沙芥幼苗葉片小熱激蛋白基因的克隆與表達

于曉婧，王萍，武兆昕，楊永升，許珂，尚鵬

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019)

植物響應逆境及發(fā)育信號合成相對分子質(zhì)量(15 000～30 000)較低的小熱激蛋白(smal heat shock proteins, sHSPs)[1]，它們可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)膜結(jié)合部分變性的蛋白質(zhì)并防止不可逆的聚集[2-3]。通過此過程維持細胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)并保護植物。小熱激蛋白通常含有保守的由β 折疊構(gòu)成的ACD 結(jié)構(gòu)域[4]。根據(jù)序列同源性以及亞細胞定位，認為sHSPs 基因家族至少可分為 17 個亞類，分布于細胞質(zhì)、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和質(zhì)膜上[5-6]。有研究表明，植物受到高溫脅迫后，sHSPs 的表達量顯著上升，耐熱性提高；另外寒冷、重金屬、干旱、鹽脅迫等也能誘導sHSPs 的表達[7]，且表達量可提高幾十到幾百倍，但其表達強度與脅迫強度及時間相關。植物受脅迫后sHSPs 的表達有半周期，說明小熱激蛋白可能對植物脅迫后的修復起重要作用[8]?；ㄩ睒銼pHSP17.3和SpHSP23.8在高溫、NaCl 及干旱脅迫下相對表達量均顯著升高，且存在組織特異性，在莖中的相對表達量最高，其次為果實和根，而花中的相對表達量最低[9-10]。匍匐翦股穎AsHSP26.8a在擬南芥中過表達后加強了轉(zhuǎn)基因擬南芥對激素 ABA 的敏感性[11]；擬南芥AtHSP17.4CI會受熱、冷、鹽、干旱和強光的誘導，且在脅迫早期就可以迅速表達[12]；辣椒CaHSP16.4的沉默會降低植株對熱脅迫和干旱脅迫的耐受性[13]；灰?guī)r皺葉報春PfHSP17.2在擬南芥中過表達后使其具有更強的抵御高溫、寒冷與鹽脅迫的能力[14]。沙芥(P.cornutum(L.)Gaertn.)為十字花科沙芥屬(PugioniumGaertn.)二年生草本旱生植物，是中國的特有種，也是沙芥屬植物的模式種，具有寬翅短角果的特化形態(tài)特征，是適應荒漠沙地嚴酷氣候環(huán)境的進化類群[15]。沙芥根系發(fā)達，是沙地先鋒植物，極耐沙埋，可有效阻止沙丘前移，因此也是一種很好的治理水土流失的沙生植物。沙芥屬的栽培技術(shù)[16]、植物學特征[17]、生理生化[18]、病蟲害防治[19]、加工利用[20]等研究都取得了進展。筆者前期通過對干旱脅迫下沙芥轉(zhuǎn)錄組與蛋白組的聯(lián)合分析，共找到6639 個差異表達基因和795 個差異表達蛋白，定量分析發(fā)現(xiàn)其中有109 個基因/蛋白在這2 個組學水平上均受到調(diào)節(jié)；進一步對這109 個基因/蛋白進行分析，結(jié)果小熱激蛋白的占比最多，通過聯(lián)合分析各小熱激蛋白在兩個組學中的差異倍數(shù)，篩選出PcHSP26.5和PcHSP17.8進行克隆與分析；對沙芥進行不同逆境脅迫，分析這2 個基因的表達情況，旨在為后續(xù)的小熱激蛋白基因功能驗證及沙芥品種選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克前旗毛烏素沙地的沙芥果實，挑選去除果皮后飽滿的種子，用2%次氯酸(HClO)消毒2 min，于智能培養(yǎng)箱中催芽。將發(fā)芽種子分為2 份：其中1 份均勻播種在花盆(內(nèi)徑18 cm、高15 cm)內(nèi)，置于溫室中，白天溫度28 ℃、光照14 h、光照度30 000 lx，夜晚15 ℃培養(yǎng)；另外1 份播種于規(guī)格為8 cm×8 cm 的營養(yǎng)缽內(nèi)，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，白天溫度28 ℃、光照16 h、光照度18 000 lx，夜晚23 ℃培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計

