UPLC-MS/MS 分析牛肉紅朱橘果皮發(fā)育期類黃酮組分特征

李文云，羅 懌，王小柯，林 乾，韓秀梅，陳永濤，李金強(qiáng)

（貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)科學(xué)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006）

類黃酮是柑橘中重要的多酚類次生代謝物[1-2]，如陳皮中的橙皮苷、柚皮蕓香苷、川陳皮素、橘皮素、5-羥基-6,7,8,3,4′-五甲氧基黃酮和3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮[3]，化州橘紅中的柚皮苷和野漆樹(shù)苷[4]，枳殼中的柚皮苷、新橙皮苷、枳屬苷等[5]，均具有較高的藥用價(jià)值。此類化合物以C6-C3-C6為基本骨架，通過(guò)中央3 碳鏈互相連結(jié)而成，主要包括異黃酮、黃烷酮、黃酮醇、黃酮和花青素等[6]，因其具有較強(qiáng)的抗氧化和清除自由基能力而被廣泛關(guān)注。

研究表明，柑橘類黃酮的生物活性功能可能與其抗氧化作用有密切關(guān)系[7-8]，如甜橙、柑和橘中含量豐富的具有較強(qiáng)抗氧化作用的橙皮苷；柚中含量豐富的柚皮苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、骨質(zhì)疏松癥和風(fēng)濕病等具有顯著療效[9-10]。研究表明，類黃酮主要通過(guò)抑制前列腺素的生物合成、抑制磷酸二酯酶活性、減輕組胺釋放等作用來(lái)發(fā)揮其藥理作用[11-12]。類黃酮對(duì)人體具有重要的生物學(xué)功能，但人體不能直接對(duì)其合成，必須通過(guò)食物才能獲得[13-14]。柑橘是人類膳食中類黃酮的主要來(lái)源之一，所以探究柑橘類黃酮積累特征具有十分重要的意義。

牛肉紅朱橘（CitrusreticulataBlanco.‘Niurouhong’）由朱紅橘（Citrus reticulata Blanco.‘Zhuhongju’）突變而來(lái)，是貴州省惠水縣優(yōu)良的地方品種，其果皮果肉因富含類胡蘿卜素而呈誘人的橘紅色[15-16]。牛肉紅朱橘成熟果實(shí)富含多種抗氧化物質(zhì)[17]，但未見(jiàn)相關(guān)人員對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中主要抗氧化物質(zhì)類黃酮?jiǎng)討B(tài)積累特征進(jìn)行系統(tǒng)分析研究。本研究以貴州地方特色柑橘品種——牛肉紅朱橘為研究對(duì)象，利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）檢測(cè)其果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段果皮中黃酮變化水平、動(dòng)態(tài)積累特征和含量差異，并對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段類黃酮等差異代謝物進(jìn)行篩選，以期為后期類黃酮合成路徑上關(guān)鍵基因發(fā)掘以及功能性食品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

牛肉紅朱橘果實(shí)：采自貴州省惠水縣爛壩林場(chǎng)，于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)行采樣，即花后150 d（N1）、花后180 d（N2）、花后200 d（N3）、花后220 d（N4）、花后240 d（N5）。每次采收30 個(gè)果實(shí)，采完后立即送往實(shí)驗(yàn)室，用蒸餾水清洗干凈，剝離外果皮后用液氮速凍，貯藏于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

甲醇、乙腈和乙酸均為色譜純，購(gòu)于德國(guó)默克公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A 超高效液相色譜，Applied Biosystems 4500 QTRAP 串聯(lián)質(zhì)譜，WatersACQUITYUPLCHSST3C18 色譜柱，DW-86L490超低溫冰箱，LyoLab 3000 冷凍干燥儀。

1.2 方法

1.2.1 類黃酮提取

取冷凍干燥后的果皮樣品研磨至細(xì)碎粉末，準(zhǔn)確稱取100 mg 粉末，溶解于1.0 mL 70%的甲醇溶液中，振蕩混勻后于4 ℃冰箱中過(guò)夜，9 500 r/min 離心10min，移液槍吸取上清液，過(guò)0.22 μm 濾膜后待上樣。

1.2.2 類黃酮檢測(cè)

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。C18 色譜柱，配置ESI 渦輪離子噴霧接口，利用Analyst 1.6.3軟件處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

檢測(cè)方法：UPLC 設(shè)置參照Wang 等[18]的方法，水相為超純水（含0.04%乙酸），有機(jī)相為乙腈（含0.04%乙酸）。流動(dòng)相A 為超純水（含0.04%乙酸），流動(dòng)相B 為乙腈（含0.04%乙酸）。洗脫梯度為：0～11 min，由A∶B=95∶5 勻速線性梯度變化至A∶B=5∶95；11～12 min，A∶B=5∶95；12.1～15 min，A∶B=95∶5。流速為0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL，電噴霧離子源溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V。色譜參數(shù)設(shè)置參照Chen 等[19]進(jìn)行。

