環(huán)境脅迫對清香型白酒發(fā)酵核心微生物生長的影響

楊 埔，蔚慧欣，張 鑫，王鵬然，甄 攀，張麗珍2，，韓 英

（1.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西汾陽 032209；2.山西大學(xué)杏花村學(xué)院（山西釀造產(chǎn)業(yè)研究院（籌）），山西太原 030006；3.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

清香型白酒是中國白酒三大基本香型之一，其產(chǎn)品風(fēng)格突出“清香、柔和、勁爽、舒適”的特點[1]。傳統(tǒng)清香型白酒的發(fā)酵過程包括2 個階段，即大米查發(fā)酵和二米查發(fā)酵。一般來說，在清香型白酒的發(fā)酵過程中，酒醅理化性質(zhì)會隨著發(fā)酵時間的變化而變化。酒醅溫度呈現(xiàn)先升高，后降低的趨勢。起始溫度為10～20 ℃，頂火溫度可以達(dá)到30 ℃以上，最終保持在22～25 ℃，直到發(fā)酵完成[2-3]。在整個發(fā)酵階段，酒醅酸度持續(xù)升高[3]，pH 值呈現(xiàn)下降的趨勢[2]。而乙醇產(chǎn)量在7～14 d達(dá)到最高，此后保持基本穩(wěn)定[2-3]。

釀酒過程本質(zhì)上就是微生物的代謝過程。一般來說，霉菌在發(fā)酵之初起到糖化作用，其代謝產(chǎn)生的寡糖或單糖可以被酵母菌直接利用產(chǎn)生酒精。而細(xì)菌主要產(chǎn)生白酒風(fēng)味物質(zhì)及其前體物質(zhì)（如有機(jī)酸），起增香提味的作用[4-5]。利用高通量測序技術(shù)對清香型白酒釀酒過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究表明，酒醅中真菌和細(xì)菌群落組成復(fù)雜，并且隨著發(fā)酵過程而變化。其中，酵母屬和復(fù)膜孢酵母屬是優(yōu)勢真菌，而乳桿菌屬、片球菌屬是優(yōu)勢細(xì)菌[5]。

微生物的生長代謝受到多種環(huán)境條件的影響，如溫度、氧氣、pH 值。在清香型白酒發(fā)酵的中后期，隨著乙醇和有機(jī)酸（如乙酸、乳酸）含量的上升，這些環(huán)境脅迫不可避免的會對釀酒微生物的生長代謝造成影響。雖然通過高通量測序技術(shù)可以獲得酒醅發(fā)酵微生物的演替規(guī)律，但是卻無法闡明微生物演替的機(jī)制。鑒于此，本項目將以分離自酒醅的核心純種微生物為研究對象，分析環(huán)境脅迫（乙醇、乙酸、乳酸）對這些微生物生長的影響。本研究有助于闡明白酒發(fā)酵過程中微生物演替的規(guī)律，并可以為白酒發(fā)酵工藝的改進(jìn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母和產(chǎn)酸菌由本實驗室分離自汾陽市某酒廠并保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

MRS 培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司，調(diào)整pH5.5后，115 ℃滅菌30 min。

YPD 培養(yǎng)基：酵母粉10 g，葡萄糖20 g，麥芽糖20 g，蛋白胨20 g，水1 L，pH 5.5。固體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂。115 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 環(huán)境脅迫對酵母菌生長的影響

采用固體平板法分析酵母菌對環(huán)境脅迫的耐受性。在YPD 固體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的乳酸（0.5%v/v、1%v/v、2%v/v、4%v/v 和8%v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v 和2 %v/v）或乙醇（4 %v/v、8% v/v、12 %v/v、16 %v/v和20%v/v）后傾倒平板，再用滅菌槍頭分別挑取純種酵母菌的單菌落，接種于上述固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h后觀察菌株是否生長。

1.2.2 環(huán)境脅迫對產(chǎn)酸菌生長的影響

采用固體平板法分析產(chǎn)酸菌對環(huán)境脅迫的耐受性。在pH5.5 的MRS 固體培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的乳酸（0.125 %v/v、0.25 %v/v、0.5 %v/v、1 %v/v、2 %v/v 和4 %v/v）、乙酸（0.125 %v/v、0.25%v/v、0.5%v/v、1%v/v、2%v/v 和4%v/v）或乙醇（4 %v/v、8 %v/v、12 %v/v、16 %v/v 和20 %v/v）。然后用滅菌槍頭分別挑取純種產(chǎn)酸菌的單菌落，并將其接種于上述固體培養(yǎng)基，35 ℃培養(yǎng)120 h 后觀察菌株是否生長。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌對乳酸的耐受性

酵母菌對乳酸的耐受性結(jié)果如圖1 所示。所有的酵母菌都可以在含有2 %乳酸的YPD 培養(yǎng)基上生長。大部分酵母菌（62/64）對4 %乳酸具有耐受性；只有1 株酵母菌可以在含有8 %乳酸的培養(yǎng)基上生長，但是菌落較小。

圖1 釀酒酵母對乳酸的耐受性

2.2 酵母菌對乙酸的耐受性

酵母菌對乙酸的耐受性結(jié)果如圖2 所示。大部分酵母菌可以在含有0.125 %（64/64）、0.25 %（63/64）和0.5%（57/64）乙酸的培養(yǎng)基上生長。1株酵母菌可以在含有1 %乙酸的培養(yǎng)基上生長。所有的菌株都不能在含有2%乙酸的培養(yǎng)基上生長。