溫室中沙芥幼苗長至六葉一心時，通過自然干旱法進行干旱脅迫，利用稱重法控制土壤水分含量。以土壤相對含水量為田間持水量的70%～75%為對照；以土壤相對含水量分別為田間持水量的40%～45%和30%～35%為中度脅迫和重度脅迫。干旱處理10 d(重度干旱脅迫的沙芥葉片出現(xiàn)嚴重萎蔫)結(jié)束試驗，取樣進行液氮速凍，置于-80 ℃保存，備用。

對播種于光照培養(yǎng)箱中的沙芥幼苗進行高溫、低溫、NaCl、ABA 和干旱脅迫處理：①將沙芥幼苗分別放置于42 ℃和4 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)處理24 h；②將沙芥幼苗從培養(yǎng)缽中取出洗凈, 將根部浸泡于含有200 mmol/L NaCl 的1/2MS 培養(yǎng)基溶液中處理24 h；③將沙芥幼苗從培養(yǎng)缽中取出洗凈，將根部浸泡于含有100 μmol/L ABA 的1/2MS 培養(yǎng)基溶液中處理24 h，分別于處理后0.5、1、2、3、6、12 和24 h 取葉片和莖段部分用于RNA 提取，置于-80 ℃保存，備用；④考慮到外界環(huán)境中下土壤水分流失過程緩慢，未選擇通過PEG 進行模擬干旱，而是在給沙芥幼苗充分澆水后采用自然干旱持續(xù)處理9 d 后復水，復水后3、6、9、12 d 取葉片和莖段部分用于RNA 提取，置于-80 ℃保存，備用。

1.2.2 生物信息學分析

采用試劑盒提取沙芥幼苗葉片的基因組DNA與總RNA，用微量分光光度計檢測其濃度與質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 與RNA 的完整性與穩(wěn)定性。利用pEASY-Blunt Simple Cloning Kit試劑盒(北京全式金生物)進行 cDNA 第 1 鏈的合成，用于基因克隆與熒光定量分析。

對沙芥進行干旱脅迫得到的轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析，篩選并獲得差異顯著表達的2個基因(序列號c30518 和c46759)的開放閱讀框序列。運用Primer Premier 5 設計各自特異性引物(表1)，以沙芥葉片gDNA 與cDNA 為模板進行 PCR擴增：98 ℃預變性 5 min；98 ℃ 變性30 s，Tm 退火30 s，72 ℃延伸 min，35 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收目的條帶，并與pEASY-Blunt Simple Cloning Vector 載體連接，轉(zhuǎn)化進 DH5α 感受態(tài)細胞，涂板、挑菌后送上海生工生物科技有限公司測序。

表1 采用的引物及序列Table 1 Primers used in this study

運用 NCBI 中的 Blast 工具對獲得的基因及其編碼蛋白進行同源比對和保守結(jié)構(gòu)域分析；用ExPASy ProtParam tool(https://web.expasy.org/cgibin/ protparam/ protparam)預測蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量與理論等電點；運用ProtScale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)進行氨基酸親/疏水性分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl? page=npsa_sopma.html)預測蛋白二級結(jié)構(gòu)；用Netphos 3.0 Serve(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白質(zhì)磷酸化位點；用 TMPRED(http://www.ch.embnet.org/software/TMPREDform.html)預測跨膜結(jié)構(gòu)；用SignalIP(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)在線網(wǎng)址預測信號肽；用WoLF PSORT(https://wolfpsort.org/)進行亞細胞定位預測；用SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org/)預測編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)；用Clustal Omega 進行多序列氨基酸同源性比較并用 MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)分析

根據(jù)克隆得到的基因序列設計定量引物，以β-肌動蛋白(R2_Unigene_BMK.22570)基因用作為內(nèi)參基因[21]，按 SYBR? Premix ExTaqI(ITaKaRa，大連，中國)使用說明進行 qRT-PCR 分析。使用Roche480 進行熒光定量 PCR 反應：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s；60 ℃退火 30 s，循環(huán) 40次；95 ℃延伸 5 s，60 ℃再延伸1 min。每個樣品均設置 3 次重復，采用 2-ΔΔCt法分析結(jié)果。運用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙芥幼苗小熱激蛋白基因 cDNA 和 gDNA 序列

