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    酒花內(nèi)生菌Pseudomonas oryzihabitans F0-1轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的研究

    2022-01-07 02:25:18廉長(zhǎng)盛付冬梅張俊鵬張逸凡薛兆茹
    保鮮與加工 2021年12期
    關(guān)鍵詞:酒花生物轉(zhuǎn)化內(nèi)生

    廉長(zhǎng)盛,付冬梅,張俊鵬,張逸凡,薛兆茹,王 越

    (大連工業(yè)大學(xué)生物催化技術(shù)國(guó)家與地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,遼寧 大連 116034)

    檸檬烯又名苧烯,是一種重要的功能性單萜,已被發(fā)現(xiàn)存在于300 多種植物中。檸檬烯是柑橘類水果加工的副產(chǎn)物,在橙皮精油中含量高達(dá)90%~95%。因其價(jià)廉易得,且化學(xué)性質(zhì)活潑,被用作合成萜烯衍生物的前體,這些衍生物在食品、醫(yī)藥和精細(xì)化工行業(yè)中應(yīng)用廣泛[1-2]。

    檸檬烯可以轉(zhuǎn)化為含氧單萜化合物,相比于萜烯類化合物,含氧單萜具有更強(qiáng)的香氣,且自然資源中含量少。如α-萜品醇,它是一種單萜類化合物,其在香料行業(yè)中的商業(yè)價(jià)值較高,消耗量約為每年9.2 t。α-萜品醇具有紫丁香的花香氣味,在香水、化妝品和洗漱用品中通常用作香料[3-4]。由于其抗菌和抗氧化特性,在制藥工業(yè)中也被用作抗真菌劑和消毒劑產(chǎn)品[3,5-6],并在食品工業(yè)中用作防腐劑,可用于調(diào)配檸檬、甜橙、桃子、柑橘等食用香精[7-9]。

    研究發(fā)現(xiàn),真菌和細(xì)菌能在有氧條件下對(duì)檸檬烯進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。Tai 等[10]利用Penicillium sp 轉(zhuǎn)化檸檬烯,產(chǎn)物主要是α-萜品醇和少量的香芹酮和香芹醇;Rottava 等[11]從400 種微生物中篩選出能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的黑曲霉;Bicas 等[12]通過熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens 轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇。相比化學(xué)合成,微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)因操作簡(jiǎn)單、條件溫和、高效率和高選擇性、無毒、對(duì)環(huán)境友好,顯示出廣闊的基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用前景[13]。目前天然來源的化合物比化學(xué)合成的化合物具有更高的市場(chǎng)價(jià)值,因此,通過生物轉(zhuǎn)化獲得天然香料具有很高的市場(chǎng)研發(fā)價(jià)值[14-15]。

    啤酒花是大麻科葎草屬多年生攀援草本植物,是一種重要的香料和藥用植物[16-18],其揮發(fā)成分酒花油中含有70%的萜烯化合物,包括單體萜烯如α-蒎烯和香葉烯,倍半萜烯如β-石竹烯和α-葎草烯等[19]。而酒花內(nèi)生菌長(zhǎng)期伴隨植物生長(zhǎng),參與宿主的生長(zhǎng)代謝,很可能會(huì)具備與宿主植株相似次生代謝的潛能[20-21]。因此,開發(fā)植物內(nèi)生菌資源,將會(huì)為天然產(chǎn)物的合成提供新方案。本研究從酒花內(nèi)生菌入手,篩選具有檸檬烯轉(zhuǎn)化潛力的菌種,進(jìn)行生理生化和分子鑒定,并優(yōu)化生物轉(zhuǎn)化條件,以提高酒花內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化檸檬烯的轉(zhuǎn)化率。

