過氧化物酶與啤酒的抗氧化力研究進(jìn)展

徐銘陽，李 崎，任 濤，鄭飛云，王金晶，鈕成拓，劉春鳳

（1.江南大學(xué)，生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122；2.江南大學(xué)，釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無錫 214122）

現(xiàn)如今，啤酒在中國的生產(chǎn)總量已經(jīng)在世界排行第二，但是對于啤酒的品質(zhì)和老化控制等方面同發(fā)達(dá)國家相比較還有著不小的距離[1]，致使我國的啤酒行業(yè)在國際上的競爭力較弱。而風(fēng)味穩(wěn)定性一度被認(rèn)為是評判啤酒品質(zhì)最主要的指標(biāo)，同時也是影響其保質(zhì)期長短的重要原因，所以提升啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性，對啤酒風(fēng)味的老化進(jìn)行緩解是啤酒行業(yè)目前最重要的課題之一，也是高質(zhì)量啤酒釀造的核心所在。

啤酒的老化是一個十分復(fù)雜的過程，從原料、釀造過程、包裝、貯存到貨架期的各個階段都對成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性有著不同程度的影響[2]。麥芽中含有的一些能催化氧化多酚、不飽和脂類等物質(zhì)的氧化還原酶系，會使風(fēng)味老化前驅(qū)物質(zhì)含量增加，降低啤酒的抗氧化力，從而對啤酒的非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性造成不良影響[3]。啤酒釀造的主要階段是制麥、糖化、煮沸和發(fā)酵，其中制麥和糖化階段是一個抗氧化力上升的階段，同時伴隨氧化還原酶的形成，致使大量老化相關(guān)前驅(qū)物質(zhì)產(chǎn)生[4]，麥芽和麥汁的抗氧化力直接與成品啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性相聯(lián)系，啤酒整個生產(chǎn)過程中對抗氧化力的提升，會在啤酒老化前驅(qū)物的抑制和風(fēng)味穩(wěn)定性的提升等方面有著顯著影響。

1 啤酒釀造中的氧化還原酶系

啤酒的釀造原料主要是大麥麥芽，麥芽中的還原力在啤酒的整個生產(chǎn)過程中都發(fā)揮著重要作用。而大麥麥芽中的氧化還原酶主要包含脂肪酸氧化酶（LOX），過氧化氫酶（CAT），多酚氧化酶（PPO）和過氧化物酶（POD）[5]。在啤酒釀造的過程中會受到內(nèi)源性氧化還原酶促伴隨著許多復(fù)雜的反應(yīng)，使得老化物質(zhì)含量上升從而麥芽的抗氧化能力減弱，進(jìn)而對啤酒的風(fēng)味和外觀品質(zhì)產(chǎn)生不利影響。

1.1 脂肪氧化酶（LOX）

脂肪氧化酶（lip oxidase，簡稱LOX）又稱脂肪氧合酶，能催化如亞油酸和亞麻酸等有著順，順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的脂肪酸，和氧氣發(fā)生加合反應(yīng)產(chǎn)生氫過氧化物[6]。LOX 能轉(zhuǎn)化大部分脂類為敗壞醛類的前體物質(zhì)，釋放出不飽和脂肪酸，例如亞油酸，進(jìn)而利用氧使亞油酸生成為氫過氧化脂肪酸，再通過過氧化物異構(gòu)酶使得氫過氧化脂肪酸進(jìn)一步反應(yīng)，生成了乙酮醇，乙酮醇最后會被分解形成有著老化味道的醛類。具體催化反應(yīng)過程見圖1。

圖1 LOX催化的脂類轉(zhuǎn)化反應(yīng)[7]