圖2 釀酒酵母對乙酸的耐受性

2.3 酵母菌對乙醇的耐受性

酵母菌對酒精的耐受性結(jié)果如圖3 所示。有61 株（95.3%）酵母菌可以耐受20%乙醇，另外3 株酵母菌只能耐受8%的乙醇。

圖3 釀酒酵母對乙醇的耐受性

2.4 產(chǎn)酸菌對乳酸的耐受性

產(chǎn)酸菌對乳酸的耐受性結(jié)果如圖4 所示。所有產(chǎn)酸菌都可以在不含乳酸的MRS 固體培養(yǎng)基上生長。隨著乳酸濃度的增加，產(chǎn)酸菌的耐受性逐漸降低。只有1 株產(chǎn)酸菌對0.125 %乳酸敏感，而只有6 株（11.3%）產(chǎn)酸菌可以在含有1%乳酸的培養(yǎng)基上生長，2 株菌可以耐受2%乳酸。4%乳酸能抑制所有產(chǎn)酸菌的生長。

圖4 產(chǎn)酸菌對乳酸的耐受性

2.5 產(chǎn)酸菌對乙酸的耐受性

產(chǎn)酸菌對乙酸的耐受性結(jié)果如圖5 所示。在陽性對照中，所有的產(chǎn)酸菌都可以生長，有46 株（86.8 %）產(chǎn)酸菌可以耐受0.125 %乙酸，34 株菌可以耐受0.5%乙酸；但是只有6 株（11.3%）產(chǎn)酸菌可以耐受1%乙酸，2 株（3.8%）菌可以耐受2%乙酸，所有菌株都不能在4%乙酸培養(yǎng)基上生長。

圖5 產(chǎn)酸菌對乙酸的耐受性

2.6 產(chǎn)酸菌對乙醇的耐受性

產(chǎn)酸菌對乙醇的耐受性結(jié)果如圖6 所示。只有6 株（11.3%）產(chǎn)酸菌對12%乙醇敏感，而有18 株（34.0%）產(chǎn)酸菌可以耐受20%乙醇。

圖6 產(chǎn)酸菌對乙醇的耐受性

3 討論

在白酒發(fā)酵過程中，微生物代謝活動產(chǎn)生了種類繁多的代謝產(chǎn)物。其中，釀酒酵母是最主要的酒精產(chǎn)生菌[6]，乳酸菌的主要功能是產(chǎn)生乳酸和乙酸[7]，而己酸菌，如梭菌屬、瘤胃菌科、巨球型菌屬、芽孢桿菌屬，則可以產(chǎn)生己酸[8]。隨后，畢赤酵母可以將有機(jī)酸和乙醇轉(zhuǎn)化為酯類[9]。這些物質(zhì)構(gòu)成了白酒中最主要的呈香物質(zhì)。目前的研究也主要集中在這些風(fēng)味物質(zhì)的功能上。然而，當(dāng)乙醇、有機(jī)酸等物質(zhì)含量過高時，也會抑制微生物的生長。這些環(huán)境脅迫對釀酒核心微生物生長代謝的影響，尚無系統(tǒng)的研究與報道。

研究顯示，隨著培養(yǎng)基中乳酸濃度的升高，乳桿菌細(xì)胞分裂變慢，代時延長，細(xì)胞體積和長度均變小[10]。有機(jī)酸在未解離狀態(tài)下是脂溶性的，可以通過自由擴(kuò)散透過微生物細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)，從而對微生物細(xì)胞產(chǎn)生毒害[11]；而解離部分會造成胞內(nèi)pH 值的變化，進(jìn)而影響DNA 的合成等過程，最終影響細(xì)胞生長[12-13]。因此，有機(jī)酸可以被用于食品防腐[11]。在傳統(tǒng)白酒發(fā)酵的中期，酒醅中的乙酸含量可達(dá)0.1 %～0.15 %[14-15]，而乳酸含量為0.6 %～1 %[14，16]。在該條件下，所有的酵母菌和一部分產(chǎn)酸菌（0.125 %乙酸，45/53；1 %乳酸，6/53）可以生長。而在發(fā)酵第28 天，酒醅中乙酸、乳酸含量分別達(dá)到了0.3%～1.7%[14-15]和1.2%～1.9%[14，16]，此時的乙酸濃度會嚴(yán)重抑制所有酵母菌和大部分產(chǎn)酸菌的生長，而乳酸濃度會抑制產(chǎn)酸菌的生長，但是幾乎不會抑制酵母菌的生長。

乙醇不僅會影響微生物細(xì)胞膜組成、結(jié)構(gòu)和流動性[17]，而且會導(dǎo)致DNA 復(fù)制速率的降低和DNA突變速率的增加[18]。在傳統(tǒng)白酒的發(fā)酵過程中，酒醅中乙醇的含量可達(dá)10%以上，而在控溫發(fā)酵中，乙醇含量可以達(dá)到20%[3]。本實驗的結(jié)果證實，大部分（61/64）酵母菌和一部分產(chǎn)酸菌（18/53）對高濃度（20%）乙醇表現(xiàn)出耐受性。

在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中，前期是產(chǎn)酒精過程，酒醅中酒精含量在7～14 d 即達(dá)到最高。然而，此時環(huán)境中的乙醇和有機(jī)酸并不影響酵母菌的生長。因此，酒精生成的停滯可能是其他環(huán)境條件引起的。而后期是產(chǎn)酸產(chǎn)酯的過程，產(chǎn)酸菌的生長并未受到抑制，并且產(chǎn)酸過程也可以持續(xù)發(fā)生。因此，環(huán)境因素影響酵母菌酒精產(chǎn)量的原因和機(jī)制，將是下一步的研究重點。