    1 材料與方法

    1.1 材料與設(shè)備

    1.1.1 材料與試劑

    野生新鮮酒花雌花果,摘自河北省秦皇島;α-萜品醇標(biāo)準(zhǔn)品(>99%),內(nèi)標(biāo)物萜品烯-4-醇(>99%),阿拉丁試劑有限公司;檸檬烯(>95%),北京百靈威科技有限公司;次氯酸鈉,乙酸乙酯(≥95%),乙醇(≥95%),甲醇(≥95%)和甘油(≥95%),科密歐化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉、胰蛋白胨、大豆粉和植物蛋白胨,北京奧博星生物技術(shù)有限公司;NaCl、K2HPO4等分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠;甘露醇,沈陽(yáng)市試劑二廠。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1.1.2.1 分離培養(yǎng)基

    水瓊脂培養(yǎng)基(WA):瓊脂粉18 g/L,pH 7.2±0.2。

    酵母提取物瓊脂培養(yǎng)基(TWYE):酵母提取物0.25 g/L,K2HPO40.5 g/L,瓊脂粉18 g/L,pH 7.2±0.2。

    甘露醇大豆瓊脂培養(yǎng)基(MS):甘露醇20 g/L,大豆粉20 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH 7.2±0.2。

    大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA):胰蛋白胨15 g/L,植物蛋白胨5 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂粉15 g/L,pH 7.3±0.2。

    1.1.2.2 復(fù)篩培養(yǎng)基

    甲醇0.1 g/L,(R)-(+)-檸檬烯4.5 g/L,NaNO33.0 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO40.5 g/L,KCl 0.5 g/L,F(xiàn)eSO40.01 g/L和瓊脂20 g/L。

    1.1.2.3 LB 培養(yǎng)基

    胰蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,酵母提取物5 g/L。

    1.1.2.4 細(xì)菌基本培養(yǎng)基

    葡萄糖5 g/L,(NH4)2SO42 g/L,檸檬酸鈉1 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,K2HPO44 g/L,KH2PO46 g/L。

    1.1.2.5 營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(NA)

    牛肉膏3 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L。

    1.1.3 儀器與設(shè)備

    GC9790Plus 氣相色譜儀,浙江福立分析儀器股份有限公司;7890A/5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,配EI 離子源,美國(guó)Agilent 公司;DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱,中科院大連化物所;SPME 專用磁力加熱攪拌器,SPME-GC PK 1 固相微萃取手柄,北京康林科技有限責(zé)任公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS(二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷)萃取頭,美國(guó)Supelco 公司;ZQZY78CNT 型振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 菌種的篩選及鑒定

    1.2.1.1 菌種的篩選

    先將新鮮酒花用流水沖洗,晾干,分別剪成根、莖、葉、花等部分。用75%酒精浸泡3 min,無菌水沖洗3次;用10%次氯酸鈉浸泡5 min,無菌水沖洗3 次。在無菌條件下,分別將消毒處理的酒花花莖、花軸、苞葉和花朵(包含蛇麻腺)部位切成1 cm×1 cm 的小塊,均勻置于分離培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)。

    將4 種分離培養(yǎng)基分離獲得的菌株轉(zhuǎn)接至LB瓊脂培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,劃線純化菌株。采用感官評(píng)定法對(duì)產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行聞香篩選。

    將菌株經(jīng)過液體LB 培養(yǎng)基活化,按照5%接種量接入到復(fù)篩培養(yǎng)基中(250 mL 具塞磨口瓶),30 ℃,200 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化72 h,利用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜連用(SPME-GC-MS)檢測(cè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

    1.2.1.2 菌種的鑒定

    形態(tài)學(xué)特征初步鑒定:對(duì)菌落形態(tài)特征、顏色、大小、革蘭氏染色等進(jìn)行觀察。生理生化試驗(yàn)鑒定參照文獻(xiàn)[22]。

    分子生物學(xué)鑒定:提取篩選菌株的DNA 進(jìn)行16S rDNA PCR 擴(kuò)增。利用16S rDNA 的1492R 和27F通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。測(cè)序由吉林省庫(kù)美生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)中進(jìn)行基本局部比對(duì),采用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    1.2.2 萜烯物質(zhì)SPME-GC-MS 分析方法

