EX20+30Y 試劑盒的建立及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用

周旭明，高登星，李發(fā)院

1.上饒公安司法鑒定中心，江西 上饒 334000；2.新余公安司法鑒定中心，江西 新余 338000；3.無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫214174

STR 分型是目前法醫(yī)遺傳學(xué)中的核心分型技術(shù)[1]，常染色體STR 分型在個(gè)體識(shí)別和親子關(guān)系鑒定方面發(fā)揮著重要作用，Y 染色體STR（Y-STR）主要應(yīng)用于父系親緣鑒定。在一些重特大刑事案件偵察過(guò)程中，往往對(duì)現(xiàn)場(chǎng)提取的物證先進(jìn)行常染色體STR 檢測(cè)，確認(rèn)犯罪嫌疑人為男性時(shí)，加做Y-STR 檢測(cè)以獲得更多遺傳信息，為案件辦理增加偵查線(xiàn)索。這種常規(guī)的檢測(cè)程序一方面檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)可能會(huì)延誤抓獲犯罪嫌疑人的最佳時(shí)機(jī)，另一方面犯罪嫌疑人遺留在現(xiàn)場(chǎng)物證量微，多次檢測(cè)可能增加檢測(cè)失敗的概率[2-5]。為了克服這些局限性，本研究擬開(kāi)發(fā)19 個(gè)常染色體、30 個(gè)Y-STR 基因座以及性別基因座的六色熒光檢測(cè)試劑盒（簡(jiǎn)稱(chēng)EX20+30Y 試劑盒），將原來(lái)的2 次檢測(cè)變?yōu)? 次檢測(cè)，即可獲得用于身份認(rèn)定的常染色體STR 基因座信息，也可獲得用于家系排查的Y-STR 基因座信息。

1 材料與方法

1.1 樣本

血卡樣本以及案件樣本來(lái)源于上饒公安司法鑒定中心，包括：法庭科學(xué)DNA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的無(wú)關(guān)個(gè)體血樣210 份；日常檢案樣品69 份，其中血斑23 份、唾液斑17 份、煙蒂19 份、指紋接觸擦拭物4 份、精斑6 份。標(biāo)準(zhǔn)品9948（男性）、標(biāo)準(zhǔn)品9947A（女性）來(lái)自無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，將標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋至1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng/μL；黑猩猩（廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所提供），貓、狗、豬、牛、羊、雞血液樣品（上海生物制品研究所提供），大腸桿菌（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司提供）通過(guò)磁珠法提取得到樣品DNA。

1.2 主要儀器與試劑

3730xl基因分析儀、3500xL 基因分析儀、9700 型PCR 儀（美國(guó)Applied Biosystems 公司），BSD600-DUET打孔儀（澳大利亞BSD Robotics 公司），Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)20A［基點(diǎn)認(rèn)知技術(shù)（北京）有限公司］，YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反應(yīng)緩沖液［含2.5 mmol/L Mg2+、0.25 mmol/L dNTP、50 mmol/L Tris 鹽酸鹽，pH值8.3、50 mmol/L KCl、10 mmol/L 甜菜堿，1.2 mmol/L 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉液和6% 甘油］、熱啟動(dòng)C-Taq酶及內(nèi)標(biāo)AGCU Marker SIZ-700 均來(lái)自無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司。樣品載體包括血樣采集卡（加強(qiáng)型）、血樣采集卡（經(jīng)典型）、血樣采集卡（迷你型）（長(zhǎng)春市博坤生物科技有限公司），Whatman FTA 標(biāo)準(zhǔn)卡、903 卡（英國(guó)Whatman 公司），DNA 血樣采集卡（北京達(dá)博創(chuàng)新科技開(kāi)發(fā)有限公司），普通濾紙型血卡。去離子甲酰胺（美國(guó)Applied Biosystems 公司）。

1.3 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

1.3.1 基因座的選擇

選擇目前應(yīng)用最為廣泛的Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)20A 全部19 個(gè)常染色體STR 基因座加性別基因座、YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒全部27 個(gè)YSTR 基因座、DYS596及DYS527a/b，共30 個(gè)Y-STR 基因座（表1）。

表1 EX20+30Y 試劑盒中19 個(gè)常染色體和30 個(gè)Y-STR 基因座位點(diǎn)信息Tab.1 Site information of 19 autosome and 30 Y-STR loci in EX20+30Y Kit