麥芽等啤酒生產(chǎn)原料中含有的脂類很多，故在啤酒的儲存中脂肪酸氧化是對風(fēng)味老化最不利的因素之一[8]。對于脂肪氧化酶的研究國外開展較早，研究發(fā)現(xiàn)大麥在浸泡階段以后，其LOX 的酶活會受到抑制，但是在發(fā)芽時酶活的上升明顯，最終會達(dá)到大麥原有的5 倍，在烘焙階段其活性又顯示出明顯減弱的趨勢，結(jié)束后甚至?xí)仍写篼湹腖OX 活性還要低[9]。麥芽中的LOX 在通常糖化工藝條件下仍有催化活性，使得不飽和脂肪酸被催化氧化從而生成老化前驅(qū)物質(zhì)，且Takoi 等[10]認(rèn)為LOX 主要在糖化時發(fā)揮作用。但文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥汁在70 ℃下保溫15 min 后LOX 活力會喪失，同時也可采用在糖化中通入CO2或者N2的方法來降低LOX的作用[11]，進(jìn)而減弱其對啤酒抗氧化力的不良影響。

1.2 過氧化氫酶（CAT）

過氧化氫酶（Catalase，簡稱CAT）來源豐富，幾乎全部的好氧生物和一些厭氧生物中都有其存在[12]，啤酒釀造用大麥中也含有CAT 酶系。過氧化氫與游離羥基的產(chǎn)生有著密切聯(lián)系，可對動植物細(xì)胞產(chǎn)生損害，同時對啤酒的穩(wěn)定性和抗氧化性有著不良影響[13]，故在好氧系統(tǒng)廣泛存在的酶中擁有能消除過氧化氫的酶是很重要的。CAT 能催化H2O2分解為H2O 和O，使氧得以維持在基態(tài)狀態(tài)，使食品保鮮，所以CAT 可作為抗氧化劑添加到啤酒、飲料中來清除分子氧、活性氧和自由基[14]，提高啤酒的抗氧化力。另一方面，大麥中所含有的CAT在發(fā)芽階段活性上升，但其僅能承受較低的焙烤溫度，于深色麥芽的加工過程中CAT 酶活已遭受嚴(yán)重?fù)p失[15]。糖化過程中的相關(guān)研究表明，CAT 在56 ℃糖化時酶活性基本喪失，因此并不能消除糖化早期所產(chǎn)生的H2O2，故在糖化過程中CAT的影響可以忽略[16]。

1.3 酚類氧化酶——PPO與POD

在啤酒釀造過程中的酚類氧化酶主要包括多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)。在H2O2或（和）O2存在的條件下，麥汁中的酚類物質(zhì)通過PPO和POD 的催化氧化后具有類似單寧類性質(zhì)（圖2），可以與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而產(chǎn)生混濁[17]，這一方面會減少麥汁中的酚類物質(zhì)和產(chǎn)生老化前驅(qū)物質(zhì)，進(jìn)而減弱麥汁的抗氧化力，另一方面啤酒釀造系統(tǒng)中的活性氧和自由基也會得到清除，從而可以改善啤酒的非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性[18]。

通常認(rèn)為，在啤酒釀造中PPO是麥汁制備過程中對多酚氧化作用的最主要的酶，但Clarkson 等[20]研究可知麥芽中PPO的活性很低，同時由于大麥和麥芽中的POD 具有同功酶多、酶活性和熱穩(wěn)定性強(qiáng)等特征，這使得PPO 氧化多酚的活性遠(yuǎn)低于POD，因此POD 成為麥芽糖化過程中氧化多酚最主要的酶[21-23]。