    固相萃取條件:將發(fā)酵液在4 ℃,8 000 r/min 條件下離心10 min,吸取5 mL 上清液移入固相萃取樣品瓶中。加入2 g NaCl 促進(jìn)樣品揮發(fā),將樣品瓶放在固相萃取儀上,溫度60 ℃,轉(zhuǎn)速160 r/min。推出SPME 萃取頭的纖維,吸附30 min 后,插入GC 進(jìn)樣口解析5 min。

    氣相色譜條件:色譜柱為DB-FFAP 毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.5 μm),載氣為氮?dú)猓簧郎爻绦驗(yàn)椋褐鯗?5 ℃,保持1 min,以5 ℃/min 升溫至120 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min 升溫至250 ℃,保持10 min。分流比為5∶1。

    質(zhì)譜條件:離子源溫度220 ℃,電離方式EI,電子能量70 eV,掃描范圍(m/z)100~420。

    定量分析:采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量,α-萜品醇標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:

    y=0.635 6x+0.201 2,R2=0.997 4

    式中:x 為α-萜品醇與內(nèi)標(biāo)濃度比;y 為α-萜品醇與內(nèi)標(biāo)面積比。

    1.2.3 生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間的篩選

    為了考察細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)Pseudomonasoryzihabitans F0-1 菌株在不同生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響,將菌株分別接種到NA 培養(yǎng)基和細(xì)菌基本培養(yǎng)基中,定時(shí)測(cè)定菌液在波長(zhǎng)為600 nm 下的光密度值,以O(shè)D 值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo),繪制菌株在NA 和細(xì)菌基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。

    根據(jù)測(cè)得的生長(zhǎng)曲線,在30 ℃,200 r/min 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)生菌F0-1,分別在各生長(zhǎng)時(shí)期加入檸檬烯,定時(shí)取樣。按照“1.2.2”中的方法檢測(cè)α-萜品醇濃度,考察不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)內(nèi)生菌F0-1轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響。

    1.2.4 共溶劑種類的篩選

    為考察共溶劑對(duì)F0-1 菌生物轉(zhuǎn)化的影響,分別配制20%的(R)-(+)-檸檬烯/共溶劑混合溶液。將混合溶液添加到在NA 培養(yǎng)基中培養(yǎng)38 h 的F0-1 菌液內(nèi),培養(yǎng)條件為30 ℃,200 r/min,共溶劑分別為乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甘油。轉(zhuǎn)化12 h,檢測(cè)α-萜品醇濃度,對(duì)照為不加共溶劑。

    1.2.5 底物濃度的篩選

    為了考察F0-1 轉(zhuǎn)化檸檬烯的最適濃度,將F0-1菌培養(yǎng)24 h 后,分別加入440、880、1 760、3 520 mg/L R-(+)-檸檬烯,生物轉(zhuǎn)化12 h 后,測(cè)定α-萜品醇濃度,篩選適宜的底物濃度。

    1.2.6 轉(zhuǎn)化條件的篩選

    1.2.6.1 轉(zhuǎn)化溫度

    為考察溫度對(duì)F0-1 轉(zhuǎn)化的影響,采用不同轉(zhuǎn)化溫度(10、20、30、40 ℃),菌種在200 r/min 預(yù)培養(yǎng)38 h后,加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液,轉(zhuǎn)化12 h 后,檢測(cè)α-萜品醇濃度,篩選適宜的轉(zhuǎn)化溫度。

    1.2.6.2 pH

    為考察轉(zhuǎn)化體系中pH 值對(duì)F0-1 轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇的影響,用0.05 mol/L 的檸檬酸磷酸緩沖液調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基pH 為3.0~8.0。菌種在30 ℃,200 r/min 預(yù)培養(yǎng)38 h 后,加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液,轉(zhuǎn)化12 h 后,檢測(cè)α-萜品醇濃度,篩選適宜的pH。