續(xù)表1Continued Tab.1

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)引物體系的靈敏度、均衡性、擴(kuò)增效率、適用性等要求，試劑盒采用六色熒光（圖1）。為達(dá)到試劑盒1 次PCR 反應(yīng)可以檢測(cè)50 個(gè)DNA 位點(diǎn)的目的，將試劑盒的內(nèi)標(biāo)片段長(zhǎng)度提升至700 bp，內(nèi)標(biāo)排布在試劑盒的第6 組，采用SIZ（橙色熒光）標(biāo)記（圖1）。

圖1 EX20+30Y 試劑盒基因座位置分布Fig.1 Loci distribution in EX20+30Y Kit

1.3.3 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化

為保證復(fù)合擴(kuò)增體系的效能與特異性，引物體系以單位點(diǎn)擴(kuò)增、單色通道復(fù)合、全部引物混合擴(kuò)增為原則，反復(fù)驗(yàn)證測(cè)試，最終確定引物復(fù)合擴(kuò)增體系。根據(jù)表1 引物濃度組配復(fù)合擴(kuò)增引物體系。

25 μL 體系：10 μL 反應(yīng)緩沖液，1 μL 5 U/μL 熱啟動(dòng)C-Taq酶，5 μL 5×引物復(fù)合物，0.5～2 ng 樣本DNA，用雙蒸水補(bǔ)足至25 μL。

使用9700 型PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，熱循環(huán)條件：95 ℃2 min；94 ℃30 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min，15 個(gè)循環(huán)；90 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，15 個(gè)循環(huán)；60 ℃ 20 min。

1.3.4 STR 分型

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500xL 型基因分析儀電泳，得到STR 基因座的等位基因型。電泳條件：取1 μL PCR 產(chǎn)物或等位基因階梯與0.5 μL AGCU Marker SIZ-700和12 μL 去離子甲酰胺混合，95 ℃變性3 min 后，冰浴3 min，電泳檢測(cè)，使用GeneMapper?IDv3.2 軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）進(jìn)行基因分型。

1.4 復(fù)合擴(kuò)增體系的性能及應(yīng)用評(píng)價(jià)

1.4.1 靈敏度檢測(cè)

取標(biāo)準(zhǔn)品9948，每25 μL 擴(kuò)增體系分別以1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng 的模板量，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和DNA 分型檢測(cè)，每種濃度進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 混合樣本檢測(cè)

取標(biāo)準(zhǔn)品9948 和標(biāo)準(zhǔn)品9947A，模板總量為1 ng，分別按1∶1、1∶4、1∶9、1∶19 的體積比混合，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和STR 分型檢測(cè)，每種混合比進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 種屬特異性檢測(cè)

分別取1 μL 0.5 ng/μL人、黑猩猩DNA樣本，10 ng/μL 貓、狗、豬、牛、養(yǎng)、雞DNA 樣本和10 ng 大腸桿菌進(jìn)行物種特異性研究，每種樣本進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)試劑盒Ladder 進(jìn)行分析研究，按儀器使用手冊(cè)上設(shè)置cutoff 閾值175 RFU。

1.4.4 不同直接擴(kuò)增檢材適用性檢測(cè)

對(duì)于同一個(gè)體的血液，采用不同類(lèi)型的血卡［血樣采集卡（加強(qiáng)型）、血樣采集卡（經(jīng)典型）、血樣采集卡（迷你型）、Whatman FTA 標(biāo)準(zhǔn)卡、903 卡、DNA 血樣采集卡、普通濾紙型血卡］保存，通過(guò)試劑盒直接擴(kuò)增后進(jìn)行適用性測(cè)試。

1.4.5 案件生物檢材適用性檢測(cè)

日常檢案樣本69 份，采用磁珠法提取，采用EX20+30Y試劑盒、Goldeneye?DNA身份鑒定系統(tǒng)20A、YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和STR 分型。

1.4.6 抗抑制劑能力測(cè)試

采用常見(jiàn)抑制劑血紅素、血紅蛋白、腐殖酸、靛藍(lán)、鈣離子（Ca2+）和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）進(jìn)行抗抑制劑能力測(cè)試。均以0.5 ng 標(biāo)準(zhǔn)品9948 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，抑制劑濃度分別為：血紅素20、50、80、100 和150 μmol/L；血紅蛋白50、80、100、150 和200 μmol/L；腐殖酸20、50、80、100和150 ng/μL；靛藍(lán)4、5、8、10 和12 mmol/L；Ca2+0.1、0.2、0.5、0.7 和1.0 mmol/L；EDTA 0.1、0.5、0.8、1.0 和1.2 mmol/L。