定性與定量分析：根據(jù)保留時(shí)間、質(zhì)核比和代謝物數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，利用三重四級(jí)桿的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)代謝物進(jìn)行定量分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)類黃酮原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理后，利用R軟件的偏最小二乘判別分析（Partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）模型繪制熱圖，并計(jì)算變量重要性投影值（Variable importance in project，VIP）。符合VIP≥1 且差異倍數(shù)≥2 或差異倍數(shù)≤0.5的物質(zhì)為差異代謝物。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)類黃酮差異代謝物進(jìn)行注釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉紅朱橘果皮類黃酮組分分析

利用UPLC-MS/MS 檢測(cè)牛肉紅朱橘5 個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的果皮，共得到206 種類黃酮；其中，N1和N2 階段共檢測(cè)到204 種，兩者均未檢測(cè)到矢車菊素-3-O-半乳糖苷和飛燕草素-3-O-乙酰葡萄糖苷；N3 和N5 共檢測(cè)到206 種；N4 檢測(cè)到205 種。檢測(cè)到的物質(zhì)主要包括黃酮、異黃酮、黃酮醇、查耳酮、黃烷酮、花青素等，其中有54 種獲得KEGG 注釋ID。熱圖分析結(jié)果見(jiàn)圖1，從圖1 可以看出，5 個(gè)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段類黃酮含量存在明顯差異，N1 和N2 大部分類黃酮豐度較高，熱圖上表現(xiàn)為紅色，兩者聚在一起；而N3、N4 和N5 類黃酮豐度較接近，大部分類黃酮豐度較N1 和N2 低，在熱圖上表現(xiàn)為綠色，三者距離較。

圖1 不同生長(zhǎng)發(fā)育階段牛肉紅朱橘果皮類黃酮相對(duì)豐度熱圖分析Fig.1 Heat map of flavonoid relative abundance in pericarp of‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

2.2 牛肉紅朱橘果皮類黃酮差異代謝物篩選分析

通過(guò)對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段進(jìn)行比較篩選到的差異物質(zhì)信息見(jiàn)表1。N1 vs N2 篩選到11 個(gè)差異代謝物；N2 vs N3 篩選到的差異代謝物最多，共47 個(gè)代謝物；N3 vs N4 篩選到13 個(gè)代謝物；N4 vs N5 篩選到的差異代謝物最少，僅10 個(gè)。在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期所檢測(cè)到的大部分類黃酮含量隨著果實(shí)逐漸成熟呈下降趨勢(shì)，僅少部分物質(zhì)如根皮素、根皮苷、芹菜素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷等呈上升趨勢(shì)。N2～N3 是類黃酮含量變化的拐點(diǎn)時(shí)期，大部分物質(zhì)如芹菜素、異野漆樹(shù)苷、香葉木苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、5,6,7,4’-四甲氧基黃烷酮等，在N2～N3 表達(dá)豐度急劇下降，隨后變化放緩，N2 vs N3 篩選到的差異物質(zhì)也最多。

表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長(zhǎng)發(fā)育階段差異代謝物信息Table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

N1 vs N2 篩選到的差異物質(zhì)中橙皮素、4′,6-二羥基-5,7-二甲氧基黃烷酮、楊梅素-3-O-β-D-葡萄糖苷等5 個(gè)差異物質(zhì)含量減少，芹菜素-3-O-鼠李糖苷、金合歡素-7-O-蕓香糖苷、香葉木素-7-O-蕓香糖苷等6 個(gè)差異物質(zhì)含量增加。N2 vs N3 篩選到的差異物質(zhì)中芹菜素、金合歡素、李屬異黃酮等39 個(gè)差異物質(zhì)含量減少，柚皮素-7-O-葡萄糖苷、根皮苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷等8 個(gè)差異物質(zhì)含量增加。N3 vs N4 篩選到的差異物質(zhì)中2,4,4′-三羥基查耳酮、5,7,8-三羥基-6-甲氧基黃酮、二氫槲皮素等11 個(gè)差異物質(zhì)含量減少，山柰酚-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和矢車菊素-3-O-半乳糖苷2 個(gè)差異物質(zhì)含量增加。N4 vs N5 中橙皮素和柚皮黃素-3-O-（3-羥基-3-甲基戊二酸）-葡萄糖苷2 個(gè)差異物質(zhì)含量減少，根皮素、芫花素和根皮苷等8 個(gè)差異物質(zhì)含量增加。

續(xù)表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長(zhǎng)發(fā)育階段差異代謝物信息Continue table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

續(xù)表1 牛肉紅朱橘果皮不同生長(zhǎng)發(fā)育階段差異代謝物信息Continue table 1 Information on selected differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits at different development stages

KEGG 注釋分析結(jié)果（圖2）表明，N1 vs N2差異代謝物A 僅富集于類黃酮合成（Flavonoid biosynthesis）通路。N2 vs N3 差異代謝物B 主要富集于異黃酮（Isoflavonoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇（Flavonoid and flavonol biosynthesis）、次生代謝（Bios-ynthesis of secondary metabolites）等7 條通路。N3 vs N4 差異代謝物C 主要富集于黃酮和黃酮醇，以及苯丙烷生物合成（Biosynthesis of phenylpropanoid）等5條通路。N4 vs N5 差異代謝物D 主要富集在類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成和次生代謝生物合成3 條通路。以上4 組比較結(jié)果均涉及類黃酮生物合成通路，所占被注釋代謝物總數(shù)的比例也較高，為37.5%～50%。從注釋結(jié)果還可以看出N2 vs N3 涉及的代謝通路最多，也更為復(fù)雜。