    1.2.6.3 轉(zhuǎn)速

    為考察轉(zhuǎn)速對(duì)生物轉(zhuǎn)化的影響,將F0-1 菌種在30 ℃,200 r/min,pH 6.0 條件下預(yù)培養(yǎng)38 h 后,加入20%的(R)-(+)-檸檬烯/乙醇混合溶液。分別采用0、100、200、300 r/min 進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化12 h 后,檢測(cè)α-萜品醇濃度,確定最佳的轉(zhuǎn)速。

    1.2.7 數(shù)據(jù)處理

    使用Execl 軟件處理數(shù)據(jù),使用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菌種的篩選及鑒定

    2.1.1 酒花內(nèi)生菌的篩選

    將消毒處理過的酒花的花莖、花軸、苞葉和花朵(包含蛇麻腺)部位分別在4 種分離培養(yǎng)基(WA、TWYE、MS、TSA)中恒溫培養(yǎng),共分離出22 株產(chǎn)香內(nèi)生細(xì)菌,其中通過WA 培養(yǎng)基分離出2 株細(xì)菌;通過TWYE 培養(yǎng)基分離出14 株細(xì)菌;通過MS 培養(yǎng)基分離出6 株細(xì)菌;通過TSA 培養(yǎng)基沒有分離出微生物。

    經(jīng)過復(fù)篩培養(yǎng)基篩選和SPME-GC-MS 分析,F(xiàn)0-1和F0-2 兩株菌均可以轉(zhuǎn)化檸檬烯生成含氧單萜化合物。菌種F0-1 能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成香芹酮、香芹醇和α-萜品醇,生成的α-萜品醇濃度為(9.24±1.67)mg/L。菌種F0-2 能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成香芹酮和α-萜品醇,生成的α-萜品醇濃度為(2.04±1.11)mg/L。兩種菌都能轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇,且F0-1 菌生成的α-萜品醇濃度是F0-2 菌的4.5 倍,因此選定F0-1 為轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇的菌株,并對(duì)F0-1 進(jìn)行菌種鑒定。

    2.1.2 內(nèi)生菌F0-1 菌種的鑒定

    細(xì)菌在LB 培養(yǎng)基37 ℃下培養(yǎng)24 h 后觀察菌落的形態(tài),可以看到菌落黃色,圓形,凸起,干燥皺起,邊緣整齊。顯微鏡下觀察革蘭氏染色結(jié)果為陰性,F(xiàn)0-1菌生理生化結(jié)果見表1,系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

    表1 F0-1 菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of F0-1 strain

    圖1 內(nèi)生菌F0-1 的16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rDNA system development tree of F0-1 bacteria strain

    F0-1 與NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性菌的16S rRNA 基因序列比對(duì),與Pseudomonas oryzihabitans 相似性達(dá)99.99%。結(jié)合菌株F0-1 的生理生化結(jié)果、菌落形態(tài)特征及16S rDNA 分析,鑒定菌株F0-1 為棲稻假單胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)。

    2.2 不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

    培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分和濃度對(duì)微生物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇有不同影響[23]。由圖2 可知,F(xiàn)0-1 在細(xì)菌基本培養(yǎng)基中進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期的時(shí)間分別是6 h、22 h 和46 h;在NA 培養(yǎng)基中F0-1 的生長(zhǎng)周期更短一些,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期的時(shí)間分別是2 h、10 h 和38 h。

    圖2 F0-1 菌在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curves of F0-1 bacteria strain in two culture media