1.4.7 重復(fù)性測(cè)試

對(duì)相同DNA 樣本分別在Applied BiosystemsTM3730xl基因分析儀和3500xL 基因分析儀中進(jìn)行分型檢測(cè)。擴(kuò)增采用25 μL 體系，每組分別擴(kuò)增10 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品9947A、標(biāo)準(zhǔn)品9948。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度

標(biāo)準(zhǔn)品9948 以1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng 為模板量進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，當(dāng)DNA 模板量大于或等于0.125 ng 時(shí)，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中DNA 圖譜分型完整，分型結(jié)果準(zhǔn)確清晰，均未有DNA 位點(diǎn)丟失的情況發(fā)生；當(dāng)模板量為0.062 5 ng 時(shí)，3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均未獲得完整分型，存在DYS533、DYF387S1a/b、DYS449等基因座丟失的情況。

2.2 混合樣本檢測(cè)結(jié)果

表2 顯示，V9948∶V9947A在1∶1 和1∶4 混合的情況下，標(biāo)準(zhǔn)品9948 的Y-STR 基因座全部檢出。隨著混合樣本中標(biāo)準(zhǔn)品9947A模板含量的提高，當(dāng)V9948∶V9947A為1∶9時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品9948含量為0.1 ng，低于檢測(cè)限0.125 ng，YSTR 基因座檢出數(shù)為27 個(gè)（共30 個(gè)），其中第1 次5 個(gè)Y-STR 基因座未讀出，分別為DYS533、DYF387S1a/b、DYS481及DYS518；第2次，基因座DYS533丟失；第3次，DYS533、DYF387S1a/b3 個(gè)基因座丟失。當(dāng)V9948∶V9947A為1∶19 時(shí)，存在多個(gè)Y-STR 位點(diǎn)的丟失情況，基因座檢出數(shù)為19 個(gè)（共30 個(gè)）。

表2 不同比例的混合樣本中Y-STR 峰型檢出數(shù)Tab.2 Y-STR peak number in the mixed samples with different concentrations

2.3 種屬特異性

在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物（黑猩猩）的DNA 分型圖譜中，觀察到一些在100～400 bp的小峰，這些小峰可通過(guò)ladder校準(zhǔn)后off-ladder 讀數(shù)與人類(lèi)基因組DNA 圖譜區(qū)分開(kāi)來(lái)。其他常見(jiàn)動(dòng)物和微生物菌落在10 ng DNA 作為起始樣本擴(kuò)增下均未出現(xiàn)有效峰型結(jié)果。

2.4 不同直接擴(kuò)增檢材適用性

在210 份無(wú)關(guān)個(gè)體血樣中直接擴(kuò)增時(shí)全部檢測(cè)成功，且圖譜分型完整，均衡性較好，其檢測(cè)成功率100%（圖2）。

圖2 血樣檢測(cè)結(jié)果圖譜舉例Fig.2 Example of the blood sample typing result map

從210 例血卡中，選擇同一個(gè)體不同類(lèi)型的血卡［血樣采集卡（加強(qiáng)型）、血樣采集卡（經(jīng)典型）、血樣采集卡（迷你型）、Whatman FTA 標(biāo)準(zhǔn)卡、903 卡、DNA 血樣采集卡、普通濾紙型血卡］保存，檢測(cè)結(jié)果顯示，在不同類(lèi)型的血卡載體中分型結(jié)果均一致。

2.5 案件生物檢材適用性

69 份不同類(lèi)型案件檢材用磁珠法提取檢測(cè)，STR分型圖譜清晰完整，與Goldeneye?DNA 身份鑒定系統(tǒng)20A 和YfilerTMPlus PCR 擴(kuò)增試劑盒中相對(duì)應(yīng)基因座的DNA 分型結(jié)果完全一致。

