基

大腸埃希菌ATCC25922 作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌，購于杭州天和微生物試劑有限公司；MH 肉湯、SS 瓊脂培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司；1×TE 緩沖液購自上海生工生物有限公司；DNA Maker DL 2000 購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqPCR Master Mix、瓊脂糖、50×TAE和核酸染料均購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離和鑒定

將采集的樣品在SS 培養(yǎng)基上劃線，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h 后，SS 培養(yǎng)基上生長出形態(tài)為中間黑色周邊無色的菌落，初步鑒定為沙門菌。將SS 培養(yǎng)基上初步鑒定的菌落劃線于沙門顯色培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h 后，沙門顯色培養(yǎng)基上生長出淡紫色單菌落，進(jìn)一步鑒定為沙門菌。對沙門菌特異性侵襲基因invA[6]進(jìn)行PCR 鑒定。該基因的PCR產(chǎn)物大小為284 bp，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后進(jìn)行膠回收，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用BLAST進(jìn)行序列比對，同源性大于96%的結(jié)果判定該菌株的鑒定結(jié)果。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)[7]推薦的瓊脂稀釋法進(jìn)行。對分離的沙門菌進(jìn)行11 種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)的測定。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922，結(jié)果判定參照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)，判斷結(jié)果分別以敏感(S)、中介(I)和耐藥(R)共3 種形式表示。

1.2.3 耐藥基因檢測

選取β-內(nèi)酰胺類耐藥基因blaCMY-2、blaTEM、blaOXA，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB，喹諾酮類耐藥基因qnrS、oqxA、oqxB、aac(6′)-Ib-cr，氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-Ib、aadA2、ant(3")-Ia，酰胺醇類耐藥基因floR，多肽類耐藥基因mcr-1共6 類14 種耐藥基因[8-9]進(jìn)行檢測。對檢出aac(6′)-Ib基因的使用BstF5I 酶進(jìn)行酶切，若存在-cr突變，則aac(6′)-Ib基因?qū)⒉荒鼙磺懈睿醋儺悶閍ac(6′)-Ibcr基因。以上耐藥基因引物由上海生工生物有限公司合成。

DNA 模板制備：將純化后的沙門菌接種于SS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h 后挑單菌落于1×TE 緩沖液中，放入PCR儀中，設(shè)置程序?yàn)?5 ℃運(yùn)行10 min，拿出迅速置于冰塊中，10 min 后取出，DNA 模板制備完成。PCR 反應(yīng)體系為20 μL：模板DNA 1 μL、2×TaqMaster Mix 10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、ddH2O 8 μL。取7 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)加過核酸染料的1%瓊脂糖凝膠電泳后，取膠塊于凝膠成像儀進(jìn)行成像分析，將正確條帶的PCR 產(chǎn)物回收純化，送至上海生工生物有限公司測序，測序結(jié)果用BLAST 進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

耐藥結(jié)果采用Excel 2019 和SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方檢驗(yàn)分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙門菌的分離和鑒定結(jié)果

分離的沙門菌在SS 培養(yǎng)基上為黑色、表面光滑的圓形單菌落(圖1)。分離菌在沙門菌顯色培養(yǎng)基上為小圓形、淡紫紅色、表面濕潤的單菌落(圖2)。

圖1 沙門菌在SS 培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Fig.1 Growth status of Salmonella on SS medium

圖2 沙門菌在顯色培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)Fig.2 Growth status of Salmonella on chromogenic medium

PCR 擴(kuò)增出與陽性菌株片段大小(284 bp)一致的目的片段，且目的條帶單一明亮，無雜帶(圖3)，經(jīng)測序比對后同源性大于96%，即判定為沙門菌。

圖3 部分菌株invA 基因的PCR 檢測結(jié)果Fig.3 PCR identification results of part of invA gene

經(jīng)SS 培養(yǎng)基、沙門顯色培養(yǎng)基和invA基因鑒定，新疆焉耆地區(qū)不同動(dòng)物源樣品共分離出191 株沙門菌(表1)。動(dòng)物源沙門菌總體分離率為21.2%；牛源沙門菌分離率最高，達(dá)62.0%；羊源沙門菌分離率最低，僅為8.5%。

表1 新疆焉耆地區(qū)動(dòng)物源沙門菌的分離率Table 1 Isolation r ates o f Salmonella fr om anim al sour ces in Yanqi, Xinjiang