    由圖3 可見,兩種培養(yǎng)基都是在衰亡期合成α-萜品醇濃度高于對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期,且NA 培養(yǎng)基產(chǎn)量更高,在衰亡期轉(zhuǎn)化12 h 合成α-萜品醇最高,為38.7 mg/L;細(xì)菌基本培養(yǎng)基中的最高產(chǎn)量在衰亡期轉(zhuǎn)化24 h 處獲得,為28.6 mg/L。臺(tái)亞楠[24]在優(yōu)化指狀青霉DSM 62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯條件時(shí),發(fā)現(xiàn)對(duì)數(shù)期添加檸檬烯能獲得最大產(chǎn)量。菌種不同,最適底物添加時(shí)期也不同,細(xì)菌Pseudomonas gladioli 和指狀青霉不同,其最適底物添加時(shí)期為對(duì)數(shù)晚期至穩(wěn)定期,此時(shí)的菌量較高[25]。而F0-1 菌衰亡期α-萜品醇生成量高的原因可能是由于這時(shí)體系中碳源消耗過大,此時(shí)添加檸檬烯作為新的碳源,被菌種利用。也可能是細(xì)胞衰亡裂解,胞內(nèi)的酶更容易和底物接觸。對(duì)比兩種培養(yǎng)基,NA 培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化量較高,且最高轉(zhuǎn)化量在添加底物后的12 h,轉(zhuǎn)化時(shí)間短,效率高。因此,最優(yōu)條件為將F0-1 菌接種到NA 培養(yǎng)基中,在衰亡期(培養(yǎng)38 h)添加檸檬烯,轉(zhuǎn)化12 h。

    圖3 不同生長(zhǎng)時(shí)期及轉(zhuǎn)化時(shí)間對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different growth stages and conversion time on the α-terpineol production

    2.3 共溶劑種類對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的影響

    檸檬烯難溶于水相,溶解度僅為0.015 mmol/L,化學(xué)穩(wěn)定性差,易發(fā)生自動(dòng)氧化[26]。用共溶劑可以增加檸檬烯的溶解度,從而提高產(chǎn)物濃度[27]。由圖4 可知,共溶劑促進(jìn)作用從大到小依次為乙醇>甲醇>乙酸乙酯>甘油。添加乙醇為共溶劑,α-萜品醇濃度比對(duì)照組提高48.5%,極性有機(jī)溶劑可以提高檸檬烯等萜烯物質(zhì)的溶解度,在生物轉(zhuǎn)化中形成單向系統(tǒng),加快反應(yīng)速度,一般會(huì)促進(jìn)產(chǎn)物生成[28]。因此甲醇和乙醇對(duì)生物轉(zhuǎn)化均有促進(jìn)作用;與空白對(duì)照相比,甘油使α-萜品醇濃度降低3.14 mg/L,在4 種共溶劑中,甘油對(duì)F0-1 的生物轉(zhuǎn)化影響并不顯著。非極性有機(jī)溶劑乙酸乙酯對(duì)生物轉(zhuǎn)化也有一定的促進(jìn)作用,α-萜品醇濃度提高了9.1%??紤]到乙醇價(jià)格低,可用于食品添加劑的萃取,且對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用明顯,因此選擇乙醇作為生物轉(zhuǎn)化的共溶劑。

    圖4 共溶劑對(duì)檸檬烯生物轉(zhuǎn)化的影響Fig.4 Effects of cosolvent on biotransformation of limonene

    2.4 底物濃度對(duì)萜品醇產(chǎn)量的影響

    研究表明,高濃度的萜烯物質(zhì)對(duì)微生物細(xì)胞有毒害作用[29],這也是微生物轉(zhuǎn)化單萜生成含氧衍生物的難點(diǎn)之一,單萜濃度過高會(huì)影響微生物轉(zhuǎn)化能力并抑制微生物的生長(zhǎng)[28]。由圖5 可知,檸檬烯轉(zhuǎn)化的最適濃度為880 mg/L,當(dāng)高于880 mg/L 時(shí),產(chǎn)量下降。Gloria等[23]用指狀青霉DSM62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯時(shí),當(dāng)檸檬烯濃度過高時(shí)會(huì)影響轉(zhuǎn)化的選擇性,生成其他含氧衍生物。因此,選擇880 mg/L 的檸檬烯作為F0-1 轉(zhuǎn)化的最適濃度。

    圖5 檸檬烯濃度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of limonene concentrations on the α-terpineol production