綜上所述，內(nèi)源性的氧化還原酶在啤酒生產(chǎn)過程中會伴隨著許多的反應(yīng)，會生成許多的老化前驅(qū)物質(zhì)，同時也會使內(nèi)源性還原物質(zhì)含量下降。作為一類促進(jìn)氧化作用的酶，LOX、CAT、POD和PPO會對啤酒的穩(wěn)定性和風(fēng)味產(chǎn)生許多積極或消極作用，特別是對于制麥和糖化等啤酒生產(chǎn)的上游階段，在對酚類物質(zhì)的氧化和生成混濁前體物質(zhì)等方面有著重要的影響。但同時麥芽中的氧化還原酶因?yàn)槠鋸?fù)雜的作用底物和反應(yīng)過程，在各酶系對啤酒釀造的影響方面還存在較大爭議[24]。其中，POD 是一把雙刃劍：一方面，由于POD 具有良好的耐熱性而存在于啤酒釀造的流程中清除活性氧，對由多酚和高分子蛋白質(zhì)聚合造成的渾濁問題具有積極的改善作用；另一方面，POD 在啤酒生產(chǎn)過程中的催化反應(yīng)與多酚的氧化緊密相關(guān)，間接消耗啤酒中的多酚類抗氧化物質(zhì)含量，在某種程度上會導(dǎo)致啤酒抗氧化力的下降，帶來啤酒老化的風(fēng)險。因此，如何合理地控制啤酒釀造過程中POD 的活性，對于減少渾濁前體物質(zhì)、保留內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)、延長啤酒風(fēng)味保鮮期具有重要的意義。

2 POD對啤酒抗氧化力的影響

2.1 POD氧化多酚的作用機(jī)制

POD 是酚類氧化酶中的一個重要構(gòu)成部分。POD廣泛出現(xiàn)于植物中，在植物的生理成長中有著不可或缺的地位，能消除H2O2，同時可以預(yù)防自由基對植物本身造成的傷害，加快木質(zhì)素形成和根的生長[25]，已有研究表明在大麥子粒中檢驗(yàn)出POD的16 種同功酶，綠麥芽中存在20 種，焙燥階段結(jié)束后只剩15 種，不同大麥品種中的POD 同功酶于胚乳和其外層中有著差異，但是POD 在胚中的差別是相對小的[26]。

如圖3 所示，POD 在多酚和H2O2存在的條件下，啟動整個自由基鏈的一系列反應(yīng)。當(dāng)O2進(jìn)入釀造體系后POD 能使多酚被酶促氧化而產(chǎn)生很多醌類，而醌類物質(zhì)可以和蛋白質(zhì)產(chǎn)生凝聚，隔斷蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)而生成沉淀，破壞了膠體的平衡，從而使麥汁的內(nèi)源性抗氧化力下降，最終會對啤酒的非生物穩(wěn)定性有不利影響[27]。與此同時，POD 能顯著去除麥汁中的多酚物質(zhì)，使麥汁的色度減弱，但因此也會導(dǎo)致多酚聚合指數(shù)和老化前驅(qū)物含量(TBZ)的增加，以及抗氧化力的明顯減弱。

糖化階段中POD 在H2O2和O2存在的前提下，會啟動氧化還原底物多酚的反應(yīng)，其作用主要在多酚物質(zhì)的含量和抗氧化力的降低、麥汁過濾速率的下降、濁度和色度明顯增加等方面體現(xiàn)，這主要的原因是多酚被POD 催化氧化后，多分子聚合物會由氧化的產(chǎn)物和戊聚糖交聯(lián)反應(yīng)而形成，從而致使麥汁的抗氧化力下降，因此POD 清除多酚物質(zhì)的效果顯著，且其優(yōu)勢是以吸附的形式取代對多酚物質(zhì)的氧化來達(dá)到消除的目的[29]。

2.2 啤酒釀造中的POD與活性氧

啤酒老化的重要原因是啤酒中活性氧引發(fā)的氧化反應(yīng)。研究表明，分子態(tài)氧沒有十分顯著的反應(yīng)活性，但是在金屬離子存在的情況下，分子態(tài)氧會被激活生成活性氧(O2-，OH-，H2O2，OOH·)，這些活性氧擁有著很高的反應(yīng)活性，從而能引發(fā)一系列復(fù)雜的自由基反應(yīng)使得啤酒的風(fēng)味發(fā)生老化[30]。啤酒生產(chǎn)各階段中會盡可能地縮減酒中氧氣的量，伴隨著啤酒灌裝設(shè)備技術(shù)的進(jìn)步，現(xiàn)在已經(jīng)可以將啤酒瓶中的氧氣含量降到0.1 mg/L 以下，但是現(xiàn)階段活性氧仍然會使啤酒在儲藏過程中發(fā)生老化[31]。