根據(jù)沙芥轉(zhuǎn)錄組與蛋白組聯(lián)合分析數(shù)據(jù)，以沙芥 cDNA 為模板進行PCR 擴增，連接載體并進行測序。結(jié)果顯示，其開放閱讀框長度分別為 699和462 bp，分別編碼232 和153 個氨基酸 ；通過Blast 比對，發(fā)現(xiàn)該片段為沙芥小熱激蛋白20 家族基因，根據(jù)預測蛋白相對分子質(zhì)量的大小，分別命名為PcHSP26.5和PcHSP17.8。以沙芥gDNA為模板的 PCR 產(chǎn)物堿基序列與PcHSP26.5和PcHSP17.8基因ORF 堿基序列進行比較，發(fā)現(xiàn)PcHSP26.5基因gDNA 序列共包含851 個堿基，在281 至433 位點插入1 個長度為152 bp 的內(nèi)含子，PcHSP17.8基因則不含內(nèi)含子。

2.2 沙芥小熱激蛋白基因的生物信息學

2.2.1 蛋白性質(zhì)預測

NCBI Blast 對比結(jié)果表明：PcHSP26.5 和PcHSP17.8 均含有小熱激蛋白典型的ACD 結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy Prot Param tool 分析PcHSP26.5和PcHSP17.8基因編碼蛋白的基本理化性質(zhì)，可以得知PcHSP26.5 和PcHSP17.8 的分子式分別為C1153H1842N338O364S7、C776H1239N211O238S5，相對分子質(zhì)量分別為26 480、17 490，理論等電點分別為6.36、5.99，不穩(wěn)定系數(shù)分別為52.69、49.44，說明皆為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)分別為 74.78、73.73，平均親水系數(shù)分別為-0.812、-0.625，說明都具有親水性。利用 ProtScale 對PcHSP26.5 和PcHSP17.8 進行親/疏水性分析，可以得知，PcHSP26.5 中氨基酸含量較豐富的是Glu(E)，有20 個，為所有氨基酸含量的8.6%；Asn(N)有19個，Leu(L)有19 個，二者均為所有氨基酸含量的8.2%；PcHSP17.8 中氨基酸含量較豐富的是Glu(E)，有17 個，Lys(K)、Ser(S)、Val(V)也各有17 個，均為所有氨基酸含量的11.1%。PcHSP26.5和PcHSP17.8 中帶負電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總個數(shù)分別為36、29，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總個數(shù)分別為35、26。PcHSP26.5 多肽鏈第213 位分值最高(1.522)，第221 位分值最低(-3.067)。PcHSP17.8 多肽鏈第135 位分值最高，為1.522；第96 位分值最低，為-3.067。根據(jù)負值越大，親水性越高；正值越大，疏水性越高的標準來判斷，二者皆為親水蛋白。

利用SOPMA 對PcHSP26.5 和PcHSP17.8 的二級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果(圖1)顯示，PcHSP26.5蛋白由36.21%的無規(guī)則卷曲、40.95%的α-螺旋、16.81%的延伸鏈和 6.03%的 β 轉(zhuǎn)角構(gòu)成；PcHSP17.8 蛋白則由 54.90%的無規(guī)則卷曲、20.26%的α-螺旋、19.61%的延伸鏈和5.23%的β轉(zhuǎn)角構(gòu)成。

圖1 沙芥小熱激蛋白二級結(jié)構(gòu)預測Fig.1 Prediction for secondary structures of small heat shock protein genes in Pugionium cornutum (L.) Gaertn.

利用 Netphos 3.0 Serve 預測 PcHSP26.5 和PcHSP17.8 蛋白的磷酸化位點，結(jié)果PcHSP26.5 有16 個絲氨酸、5 個蘇氨酸、4 個酪氨酸磷酸化位點，PcHSP17.8 有10 個絲氨酸和5 個蘇氨酸磷酸化位點，沒有酪氨酸磷酸化位點。

利用TMPRED 對PcHSP26.5 和PcHSP17.8 的跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，發(fā)現(xiàn)二者均不含跨膜結(jié)構(gòu)；利用SignalIP 對PcHSP26.5 和PcHSP17.8 信號肽進行預測，結(jié)果二者都不具有信號肽。用 SWISSMODEL 對PcHSP26.5 和PcHSP17.8 進行三級結(jié)構(gòu)預測，可看出二者均含大量的無規(guī)則卷曲與α-螺旋(圖2)，與二級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果相符。

圖2 沙芥小熱激蛋白的三維結(jié)構(gòu)預測Fig.2 Three-dimensional structure prediction for small heat shock protein genes in Pugionium cornutum (L.) Gaertn.