    2.5 轉(zhuǎn)化條件對(duì)α-萜品醇合成的影響

    2.5.1 溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

    檸檬烯生物轉(zhuǎn)化效率與溫度相關(guān)[25]。由圖6 可知,培養(yǎng)溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量有較大的影響,30 ℃時(shí)產(chǎn)量最高。從10~30 ℃,轉(zhuǎn)化量逐漸上升,轉(zhuǎn)化溫度40 ℃時(shí)產(chǎn)量大幅下降,可能是高溫影響了轉(zhuǎn)化酶活力,并且高溫也不適合微生物生長(zhǎng)。

    圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of culture temperatures on the α-terpineol production

    2.5.2 pH 對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

    由于在pH 為3.0 和4.0 時(shí),F(xiàn)0-1 菌無法生長(zhǎng),故不在圖7 中體現(xiàn)。由圖7 可見,pH 為6.0 時(shí)α-萜品醇產(chǎn)量最高。當(dāng)pH 大于7.0 時(shí),α-萜品醇濃度下降。有研究報(bào)道,pH 大于3.5 時(shí),檸檬烯產(chǎn)生分子內(nèi)重排,通過不同碳原子的羥基化反應(yīng)、異構(gòu)化反應(yīng)、氧化反應(yīng)和斷裂循環(huán),促進(jìn)了檸檬烯含氧化合物的形成[23]。pH 大于7.0 時(shí),α-萜品醇濃度降低,原因可能是堿性條件下的α-萜品醇性質(zhì)不穩(wěn)定。Bicas 等[30]報(bào)道尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum 152b 在pH 5.2~8.2 之間生物轉(zhuǎn)化檸檬烯生成α-萜品醇;Gloria 等[23]報(bào)道指狀青霉Penicillium digitatum DSM 62840 轉(zhuǎn)化檸檬烯的最適pH 為3.5,此pH 下α-萜品醇產(chǎn)量最大。Tan 等[31]的研究也發(fā)現(xiàn)Penicillium digitatum NRRL 1202 在酸性環(huán)境下更利于生物轉(zhuǎn)化,在pH 4.0 時(shí)產(chǎn)量最高。與這些真菌略有不同,P.oryzihabitans F0-1 在pH 小于5 時(shí)無法轉(zhuǎn)化,在6.0~7.0 的微酸性反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化檸檬烯合成α-萜品醇的產(chǎn)量最高。

    圖7 體系pH 對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量影響Fig.7 Effects of system pH values on the α-terpineol production

    2.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)α-萜品醇產(chǎn)量的影響

    萜烯生物轉(zhuǎn)化為含氧衍生物是需氧的[32],溶氧量對(duì)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化量影響較大,振蕩培養(yǎng)可以提高體系的溶氧量[33]。在假絲酵母Candida maltosa 生物轉(zhuǎn)化過程中,其關(guān)鍵酶NADPH-cytochrome P-450 和cytochrome P-450 單加氧酶在60 r/min 時(shí)的轉(zhuǎn)化效率更高[34]。圖8 顯示在轉(zhuǎn)速為200 r/min 時(shí),α-萜品醇的產(chǎn)量最高,達(dá)到97.54 mg/L,當(dāng)體系靜止或處于過高轉(zhuǎn)速時(shí)都不利于生成產(chǎn)物,因此選用中等轉(zhuǎn)速200 r/min 作為生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)條件。

    圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)α-萜品醇合成的影響Fig.8 Effects of rotational speeds on the α-terpineol production

    3 結(jié)論

    從新鮮酒花中篩選出能轉(zhuǎn)化(R)-(+)-檸檬烯合成α-萜品醇的內(nèi)生菌F0-1。對(duì)該菌株進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定,為棲稻假單胞菌Pseudomonas oryzihabitans。并對(duì)F0-1 菌生物轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了優(yōu)化,F(xiàn)0-1 菌在30 ℃,體系pH 為6.0,轉(zhuǎn)速200 r/min的NA 培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)38 h,添加20%的檸檬烯/乙醇溶液,檸檬烯濃度為880 mg/L,轉(zhuǎn)化12 h,得到的α-萜品醇濃度為(97.54±3.34)mg/L,是最初轉(zhuǎn)化結(jié)果(9.24±1.67)mg/L 的10.6 倍。

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