活性氧在啤酒釀造中的主要消耗路徑是在糖化階段中通過POD 催化的氧化反應(yīng)和在煮沸階段時麥汁中多酚的非酶氧化。當(dāng)分子氧存在時，POD能催化多酚的氧化反應(yīng)，使麥汁的還原力降低，但在麥汁糖化時的質(zhì)量和內(nèi)源性抗氧化力等方面所產(chǎn)生的負(fù)面作用不是特別明顯，相反麥汁的質(zhì)量卻有了一定的提升[32]，例如抗氧化活力提高，TBZ 值降低等[33]，這表明POD或許在糖化階段對過氧化物和活性氧自由基有著清除作用，抑制羰基化合物的形成。因此，在糖化階段中限制分子氧的提供，麥汁里存在的POD 能對生成的過氧化物和活性氧自由基進(jìn)行消除，而使麥汁的質(zhì)量和內(nèi)源性抗氧化力得到提升。

同時作為一類效果顯著的抗氧化酶，POD對于消除活性氧有十分明顯的效果，在人體中有著不錯的預(yù)防疾病和保健功能[34]，POD 在影響啤酒的非生物穩(wěn)定性、改善其風(fēng)味、增強(qiáng)啤酒的保健功能等方面同樣具有潛在的應(yīng)用價值。

3 啤酒釀造中過氧化物酶的變化與控制

大麥麥芽作為啤酒的生產(chǎn)原料，其所含有的內(nèi)源性過氧化物酶及多酚類物質(zhì)對啤酒生產(chǎn)過程中的抗氧化力和成品啤酒的質(zhì)量有重要影響，麥芽的原本的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)于制作麥汁過程中的粉碎階段被破壞，給酶促氧化多酚的反應(yīng)提供了水、溫度和氧等一系列有利條件，褐變和聚合反應(yīng)也會由此而發(fā)生，從而麥汁的色澤品質(zhì)和風(fēng)味特征會發(fā)生改變，同時多酚的含量和啤酒的抗氧化力會降低，進(jìn)而影響到啤酒的風(fēng)味和非生物穩(wěn)定性[35]。而在一定條件下，POD 又能有效清除過氧化物和活性氧，從而可提升啤酒的抗氧化力。因此深入研究過氧化物酶，探明其作用機(jī)理，掌握其在啤酒釀造過程中的變化規(guī)律，通過對各方面的影響因素的探究來控制過氧化物酶的影響，進(jìn)而提高啤酒的抗氧化力，對啤酒質(zhì)量的提升會有重要的指導(dǎo)意義。

3.1 釀造過程中的POD和抗氧化力變化

3.1.1 制麥過程

制麥?zhǔn)瞧【漆勗爝^程中內(nèi)源抗氧化力得以提升的重要階段。首先，浸麥階段酚類物質(zhì)含量顯著增加，并隨著麥芽的溶解和破碎而游離并帶入到麥汁中，從而抗氧化力得以提升[36]。而POD 是一類在大麥中少量存在、性質(zhì)相對較為穩(wěn)定的氧化還原酶類，在發(fā)芽期間大麥的POD 活性增長很快，且與α-淀粉酶活力的增加呈同步趨勢[37]。研究表明在制麥過程中，大麥為氧化還原酶的生成、增長和作用提供了有利的內(nèi)部條件，使得POD活力上升，到發(fā)芽結(jié)束后酶的活性增加了5 倍左右，POD活性與根莖長短與制麥損失均展示出十分明顯的正相關(guān)[38]，同時在不同品種大麥中，POD 也有著較大的差異[39]。