圖 3 基于氨基酸序列的PcHSP26.5 和PcHSP17.8 蛋白與其他植物 HSP20 蛋白的同源性比對Fig.3 Homologous alignment between PcHSP26.5(A) and PcHSP17.8(B) protein with HSP20 protein in other plants based on amino acid sequence

2.2.2 同源性比對與分子系統(tǒng)進化樹

利用 MEGA 7.0 來了解沙芥 PcHSP26.5 和PcHSP17.8 的進化關系，選擇擬南芥、水稻和大豆小熱激蛋白不同亞族的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果PcHSP26.5 與擬南芥AtHSP26.5 進化關系最近，同屬于 MⅡ亞族；而 PcHSP17.8 與AtHSP17.6A 和AtHSP17.8 進化關系較近，同屬于CⅠ亞族。推測PcHSP26.5 和PcHSP17.8 蛋白分別定位于沙芥的線粒體和細胞質(zhì)中，與WoLF PSOR預測結(jié)果相似。

利用Clustal Omega 進行同源性比對，結(jié)果(圖3)顯示：PcHSP26.5 與甘藍型油菜(Brassicanapus)BnHSP26.5D 蛋白(登錄號XP_013700958. 1:28-232)的相似性最高，為 84.8%；與芥菜(Capsella rubella)CrHSP26.5 蛋白(登錄號XP_0063033 34.1:17-232)的相似性為 81.86%；與擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtHsp26.5 蛋白( 登錄號Q9SSQ8.1)的相似性為78.02%。PcHSP17.8 與芥菜CrHSP17.8 蛋白(登錄號 XP_006303386.1:1-156)的相似性最高，為86.93%；與擬南芥AtHsp17.6A 蛋白(登錄號Q9XIE3.1)和甘藍型油菜BnHSP17.6 蛋白(登錄號XP_013748895.1:1-156)的相似性分別為86.58%和85.62%。

2.3 非生物脅迫下沙芥小熱激蛋白基因的表達

為了進一步了解沙芥PcHSP26.5、PcHSP17.8對逆境脅迫的響應情況, 對沙芥幼苗進行42 ℃高溫、4 ℃低溫、200 mmol/L NaCl、100 μmol/L ABA 脅迫和自然干旱再復水處理，利用實時熒光定量PCR 技術(shù)對沙芥PcHSP26.5、PcHSP17.8的表達模式進行分析。結(jié)果(表2)表明，高溫處理下，PcHSP26.5和PcHSP17.8相對表達量均在高溫脅迫1 h 后達到頂峰，分別為對照的42 000 倍和18 000倍。4 ℃低溫處理下，PcHSP26.5相對表達量在0.5 h 后達到對照的15 倍，之后開始下降；至脅迫后12 h ，PcHSP17.8的相對表達量均低于對照，24 h 時相對表達量升高，達到對照的1.7 倍。NaCl處理下，PcHSP26.5相對表達量在1 h 時達到頂峰，隨后驟然下降，3 h 恢復至對照的30 倍，6 h下降，隨后持續(xù)上升；PcHSP17.8相對表達量在3 h 達到頂峰，此后開始持續(xù)下降。ABA 處理下，PcHSP26.5 和PcHSP17.8相對表達量均在2 h 時達到頂峰，隨后開始下降，24 h 時有所回升，區(qū)別在于PcHSP26.5相對表達量在1 h 時開始上升，而PcHSP17.8相對表達量1 h 內(nèi)下降。干旱脅迫9 d時，PcHSP26.5相對表達量達到最高，復水3 d后，表達量下降至對照的2.9 倍；PcHSP17.8相對表達量在干旱9 d 后達到對照的111 倍，復水后下降至對照的20 倍。