2.2 動(dòng)物源沙門菌的耐藥性

由表2 可知，不同動(dòng)物源沙門菌對被檢11 種抗菌藥物呈現(xiàn)不同的耐藥結(jié)果，且對主要抗菌藥物的耐藥種類不同：雞源菌耐藥譜最寬，對11 種被檢藥物中的8 種藥物耐藥，對四環(huán)素(76.5%)和氟苯尼考(70.6%)的耐藥率高于其他動(dòng)物源的；羊源菌對11種被檢藥物中的7 種抗菌藥物耐藥，對氨芐西林耐藥率高達(dá)88.2%，高于其他動(dòng)物源；豬源菌對11 種被檢藥物中的5 種抗菌藥物耐藥，對氟苯尼考耐藥率超過50.0%；牛源菌對11 種被檢藥物中的4 種抗菌藥物耐藥，對環(huán)丙沙星(66.1%)和氨芐西林(64.5%)的耐藥率超過60.0%。除雞源沙門菌對阿米卡星耐藥率為24.7%外，其余動(dòng)物源沙門菌對阿米卡星無耐藥菌株檢出，且不同動(dòng)物源沙門菌對亞胺培南、多粘菌素和磷霉素高度敏感，無耐藥菌株檢出。

表2 新疆焉耆地區(qū)動(dòng)物源沙門菌耐藥結(jié)果Table 2 Results of resistance to Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

2.3 動(dòng)物源沙門菌多藥耐藥性及耐藥譜型

從表3 可知，不同動(dòng)物源沙門菌對被檢抗菌藥物均有多藥耐藥菌株檢出，多藥耐藥菌株占比高達(dá)46.1%，耐受2 種以上抗菌藥物的菌株占61.3%。其中，羊源沙門菌多藥耐藥在0～3、5～7 耐有分布，以1 耐(35.2%)和7 耐(23.5%)為主，占58.7%；豬源沙門菌多藥耐藥在0～4 耐有分布，以1 耐最高，多藥耐藥率達(dá)40.8%；牛源沙門菌多藥耐藥在0～4 耐有分布，以0 耐(21.0%)、2 耐(19.3%)、4 耐(38.7%)為主，占79.0%，其中以4 耐最高；雞源沙門菌多藥耐藥在0～3、5～7 耐有分布，以1 耐(21.2%)、2耐(15.3%)、3耐(17.6%)和6耐(15.3%)為主，占69.4%。

表3 新疆焉耆地區(qū)動(dòng)物源沙門菌的多藥耐藥率Table 3 Multidrug resistance rates of Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

耐藥譜型結(jié)果顯示，不同動(dòng)物源沙門菌耐藥譜型多樣化，191 株沙門菌共檢出38 種耐藥譜型。雞源沙門菌共有12 種耐藥譜型，以2 耐、3 耐和6 耐譜型為主；2 耐譜型中以 TET+FFC 為主，占11.8%(10/85)；6耐譜型中以CIP+AMK+AMP+CEF+TET+FFC 為主，占15.3%(13/85)；5 株7 耐菌株的譜型均為CIP+AMK+GEN+AMP+CEF+TET+FFC。牛源沙門菌共有10 種耐藥譜型，以2 耐和4 耐譜型為主；2 耐譜型中以CIP+AMP 為主，占14.5%(9/62)；4 耐譜型中以CIP+AMP+TET+FFC 為主，占38.7%(24/62)。豬源沙門菌有9 種耐藥譜型，以TET 為主要普型(22.2%，6/27)。羊源沙門菌有7 種耐藥譜型，以耐AMP 為主要譜型(35.3%，6/17)。