3.1.2 糖化過程

從啤酒釀造的整個流程來看，由于麥芽中的POD 活性高、熱穩(wěn)定強(qiáng)，在糖化階段中對多酚物質(zhì)的催化氧化反應(yīng)進(jìn)行得最為強(qiáng)烈，原因是在這階段特別是糖化前期，其具備酶促氧化反應(yīng)所需的酶、底物、水分、溫度和氧等基礎(chǔ)條件[40]。在糖化階段，隨著糖化時間的延長和溫度的上升POD 的酶活也隨之減弱，但由于POD 良好的熱穩(wěn)定性致使其酶活會于糖化整個過程的酸休止、蛋白質(zhì)休止、糖化分解和糖化終結(jié)階段存在，為酶促氧化多酚物質(zhì)提供了有利的前提[41]。同時，糖化階段中進(jìn)入體系中的氧被金屬離子誘導(dǎo)而激活整個反應(yīng)鏈，POD 在H2O2存在的情況下氧化多酚產(chǎn)生老化前驅(qū)物質(zhì)，導(dǎo)致糖化過程中麥汁色度增加，產(chǎn)生沉淀，從而使麥汁的品質(zhì)下降。此外在糖化階段中麥芽的POD 活性會有一定的下降，剩余的POD 在H2O2存在的條件下，會在多酚存在的前提下進(jìn)一步氧化，帶來消極作用[42]。多酚類物質(zhì)含量的下降，減弱了部分麥汁還原力，使得麥汁中的抗氧化力隨之下降，進(jìn)而對成品啤酒的穩(wěn)定性產(chǎn)生不良影響。

3.1.3 煮沸過程

在煮沸階段隨著熱負(fù)荷增加，POD 憑借其良好的耐熱性和穩(wěn)定性，在此階段初期會加速多酚氧化[42]，但隨著煮沸過程的推進(jìn)，POD 活力會得到明顯遏制，研究表明，煮沸階段結(jié)束后POD 的酶活為0[26]。酒花是啤酒中多酚物質(zhì)的主要來源之一，煮沸過程中酒花的加入會明顯提高麥汁的抗氧化力，但麥汁受到熱負(fù)荷不斷增加的影響且發(fā)生的美拉德反應(yīng)使類黑精和多酚反應(yīng)產(chǎn)生高級醇[43]，致使煮沸60 min 后麥汁還原力下降明顯，現(xiàn)有研究表明，經(jīng)測定煮沸過程后麥汁總的抗氧化力并沒有明顯變化[44]。

3.1.4 發(fā)酵過程

啤酒酵母菌株在發(fā)酵過程的影響占主導(dǎo)地位[45]，POD經(jīng)過煮沸階段受過量熱負(fù)荷影響喪失酶活，故POD 對麥汁的影響在此階段可忽略不計。而酵母中含有內(nèi)源性谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px），其主要作用在胞內(nèi)抗脂質(zhì)過氧化作用保護(hù)系統(tǒng)[46]，目前還未發(fā)現(xiàn)酵母中GSH-Px 對啤酒抗氧化力影響的研究報道。在發(fā)酵階段多酚會伴隨麥汁溫度的下降、pH 值的下降和酵母聚集沉淀而析出，但麥汁中還原物質(zhì)的總量并沒有降低，主要因?yàn)槠【平湍冈诖x過程中可生成例如還原型谷胱甘肽（GSH）的代謝產(chǎn)物有著抗氧化的作用[47]。在啤酒發(fā)酵過程中，由酵母代謝到發(fā)酵基質(zhì)中的GSH，能夠清除啤酒中一定量氧自由基的累積，且對于啤酒香氣損失和外觀品質(zhì)變化有預(yù)防作用，使其成為此階段提升啤酒的抗氧化力的主要因素[48]。同時發(fā)酵階段中的酵母接種量、發(fā)酵溫度和貯酒溫度等因素都會影響啤酒的抗氧化力和風(fēng)味穩(wěn)定性[49]。