表2 非生物脅迫下PcHSP26.5 和PcHSP17.8 的相對表達量Table 2 Relative expression level of PcHSP26.5 and PcHSP17.8 under abiotic stress

3 結(jié)論與討論

小熱激蛋白是細胞應對外界高溫、干旱、缺氧、重金屬等脅迫的第一道防線，具有分子伴侶功能[22]，能在不依賴ATP 的情況下阻止逆境脅迫下變性蛋白的累積以及保護蛋白的正確折疊[23]?；谇捌谏辰孓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)克隆得到的2 個小熱激蛋白基因PcHSP26.5和PcHSP17.8，均含有sHSPs家族典型的ACD 結(jié)構(gòu)域，證實這2 個基因?qū)儆谏辰嫘峒さ鞍祝瑫r也推測由于這一結(jié)構(gòu)的存在，才使得PcHSP26.5 和PcHSP17.8 具有sHSPs分子伴侶的功能。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示，PcHSP26.5 和 PcHSP17.8 分別屬于小熱激蛋白MⅡ亞族和 CⅠ亞族。同源性比對結(jié)果顯示，PcHSP26.5 和PcHSP17.8 與芥菜、擬南芥、甘藍型油菜的親緣性較近，推測這主要緣于沙芥與擬南芥、甘藍型油菜和芥菜均屬于十字花科。PcHSP26.5 和PcHSP17.8 分別包含6.03%和5.23%的β 轉(zhuǎn)角，有助于PcHSP26.5 和PcHSP17.8 蛋白形成反向平行結(jié)構(gòu)，進而形成二聚體等發(fā)揮功能[24]。蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾過程中較為重要和普遍的調(diào)節(jié)方式之一， PcHSP26.5 和PcHSP17.8 分別包含25 和15 個磷酸化位點，表明逆境脅迫下，PcHSP26.5 和PcHSP17.8 蛋白在翻譯后可能通過磷酸化修飾發(fā)揮抗性作用[25]。

大量研究表明，小熱激蛋白在植物正常生長過程中幾乎不表達，但在逆境脅迫后表達量發(fā)生成倍變化[26]。沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因在不同脅迫下的表達量有所不同，推測這可能是由于二者分屬于sHSPs 不同亞族的緣故[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，沙芥對高溫脅迫有一定耐受力，本研究中，42 ℃高溫脅迫 0.5 h 時，PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相對表達量即出現(xiàn)顯著性變化，脅迫1 h 時，PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相對表達量達到峰值，這與前人研究的結(jié)果[10,28]相似。在遭遇高溫脅迫后，短時間內(nèi)沙芥PcHSP26.5基因表達量的增加倍數(shù)均高于PcHSP17.8基因，這與SANMIYA 等[29]的研究結(jié)果相一致，當植物遭遇熱脅迫時，相比于定位在其他細胞器中的小熱激蛋白，線粒體的小熱激蛋白作用更顯著，會加快表達并發(fā)揮其功能。

低溫脅迫下，沙芥PcHSP26.5表達量在0.5 h時達到頂峰，之后下降，而PcHSP17.8表達量在脅迫后的24 h 內(nèi)變化幅度微弱； NaCl 和ABA 脅迫下，PcHSP26.5和PcHSP17.8表達量均出現(xiàn)上調(diào)，表明沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8對低溫脅迫響應較弱，但對高鹽和脫落酸脅迫響應較強。PcHSP26.5和PcHSP17.8的表達均受外源ABA 誘導，表明二者均屬于依賴于ABA 的脅迫響應基因。干旱脅迫下，PcHSP26.5和PcHSP17.8表達量均呈現(xiàn)出干旱下逐漸上升、復水后下降的趨勢，其中PcHSP17.8在干旱9 d 后的表達量成百倍上升，表明PcHSP26.5和PcHSP17.8均可以響應干旱脅迫，但PcHSP17.8對干旱脅迫的響應程度更高。這表明生長在沙漠地帶、經(jīng)常同時遭受高溫和干旱脅迫的沙芥總?cè)涸谶M化過程中可能已經(jīng)產(chǎn)生了一定的抵御能力。