2.4 動(dòng)物源沙門菌的耐藥基因

從表4 可知，不同動(dòng)物源沙門菌中除qnrS和mcr-1基因未檢出外，其余被檢耐藥基因均有檢出，且牛源沙門菌對所檢耐藥基因檢出率最高，在35%以上，羊源與豬源沙門菌對以上耐藥基因檢出率在20%左右，雞源沙門菌對以上耐藥基因檢出率不到10%。其中，不同動(dòng)物源沙門菌中檢出的β-內(nèi)酰胺類基因以blaTEM和blaOXA為主，牛源沙門菌blaTEM基因檢出率最高，達(dá)79.0%，僅在豬源沙門菌中檢出1 株菌攜帶blaCMY-2基因；不同動(dòng)物源沙門菌中檢出的四環(huán)素類耐藥基因均以tetB基因?yàn)橹鳎瑑H在豬源沙門菌中檢出tetA基因，檢出率為22.2%；不同動(dòng)物源沙門菌中喹諾酮類耐藥基因oqxA、oqxB，氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-Ib、aadA2、ant(3")-Ia和酰胺醇類耐藥基因floR的檢出率為9.4%～46.8%。檢出的aac(6′)-Ib基因全部存在-cr變異，即存在aac(6′)-Ib-cr基因介導(dǎo)的喹諾酮耐藥。

表4 新疆焉耆地區(qū)動(dòng)物源沙門菌耐藥基因的檢出率Table 4 Detection rates of resistance genes of Salmonella from animal sources in Yanqi, Xinjiang %

3 結(jié)論與討論

本研究中，從不同動(dòng)物源糞樣中分離沙門菌，沙門菌的整體分離率為21.2%，該結(jié)果與宋雪等[10]報(bào)道的(健康畜禽沙門菌分離率為20.67%)相近。不同動(dòng)物源沙門菌的分離率相差較大，其中牛源沙門菌分離率最高，達(dá)62.0%，遠(yuǎn)高于王華然等[11]報(bào)道的集中飼養(yǎng)牛源沙門菌檢出率為21.43%、散養(yǎng)牛源沙門菌檢出率為5.05%的結(jié)果。本研究中，羊源樣本沙門菌分離率僅為8.5%，遠(yuǎn)低于江萍等[12]報(bào)道的結(jié)果(51.5%)。本研究從4 種動(dòng)物源中均分離出了沙門菌，顯示出沙門菌普遍存在于養(yǎng)殖業(yè)中。此外，不同動(dòng)物源沙門菌的攜帶率相差大，與不同養(yǎng)殖場是否暴發(fā)過沙門菌病有關(guān)。而不同養(yǎng)殖場使用的抗菌藥物和消毒劑的種類不同，也是造成沙門菌分離率差異較大的原因之一。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同動(dòng)物源沙門菌均對氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考有較高的耐藥性，耐藥率均在30%以上。其中雞源沙門菌對四環(huán)素和氟苯尼考耐藥率最高，達(dá)70.0%以上，該耐藥結(jié)果與夏宇飛等[13]報(bào)道的相近，但高于顏衛(wèi)等[14]報(bào)道的結(jié)果。四環(huán)素和氟苯尼考作為廣譜抗菌藥物，對很多感染性疾病的治療有很好的療效。養(yǎng)殖場用藥調(diào)研結(jié)果顯示，這2 種藥物長期、大量地應(yīng)用于臨床，使該地區(qū)沙門菌對這2 種抗菌藥物具有較高的耐藥率。此外，不同動(dòng)物源沙門菌對被檢抗菌藥物的耐藥種類不同。如羊源沙門菌主要對氨芐西林耐藥率較高，牛源沙門菌主要對環(huán)丙沙星和氨芐西林耐藥率較高，而豬源和雞源沙門菌則主要對四環(huán)素和氟苯尼考耐藥率較高。結(jié)合用藥調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同養(yǎng)殖場所用的主要抗菌藥物種類不同；因此，不同動(dòng)物源沙門菌對被檢抗菌藥物的耐藥種類也不同。但不同動(dòng)物源的沙門菌對磷霉素和亞胺培南均無耐藥菌株，這與部分報(bào)道[15-17]的研究結(jié)果相符。

本研究中，多藥耐藥菌株占比高達(dá)46.1%，耐藥譜分為38 個(gè)譜型，耐受2 種以上抗菌藥物的菌株占61.3%，最多可同時(shí)耐7 種抗菌藥物。不同動(dòng)物源沙門菌顯示出多藥耐藥性和譜型多態(tài)性，與牟豪等[18]報(bào)道的情況基本一致?？梢姡瑢τ谘申鹊貐^(qū)日趨嚴(yán)重的沙門菌耐藥性需持續(xù)加強(qiáng)耐藥監(jiān)測。此外，應(yīng)結(jié)合耐藥結(jié)果，通過規(guī)范臨床抗菌藥物的使用和聯(lián)合用藥，減少多藥耐藥株的不斷增加。