2.6 試劑盒抗抑制劑能力測(cè)試

試劑盒抗抑制劑能力測(cè)試結(jié)果如表3 所示。從表3 中可以看出，在血紅素濃度為20、50 μmol/L，血紅蛋白濃度為50 和80 μmol/L，腐殖酸質(zhì)量濃度為20 ng/μL，靛藍(lán)濃度為4、5、8 和10 mmol/L，Ca2+濃度為0.1、0.2、0.5 和0.7 mmol/L，EDTA 濃度0.5、0.8、1.0 和1.2 mmol/L 時(shí)，均得到100%峰型讀出率。當(dāng)血紅素濃度增加到80 μmol/L時(shí)，DYS635、DYS19、DYS392等11 個(gè)基因座未讀出。血紅蛋白增加到100 μmol/L 時(shí)，DYS19、DYS392、DYS635基因座丟失；當(dāng)濃度進(jìn)一步增加到200 μmol/L 時(shí)，50 個(gè)基因座全部丟失。當(dāng)腐殖酸質(zhì)量濃度增加到50 ng/μL時(shí)，DYS596、DYS635、DYS19、DYS392、DYS533、Y-GATA-H4、DYS390及DYF387S1a/b共9 個(gè)基因座均丟失。Ca2+濃度增加到1.0 mmol/L 以及EDTA濃度增加到1.2 mmol/L 時(shí)，DYS19、DYS392、DYS533位點(diǎn)也均丟失。

表3 添加不同濃度抑制劑下的基因座檢出率Tab.3 Loci detection rate of different concentrations of inhibitors

2.7 試劑盒重復(fù)性測(cè)試

重復(fù)性測(cè)試結(jié)果表明：10 次PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別在3730xl基因分析儀和3500xL 基因分析儀進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)2 臺(tái)儀器上檢測(cè)結(jié)果分型一致，但3730xl基因分析儀檢測(cè)圖譜對(duì)于大于500 bp 的片段，峰型偏寬（圖3～4）。

圖3 采用3500xL 基因分析儀和EX20+30Y 試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品9948 的電泳圖譜Fig.3 Electrophoretogram of standard sample 9948 tested by 3500xL Gene Analyzer and EX20+30Y Kit

圖4 采用3730xl基因分析儀和EX20+30Y 試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品9948 的電泳圖譜Fig.4 Electrophoretogram of standard sample 9948 tested by 3730xl Gene Analyzer and EX20+30Y Kit

3 討論

專(zhuān)利《一種人基因組DNA26 個(gè)基因座的復(fù)合擴(kuò)增的試劑盒》[3]曾經(jīng)公開(kāi)了一種16 個(gè)常染色體STR 基因座聯(lián)合10 個(gè)Y-STR 基因座的同步檢測(cè)方法，但由于其中Y-STR 基因座太少，分辨能力有限，排查能力不足。目前常用的常染色體STR 檢測(cè)試劑盒和Y 染色體STR 檢測(cè)試劑盒，均只能分別對(duì)常染色體STR 和Y 染色體STR 進(jìn)行檢測(cè)。鑒于案件中男性罪犯居多，將常染色體STR 和Y 染色體STR 的基因座納入一個(gè)試劑盒中對(duì)其進(jìn)行同步檢測(cè)，將能極大節(jié)約辦案時(shí)間和經(jīng)費(fèi)，提升辦案效率[6]。

EX20+30Y 試劑盒可聯(lián)合分析常染色體基因座和Y 染色體基因座的STR 位點(diǎn)，一次性獲得19 個(gè)常染色體與30 個(gè)Y 染色體以及性別基因的遺傳信息，是目前國(guó)內(nèi)外采用六色熒光標(biāo)記復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)中，所含基因座數(shù)量最多的常染色體與Y-STR 聯(lián)合檢測(cè)方法[7-10]。本試劑盒還采用直接擴(kuò)增技術(shù)，能有效縮短整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間，提高整體系統(tǒng)效能。此外，對(duì)血痕樣本及各類(lèi)案件檢材均具有很好的適應(yīng)性，靈敏度達(dá)到0.125 ng。在種屬特異性方面，不同來(lái)源的人體生物檢材，包括血斑、唾液斑、精斑等，均可獲得可信的基因分型圖譜；對(duì)非人體DNA，包括狗、豬、牛、羊、貓、雞及大腸桿菌DNA，在分型范圍內(nèi)均不出現(xiàn)特異的DNA 分型，表明該檢測(cè)體系種屬特異性高。

綜上所述，本研究建立的EX20+30Y 試劑盒，其穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、靈敏度和樣品適用性以及抗抑制性均達(dá)到了商品化試劑盒的檢測(cè)水平，為法庭科學(xué)實(shí)踐提供了一種更快速和便捷的方法，在刑案?jìng)善埔约坝H權(quán)鑒定方面均具有潛在應(yīng)用價(jià)值。