圖2 牛肉紅朱橘果皮差異代謝物KEGG 注釋分類圖Fig.2 KEGG annotation analysis of differential metabolites in pericarp of ‘Niurouhong’mandarin fruits

3 討論與結(jié)論

類黃酮是一類重要的抗氧化物質(zhì)，除了參與植物防御外，在人體健康方面也發(fā)揮著重要作用[20]。類黃酮生物合成來(lái)自于苯丙烷代謝途徑，前體物質(zhì)香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A 在查爾酮合酶（Chalcone synthase, CHS）和查耳酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase,CHI）催化下形成重要中間產(chǎn)物柚皮素，隨后柚皮素和其衍生產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列酶促反應(yīng)，并在葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶、鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶、酰基轉(zhuǎn)移酶、羥基轉(zhuǎn)移酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等修飾下進(jìn)一步糖基化、?；?、羥基化、甲基化形成穩(wěn)態(tài)苷類[21]。與類黃酮苷元相比，類黃酮形成穩(wěn)態(tài)苷類后能夠增加可溶性和穩(wěn)定性，有助于其代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸，且更易為人體吸收和利用[22]。目前在柑橘中已被鑒定出的類黃酮超過(guò)80 種，包括黃酮類、黃烷酮類、黃烷醇類、花青素類等[8]。研究表明，不同類型柑橘類黃酮組成和含量存在較大差異，并表現(xiàn)出一定的種質(zhì)特異性，如柚皮苷、新橙皮苷和枳屬苷等黃烷酮糖苷在柚、葡萄柚、枳等種質(zhì)中特異積累，橙皮苷和柚皮蕓香苷在甜橙、柑、橘和檸檬等種質(zhì)中特異積累[23-24]，多甲氧基類黃酮在寬皮柑橘中的含量較高[25]，黃酮和黃酮醇主要在檸檬和萊檬中積累[26]，花青素主要在血橙中積累[27]。

果實(shí)成熟是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)生理生化性狀的變化，以及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的共同作用[28]。隨著牛肉紅朱橘果實(shí)成熟，外觀和風(fēng)味發(fā)生顯著改變，果皮顏色由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)殚偌t色，口感逐漸變甜，風(fēng)味逐漸濃郁，視覺(jué)、味覺(jué)、嗅覺(jué)、觸覺(jué)等多個(gè)感官品質(zhì)發(fā)生改變。而作為抗氧化評(píng)價(jià)重要指標(biāo)的類黃酮，在果皮成熟過(guò)程中變化趨勢(shì)基本一致，大部分呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。田靜等[29]分析了化州柚發(fā)育時(shí)期柚皮苷含量變化結(jié)果表明，無(wú)論是果皮還是果肉，柚皮苷含量均隨果徑增大呈下降趨勢(shì)，與該研究結(jié)果一致；Chen 等[30]在研究暗柳橙、紅暗柳橙、清家臍橙等黃皮層生長(zhǎng)發(fā)育期蕓香糖苷積累特征時(shí)也得出類似結(jié)果，即柚皮蕓香苷、橙皮苷、香風(fēng)草苷等隨著果實(shí)成熟整體代謝趨勢(shì)降低。

本研究利用代謝組學(xué)原理和方法對(duì)果皮發(fā)育期（花后150～240 d）類黃酮代謝規(guī)律進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：成熟度對(duì)類黃酮組分和含量具有較大的影響。N1 vs N2 差異代謝物僅富集于類黃酮生物合成途徑；而在N2～N3 期（花后180～200 d）類黃酮表達(dá)豐度急劇下降。隨著果皮顏色由綠逐漸轉(zhuǎn)為黃綠相間，再到成熟時(shí)期的橘紅色，越來(lái)越多的差異代謝通路如黃酮、黃酮醇、次生代謝等被篩選到。本研究結(jié)果反映了牛肉紅朱橘果皮生長(zhǎng)發(fā)育期類黃酮代謝物變化規(guī)律以及相關(guān)生物過(guò)程的協(xié)同性和復(fù)雜性。而參與這些生物過(guò)程的關(guān)鍵基因除了可能與類黃酮合成途徑上下游的黃酮合成酶（CHS、CHI、FNS）、類黃酮-3′-羥化酶（Flavo-noids-3′-hydroxylase，F(xiàn)3′H）、鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶（Rhamnosyltransferase，Rhat）、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（Glucosyltransferase，Glct）等結(jié)構(gòu)基因具有密切關(guān)系外，可能還受調(diào)節(jié)基因的單獨(dú)或協(xié)同調(diào)控[31]。但具體是哪些基因在牛肉紅朱橘類黃酮代謝過(guò)程中起關(guān)鍵作用，還有待后期從代謝調(diào)控、關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因著手進(jìn)行深入挖掘和探索。