耐藥基因檢測結(jié)果顯示，新疆焉耆地區(qū)不同動(dòng)物源沙門菌耐藥基因攜帶率高，且不同動(dòng)物源沙門菌均以同時(shí)攜帶blaTEM、blaOXA、tetB、oqxA、oqxB、aac(6′)-Ib-cr、aadA2、ant(3")-Ia、floR耐藥基因?yàn)橹鳌Ｕf明以上耐藥基因在新疆不同動(dòng)物源沙門菌中廣泛分布，不同動(dòng)物源沙門菌主要攜帶的耐藥基因略有差異。牛源沙門菌耐藥基因攜帶率略高于其他3 種動(dòng)物源，豬源和羊源沙門菌耐藥基因攜帶率較為接近，雞源沙門菌耐藥基因的攜帶率最低。不同地區(qū)耐藥基因攜帶率具有較大差異，李軍朝[19]對揚(yáng)州及周邊地區(qū)不同動(dòng)物源分離的沙門菌進(jìn)行6 種沙門菌外排泵基因檢測，不同動(dòng)物源沙門菌外排泵基因陽性率均在90%左右，這說明外排泵基因在沙門菌當(dāng)中有著廣泛的分布；何英[20]對重慶部分地區(qū)不同動(dòng)物源沙門菌ESBL 耐藥基因檢測結(jié)果顯示，ESBL 耐藥基因陽性率高達(dá)89.5%，其中以blaTEM檢出率最高，達(dá)85.5%，本研究結(jié)果與其相近；牟豪[21]對重慶地區(qū)不同動(dòng)物源沙門菌PMQR 基因檢測結(jié)果顯示，76.9%的沙門菌至少攜帶1 種PMQR基因，檢出率最高的是oqxB(57.1%)，PMQR 陽性菌株中常見的基因表型為qnrB+oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr和oqxA+oqxB+aac(6′)-Ib-cr，分別占總數(shù)的14.3%和11.4%；豈曉鑫[22]對1950—2009 年中國沙門菌耐藥基因的檢測結(jié)果顯示，以sul2、blaTEM和tetA這3 種耐藥基因檢出率較高，分別為76.19%、71.43%和61.90%，耐11 種以上抗菌藥物的耐藥菌均檢出攜帶有blaOXA、aacC4、aac(6′)-Ib、floR和tetA，推測此基因組合可能是其成為超級(jí)耐藥克隆的主要原因。以上研究結(jié)果可以看出，中國不同地區(qū)動(dòng)物源沙門菌主要以攜帶aac(6′)-Ib-cr喹諾酮類耐藥基因、blaTEM頭孢類耐藥基因和外排泵耐藥基因?yàn)橹鳌?/p>

本研究中，雞源沙門菌耐藥基因檢出率結(jié)果與耐藥結(jié)果沒有絕對相關(guān)性，部分耐藥表型菌株未檢測到相應(yīng)的耐藥基因，如藥敏結(jié)果顯示雞源沙門菌對四環(huán)素和氟苯尼考的耐藥率在70.0%以上，而tetB和floR基因的檢出率僅有9.4%，該耐藥結(jié)果與李軍朝[19]報(bào)道的耐藥現(xiàn)象(32 株沙門菌分離株對所有受試抗生素均敏感，但外排泵基因陽性率也均在90%以上)不同。可見，沙門菌的耐藥與否與耐藥基因的存在是否存在必然聯(lián)系有待進(jìn)一步研究，可能存在其他未檢測的相應(yīng)耐藥基因(tetK、tetM等)或由其他機(jī)制介導(dǎo)的耐藥。

本研究中，新疆焉耆縣不同動(dòng)物源沙門菌的耐藥情況嚴(yán)重，耐藥譜型多樣化，以牛源沙門菌耐藥情況最為嚴(yán)重。不同動(dòng)物源沙門菌對氨芐西林、四環(huán)素和氟苯尼考耐藥率高，且耐藥基因的攜帶率最高。在臨床治療沙門菌引起的疾病時(shí)，可選用阿米卡星等敏感率較高的抗菌藥物，這樣才會(huì)有更好的治療效果，以減少抗菌藥物的濫用，降低細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。