3.2 釀造過程中POD的控制

新鮮啤酒因其特殊的風(fēng)味，清爽的口感得到廣泛的熱愛，但在儲藏期間成品啤酒都會因啤酒的氧化過程而產(chǎn)生異味，我們通常用“老化味”來形容這些異味[50]。POD 在釀造過程中可以通過與多酚反應(yīng)和清除自由基來影響啤酒的抗氧化力，因此可以通過控制釀造中POD 的活力來提高啤酒的抗氧化力，延長啤酒的貨架期。

在啤酒釀造過程中，溯源影響POD 活性的因素是大麥的品種，此外制麥工藝的不同也會造成POD酶活的差異，控制制麥過程各工藝條件是調(diào)節(jié)氧化還原酶活力最主要的手段，由于POD 活力主要在制麥過程中得以顯著增長，適當(dāng)改變制麥中焙燥階段的工藝可以達(dá)到控制成品麥芽中POD 活力的目的[51]。過氧化物酶在麥芽的焙燥階段會失去一部分酶活，焙焦溫度越高，酶活下降就會越多，因POD 良好的耐熱性，當(dāng)焙焦溫度控制在80 ℃以下時，麥芽的POD 酶活力變化不大，但焙焦麥芽的溫度達(dá)到82 ℃時，POD 的酶活下降迅速，說明焙燥階段中POD 對82 ℃十分敏感，其在82 ℃將會失活，同時考慮其他酶系的影響焙焦溫度選擇在78～82 ℃便可控制過氧化物酶的活力[52]。而CN-、S-、F-、-N3、NH2OH、OH-以及SO32-等對POD 產(chǎn)生可逆性抑制作用；濃酸或H2O2會對POD 產(chǎn)生不可逆性抑制[53]。同時Omidiji 等[54]研究發(fā)現(xiàn)，在高粱發(fā)芽階段中添加NH4Cl、KCl、CaCl2、FeCl3等不同的無機(jī)鹽類，這些鹽類不僅會對發(fā)芽有影響，同時也會對POD也有著或多或少的抑制作用[55]。

4 小結(jié)與展望

大麥和麥芽中的氧化還原酶系可以在啤酒釀造過程中通過催化氧化不飽和脂類和多酚等物質(zhì)來產(chǎn)生羰醛化合物等風(fēng)味老化前驅(qū)物，可使成品啤酒的抗氧化能力減弱，從而對其非生物穩(wěn)定性和風(fēng)味穩(wěn)定性有著重要意義。

POD是一類促氧化劑，與另外的氧化原酶類相比較，各方面的性質(zhì)十分穩(wěn)定，且可以承受較高的焙焦溫度和糖化溫度，其主要的酶活在制麥階段中產(chǎn)生。多酚是麥汁抗氧化物質(zhì)的主要來源之一，在煮沸過程中POD 可利用多酚作為底物發(fā)生氧化，而熱負(fù)荷能使老化前驅(qū)物的生成和麥汁抗氧化力的降低速度加快，在成品啤酒內(nèi)這些老化相關(guān)物質(zhì)會發(fā)生諸多反應(yīng)而進(jìn)一步影響啤酒的風(fēng)味。同時POD 以多酚和H2O2為底物引發(fā)的一系列反應(yīng)，使得膠體平衡破壞，有效降低多酚含量，麥汁抗氧化力減弱，降低麥汁色度，而在限制分子氧的前提下，POD對清除過氧化物和活性氧還有著重要貢獻(xiàn)，從而可提升啤酒的抗氧化力。目前對于POD 的研究多在于其特性和制麥過程中的含量變化，但對于兩種氧化機(jī)制下POD 對啤酒抗氧化力的貢獻(xiàn)度方面研究較少，因此，明確POD 對啤酒抗氧化力的主要作用途徑并通過對POD 的調(diào)控來增強(qiáng)啤酒的抗氧化性能，有利于提高啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性、提升啤酒品質(zhì)、促進(jìn)啤酒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。